代玉明，黃 濤，熊 濤

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330031)

益生菌是指達(dá)到一定數(shù)量能夠?qū)C(jī)體發(fā)揮益生作用的活體微生物，其中乳酸菌因具有優(yōu)良的益生性能而在食品等諸多行業(yè)被廣泛使用和研究[1]，但常見(jiàn)的乳酸菌如雙歧桿菌、乳酸乳球菌等抗逆性差，在生產(chǎn)、運(yùn)輸和使用過(guò)程中容易出現(xiàn)效用下降的問(wèn)題，所以益生性能優(yōu)良且抗逆性強(qiáng)的乳酸菌菌種篩選是食品等行業(yè)需要長(zhǎng)期關(guān)注和研究的課題。

近年來(lái),“產(chǎn)芽孢的乳酸菌”——凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)憑借較高的抗逆性受到市場(chǎng)的青睞，且于2016年被衛(wèi)健委列入《可用于食品的菌種名單》。凝結(jié)芽孢桿菌是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，端生或中生芽孢，能夠利用葡萄糖、甘露醇等多種糖類生成乳酸，且產(chǎn)芽孢的特點(diǎn)賦予凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)惡劣環(huán)境極強(qiáng)的抗逆性，如高溫、強(qiáng)酸、高膽鹽等[2]；凝結(jié)芽孢桿菌主要來(lái)源于動(dòng)物糞便、土壤和傳統(tǒng)發(fā)酵食品等。凝結(jié)芽孢桿菌不僅有傳統(tǒng)乳酸菌調(diào)節(jié)腸道菌群、提高免疫力、抗氧化和降低膽固醇的能力[3-4]，而且具有儲(chǔ)存運(yùn)輸穩(wěn)定、不易染菌、易于培養(yǎng)等特點(diǎn)。目前，凝結(jié)芽孢桿菌制劑在食品工業(yè)、醫(yī)療、養(yǎng)殖業(yè)等行業(yè)普遍應(yīng)用[5]。

篩選性能優(yōu)良的凝結(jié)芽孢桿菌是其保證其產(chǎn)品質(zhì)量的前提之一，所以對(duì)菌種的評(píng)價(jià)尤為重要。日前多數(shù)研究凝結(jié)芽孢桿菌的評(píng)價(jià)是多樣化的，主要包括凝結(jié)芽孢桿菌生產(chǎn)和使用過(guò)程中對(duì)各種環(huán)境的耐受能力、特殊代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)和代謝能力及其發(fā)酵產(chǎn)品對(duì)宿主腸道菌群的影響等[6]，對(duì)于凝結(jié)芽孢桿菌自身的膽固醇降解活性及抗氧化性方面研究較少。有研究表明,益生菌對(duì)膽固醇有一定的降解能力[7]，也可作為生物抗氧化劑，通過(guò)調(diào)節(jié)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)改變磷酸甘油激酶等多種酶類的表達(dá)水平以增強(qiáng)抗氧化活性[8-9]。由于益生菌的評(píng)價(jià)指標(biāo)較復(fù)雜且有菌株特異性，很難進(jìn)行綜合對(duì)比，而有研究表明主成分分析法可以在損失較少原有信息的基礎(chǔ)上巧妙地規(guī)避重復(fù)性數(shù)據(jù)的影響比較綜合性能的強(qiáng)弱[10-11]。

本研究旨在從蘆花雞糞便中篩選并鑒定出凝結(jié)芽孢桿菌，針對(duì)芽孢桿菌的特性，評(píng)價(jià)其耐熱能力和胃腸道耐受性，通過(guò)主成分分析法綜合比較凝結(jié)芽孢桿菌抗逆性能，再通過(guò)比較菌株的產(chǎn)酸能力、膽固醇降解能力、抗氧化能力及安全性，獲得既安全又具備較強(qiáng)益生性能的凝結(jié)芽孢桿菌，豐富現(xiàn)有菌種資源，為凝結(jié)芽孢桿菌在產(chǎn)業(yè)化的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品

