賈新轉(zhuǎn)，王聰敏，劉二緩，張娜，魏蘭

人體內(nèi)的維生素D 主要循環(huán)形式是25-羥基維生素D［25-（OH）D］，活性形式為1，25二羥維生素D［1，25（OH）2D］。1，25（OH）2D與細(xì)胞內(nèi)維生素D受體結(jié)合，其復(fù)合物穿過(guò)細(xì)