蘆花雞糞便：取樣自江西省南昌市郊花鳥市場(chǎng)。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS培養(yǎng)基：細(xì)菌學(xué)蛋白胨10 g，牛肉膏5.2 g，酵母粉4 g，葡萄糖20 g，檸檬酸三胺2 g，吐溫801 mL，磷酸氫二鉀0.116 g，硫酸鎂0.01 g，一水合硫酸錳0.004 g，無(wú)水乙酸鈉0.3 g，蒸餾水1 L。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 L。

模擬胃液：PBS緩沖液，胃蛋白酶3.0 g·L-1，稀鹽酸調(diào)節(jié)pH為2.0～3.0。

模擬腸液：PBS緩沖液(pH調(diào)至8.0)，胰蛋白酶1.0 g·L-1，牛膽鹽為0.1%～0.5%。

標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照菌株：凝結(jié)芽孢桿菌ATCC? 7050TM:上海寶錄生物科技有限公司。

試劑盒：羥自由基測(cè)定試劑盒、DPPH自由基測(cè)定試劑盒、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(FRAP法)：南京建成生物工程研究所；細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒：生工生物(上海)股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 凝結(jié)芽孢桿菌篩選

將樣品稀釋液經(jīng)80 ℃水浴處理15 min，冰浴至常溫，稀釋涂布于含0.4%溴甲酚紫的MRS培養(yǎng)基，40 ℃孵育48 h，根據(jù)菌落形態(tài)及變色圈挑取單菌落進(jìn)行分離純化。觀察菌落的大小、邊緣形狀、顏色、平滑度等特點(diǎn)，并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢觀察。

1.3.2 菌株鑒定

1.3.2.1 生理生化鑒定

參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表1。

表1 生理生化實(shí)驗(yàn)Table.1 Physiological and biochemical experiment

1.3.2.2 分子生物學(xué)鑒定

按照細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒說(shuō)明書提取DNA。選取上游引物為27 F，下游引物為1492R；并設(shè)置PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，72 ℃ 10 min，4 ℃保存，對(duì)目的片段16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增及對(duì)目的片段進(jìn)行電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序及比對(duì)分析。

1.3.3 種子液及待測(cè)樣品制備

將已鑒定的22株凝結(jié)芽孢桿菌及標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照菌株ATCC7050的單菌落接至MRS培養(yǎng)基中，40 ℃培養(yǎng)24 h，按4%的接種量在MRS培養(yǎng)基中活化兩代，通過(guò)MRS培養(yǎng)基稀釋后使得其菌濃為1×108CFU·mL-1，并將其作為種子液。按4%的接種量將種子液接種于LB培養(yǎng)基中40℃孵育48h，此時(shí)菌株處于穩(wěn)定期，離心沉淀后通過(guò)生理鹽水等體積重懸，稀釋使其最終活菌數(shù)為1×108CFU·mL-1，并將其作為待測(cè)樣品。

1.3.4 凝結(jié)芽孢桿菌抗逆性

1.3.4.1 凝結(jié)芽孢桿菌耐熱性能及模擬胃腸液耐受性

待測(cè)樣品在70 ℃，80 ℃和90 ℃水浴中處理5，10，15 min，以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7050處理組作為對(duì)照，探究凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)高溫的耐受性。

待測(cè)樣品在pH2.0，2.5和3.0的模擬胃液下37 ℃處理3 h，以及在膽鹽濃度為0.1%，0.3%，0.5%的模擬腸液中37 ℃處理4 h，以標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7050處理組作為對(duì)照，探究凝結(jié)芽孢桿菌在模擬胃腸液中的耐受性。

樣品處理后進(jìn)行稀釋涂布計(jì)算活菌數(shù)，存活率計(jì)算如下：

Nn：樣品處理后的活菌數(shù)，CFU·mL-1；No：樣品處理前的活菌數(shù)，CFU·mL-1

1.3.4.2 主成分分析

將凝結(jié)芽孢桿菌抗逆性數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，通過(guò)KOM和巴特利特球形度檢驗(yàn)判斷主成分分析的可行性。根據(jù)總方差解釋得到主成分見(jiàn)表2，經(jīng)IBM SPSS Statistics23處理得到主成分的線性組合，按主成分的得分方差所占比例得到總得分，通過(guò)總得分比較凝結(jié)芽孢桿菌的綜合耐受性。

1.3.5 產(chǎn)乳酸性能

采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定產(chǎn)乳酸性能(1260，Agilent，USA)。按4%的接種量將種子液接種于MRS培養(yǎng)基，40 ℃孵育24 h，菌懸液10 000×g離心10 min取上清，同時(shí)梯度稀釋乳酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將上清液及標(biāo)準(zhǔn)品通過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾上機(jī)測(cè)定，根據(jù)乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中乳酸含量。

1.3.6 膽固醇降解活性

按4%的接種量將種子液接種于含50 μg·mL-1膽固醇(溶劑為乙醇)的MRS液體培養(yǎng)基中，40 ℃孵育24 h，按照鄰苯二甲醛法[12]計(jì)算膽固醇去除率，公式如下：

Co：孵育前膽固醇含量，μg；Cn：孵育后膽固醇含量，μg

1.3.7 抗氧化性能

按4%的接種量將種子液接種于MRS培養(yǎng)基，40 ℃孵育24 h得到待測(cè)菌液，此時(shí)待測(cè)菌液處于穩(wěn)定期。羥自由基清除性能、DPPH自由基清除性能和總抗氧化活性按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3.8 安全性評(píng)價(jià)

將種子液接種于哥倫比亞血瓊脂平板確定菌株溶血性，以金黃色葡萄球菌CMCC26003作為對(duì)照。將種子液涂布于MRS平板并放置藥敏紙片，在40 ℃下培養(yǎng)24 h后，測(cè)量其抑菌直徑評(píng)價(jià)藥物敏感性，10種常用藥敏紙片種類見(jiàn)表4。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種鑒定結(jié)果

從雞糞便中分離鑒定得到22株凝結(jié)芽孢桿菌，菌落表面略顯粗糙，呈顆粒狀，有光澤且不透明，邊緣較規(guī)則，中心凸起，菌落較大，符合凝結(jié)芽孢桿菌的形態(tài)特征。所得菌株的革蘭氏染色如圖1～3所示，生理生化鑒定結(jié)果如表1所示，符合凝結(jié)芽孢桿菌的生理生化特征。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定可知初篩得到的22株菌可確定為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)，菌株NCUBCG003、NCUBCG004及NCUBCG014的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示，其分子生物學(xué)鑒定結(jié)果見(jiàn)附件1。

圖1 凝結(jié)芽孢桿菌NCUBCG004的菌體形態(tài)(1000×)Fig.1 Morphology of Bacillus coagulans NCUBCG004(1000×)

圖2 凝結(jié)芽孢桿菌NCUBCG014的菌體形態(tài)(1000×)Fig.2 Morphology of Bacillus coagulans NCUBCG014(1000×)

圖3 凝結(jié)芽孢桿菌NCUBCG003的菌體形態(tài)(1000×)Fig.3 Morphology of Bacillus coagulans NCUBCG003(1000×)

圖4 凝結(jié)芽孢桿菌NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Bacillus coagulans NCUBCG003,NCUBCG004 and NCUBCG014

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌抗逆性

2.2.1 耐熱性能

芽孢桿菌菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)通常采用噴霧干燥的方法，噴霧干燥中所產(chǎn)生的70 ℃～90 ℃的高溫要求芽孢桿菌有較高的耐高溫能力，因此耐高溫性能是篩選優(yōu)良芽孢桿菌的重要指標(biāo)之一[13]。

如圖5所示，22株凝結(jié)芽孢桿菌除NCUBCG016外經(jīng)90 ℃處理后存活率均在60.0%以上，部分菌株存活率隨溫度升高而降低。菌株ATCC7050、NCUBCG014、NCUBCG001、NCUBCG002、NCUBCG009、NCUBCG017在不同溫度處理后存活率穩(wěn)定，達(dá)90.0%；特別是NCUBCG003、NCUBCG004、NCUBCG007在90℃處理后存活率高達(dá)95.0%以上。有研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌均具備一定的耐熱性，凝結(jié)芽孢桿菌ATCC8038在pH為4.0的番茄汁中，經(jīng)95 ℃高溫處理20 min后其活菌數(shù)僅降低1 log·CFU·mL-1[14]。在經(jīng)80 ℃處理10 min后凝結(jié)芽孢桿菌的存活率普遍降低，可能是溫度和萌發(fā)培養(yǎng)基不能完全刺激芽孢萌發(fā)；有研究表明經(jīng)70 ℃～80 ℃處理后凝結(jié)芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)體已死亡，且在此溫度下芽孢萌發(fā)率較低，同時(shí)芽孢萌發(fā)需要受體蛋白的作用，不同的營(yíng)養(yǎng)劑對(duì)受體蛋白的促進(jìn)具有特異性[15]。綜合以上分析可知，凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)高溫均有一定的耐受性，尤其是菌株NCUBCG014、NCUBCG003、NCUBCG004、NCUBCG006和NCUBCG007等能夠在工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中保持較高的存活率。

處理組圖5 凝結(jié)芽孢桿菌耐熱性能Fig.5 Heat resistance of Bacillus coagulans

2.2.2 模擬胃腸液耐受性

如圖6所示，經(jīng)pH=2.0的模擬胃液處理后，大部分菌株存活率較低，菌株的存活率隨pH值的升高而升高，經(jīng)pH=3.0的模擬胃液處理后多數(shù)菌株存活率可達(dá)95.0%以上，菌株NCUBCG003、NCUBCG004、NCUBCG007、NCUBCG014經(jīng)pH=2.0胃液處理后存活率仍達(dá)85.0%以上。有研究表明，通常情況下人體胃酸pH約為2.0～3.0，動(dòng)物胃液略高，在食物未消化完全的情況下胃部pH可達(dá)3.0以上[16]。

圖6 凝結(jié)芽孢桿菌模擬胃腸液耐受性Fig.6 Tolerance of Bacillus coagulans to simulated gastrointestinal fluid

所有菌株在不同膽鹽濃度的模擬腸液處理后存活率均在66.20%以上，隨著膽鹽濃度升高，多數(shù)菌株存活率降低；但菌株NUCBCG004和NUCBCG014經(jīng)0.5%的膽鹽處理后存活率高達(dá)99.0%以上，而NCUBCG003和NCUBCG002耐膽鹽能力稍差，其存活率仍可達(dá)90.0%以上。另一方面，菌株NCUBCG012經(jīng)高濃度膽鹽比低濃度膽鹽處理后存活率高，有研究表明高膽鹽中鈉鹽和鉀鹽可能會(huì)促進(jìn)芽孢的生成[17]；NCUBCG023等菌株經(jīng)膽鹽處理后存活率較低，多項(xiàng)研究表明菌株的耐膽鹽能力較弱可能與膽鹽水解酶不足有關(guān)[18]。

標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7050相比于其他凝結(jié)芽孢桿菌在模擬胃腸液環(huán)境下能夠穩(wěn)定地保持較高的活性，存活率約為90%。有報(bào)道對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌MTCC5856等標(biāo)準(zhǔn)株的體外模擬胃腸液耐受性進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)模擬胃腸液等惡劣環(huán)境具備較強(qiáng)的抗逆性，在食品等領(lǐng)域體現(xiàn)出極高的應(yīng)用價(jià)值[19]。綜合分析可知本研究所篩選的大多數(shù)凝結(jié)芽孢桿菌能夠在其他食物存在的情況下，在胃部保持較高的活性，同時(shí)對(duì)膽鹽環(huán)境也有一定的耐受性，而菌株NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014對(duì)胃腸道環(huán)境有極高的耐受性，能夠在胃腸道環(huán)境下維持較高的活性，發(fā)揮其益生作用。

2.2.3 主成分分析結(jié)果

2.2.3.1 適用性檢驗(yàn)與成分提取結(jié)果

經(jīng)計(jì)算KMO取樣適切性量數(shù)為0.681(>0.6)，巴特利特球形度檢驗(yàn)的顯著性為0.000(<0.05)，兩種檢驗(yàn)結(jié)果都說(shuō)明了凝結(jié)芽孢桿菌抗逆性指標(biāo)間存在相關(guān)性，適用于主成分分析法[20-21]。

如表2所示，共提取3種主成分并命名為Z1、Z2、Z3，可解釋總方差的78.03%，即可以通過(guò)3種主成分的綜合得分在權(quán)重為78.03%的基礎(chǔ)上評(píng)價(jià)菌種抗逆性(耐熱能力和胃腸道耐受性)。

表2 各成分總方差解釋Table.2 Interpretation of total variance of each component

2.2.3.2 主成分計(jì)算及得分結(jié)果

由表3可知，菌種NCUBCG004、NCUBCG003、NUCBCG014綜合得分排名前三，而ATCC7050綜合得分在第五位，說(shuō)明相比于標(biāo)準(zhǔn)菌株以及其他凝結(jié)芽孢桿菌，這3株菌在耐熱和胃腸道耐受性的綜合性能上表現(xiàn)最為優(yōu)良，對(duì)惡劣環(huán)境的抗逆性最強(qiáng)。

2.2.3 產(chǎn)乳酸性能

經(jīng)測(cè)定乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.2862x-13.398,R2為0.9999，可用于乳酸含量測(cè)定。

表3 凝結(jié)芽孢桿菌各主成分得分及綜合得分Table.3 Main component scores and comprehensive scores of Bacillus coagulans

由圖7可知，菌株NCUBCG007、NCUBCG008的乳酸產(chǎn)量不足1.0 g·L-1，可能是由于本研究所用MRS培養(yǎng)基影響了糖酵解、糖異生和三羧酸循環(huán)等途徑，與產(chǎn)乳酸相關(guān)的酶促反應(yīng)速度下降，使得乳酸含量較低[22]；其次菌株之間的差異也是造成其乳酸產(chǎn)量不同的原因之一。而菌株NCUBCG012、NCUBCG003、NCUBCG004、NCUBCG014的乳酸產(chǎn)量相比于其他凝結(jié)芽孢桿菌較高，可達(dá)5.0 g·L-1以上，標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7050產(chǎn)乳酸能力最高，達(dá)8.83 g·L-1，有利于在宿主體內(nèi)發(fā)揮抑菌、調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)等作用。

菌種注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖7 凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)乳酸能力Fig.7 Lactic acid content of Bacillus coagulans

2.2.4 膽固醇降解能力

如圖8所示，凝結(jié)芽孢桿菌膽固醇去除率均在25.0%以上，NCUBCG008、NCUBCG006、NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014五株凝結(jié)芽孢桿菌的膽固醇去除率可達(dá)50.0%以上；而標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照菌株ATCC7050的膽固醇去除率僅為35.71%，同時(shí)菌株NCUBCG012、NCUBCG017和NCUBCG023的膽固醇去除率也相對(duì)較低，只有25.0%左右。有體外研究表明，益生菌有一定的降解膽固醇的能力，受菌株差異、生長(zhǎng)階段等因素的影響，膽固醇去除率不盡相同，凝結(jié)芽孢桿菌MTCC5856的膽固醇去除率最高可達(dá)48.42%[23]。由此可見(jiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌NCUBCG008、NCUBCG003、NCUBCG004、NCUBCG014和NCUBCG006的膽固醇降解能力相對(duì)較高。

菌種注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖8 凝結(jié)芽孢桿菌膽固醇去除率Fig.8 Cholesterol degradation rate of Bacillus coagulans

2.2.5 抗氧化活性

2.2.5.1 羥自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

定義：規(guī)定每毫升的菌液在37 ℃下反應(yīng)1min，使反應(yīng)體系中H2O2濃度降低1 mmol·L-1為一個(gè)抑制羥自由基能力單位。

據(jù)圖9可知，凝結(jié)芽孢桿菌的羥自由基清除能力均在50.0 U·mL-1以上，菌株差異不大，以標(biāo)準(zhǔn)株ATCC7050的羥基自由基清除能力最弱，達(dá)52.44 U·mL-1，而菌株NCUBCG002、NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014高達(dá)60.0 U·mL-1以上，羥自由基清除能力最強(qiáng)。

菌種注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖9 凝結(jié)芽孢桿菌羥自由基清除能力Fig.9 Hydroxyl radical scavenging capacity of Bacillus coagulans

2.2.5.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

DPPH自由基的清除能力主要靠菌液中抗氧化劑的供氫能力決定的，不同的菌株對(duì)多肽等抗氧化劑的代謝能力上也有所不同。據(jù)圖10可得,凝結(jié)芽孢桿菌的DPPH自由基清除率在60%以上，其中NCUBCG007和NCUBCG0018則較低，特別是標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7050地DPPH自由基的清除率最低，只有62.64%；有研究表明，凝結(jié)芽孢桿菌具備潛在的抗氧化性能，菌株T242的DPPH自由基清除率僅有35.0%[24]。而菌株NUCBCG003、NCUBCG004、NCUBCG006和NCUBCG014的DPPH自由基清除率最高，可達(dá)75%以上。

菌種注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖10 DPPH自由基清除能力Fig.10 DPPH free radical scavenging capacity of Bacillus coagulans

2.2.5.3 總抗氧化性能測(cè)定結(jié)果

據(jù)圖11中所示，本文所研究的凝結(jié)芽孢桿菌總抗氧化性能均可相當(dāng)于1 mmol·L-1以上的FeSO4溶液，菌株NCUBCG002、NCUBCG08、NCUBCG016和NCUBCG025總抗氧化性能較弱，標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC7050的總抗氧化能力也僅相當(dāng)于2.24 mmol·L-1的FeSO4溶液；而不同的是，菌株NCUBCG001、NCUBCG003、NCUBCG004、NCUBCG014和NCUBCG017的總抗氧化能力相對(duì)較強(qiáng)，尤其是NCUBCG014的總抗氧化能力相當(dāng)于3.5 mmol·L-1的FeSO4溶液。

菌種注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖11 總抗氧化能力(FRAP)Fig.11 Total antioxidant capacity of Bacillus coagulans (FRAP)

2.6 安全性評(píng)價(jià)

如表4所示，標(biāo)準(zhǔn)株ATCC7050、NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014均為γ溶血，而陽(yáng)性對(duì)照株金黃色葡萄球菌CMCC26003表現(xiàn)出β溶血性(出現(xiàn)透明溶血環(huán))，表明這3株凝結(jié)芽孢桿菌均無(wú)溶血活性；且抗生素敏感性測(cè)定結(jié)果可表明凝結(jié)芽孢桿菌NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014對(duì)常見(jiàn)的10種抗生素均敏感，因此可以說(shuō)明這3株凝結(jié)芽孢桿菌為安全菌種[25]。

表4 凝結(jié)芽孢桿菌抗生素敏感性與溶血活性Table.4 Antibiotic sensitivity and hemolytic activity of Bacillus coagulans

3 結(jié)論

本文研究通過(guò)熱脅迫處理從蘆花雞糞便分離鑒定出22株凝結(jié)芽孢桿菌，分析了凝結(jié)芽孢桿菌耐熱性能及胃腸道耐受性，并通過(guò)主成分分析法綜合比較凝結(jié)芽孢桿菌抗逆性，同時(shí)評(píng)價(jià)22株凝結(jié)芽孢桿菌的產(chǎn)乳酸能力、膽固醇降解能力以及抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明菌株NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014在抗逆性及乳酸菌常見(jiàn)益生性能上均優(yōu)于其他凝結(jié)芽孢桿菌，且體外安全性評(píng)價(jià)表明NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014為安全菌種。綜合以上分析可知，凝結(jié)芽孢桿菌NCUBCG003、NCUBCG004和NCUBCG014在所評(píng)價(jià)的各項(xiàng)基礎(chǔ)益生性能上表現(xiàn)為潛在優(yōu)良的菌株，具備在人和動(dòng)物體內(nèi)發(fā)揮益生作用的潛能，能夠豐富微生物優(yōu)良菌種資源，為凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用和發(fā)展提供動(dòng)力，同時(shí)本文評(píng)價(jià)方法可為益生菌性能評(píng)價(jià)提供參考。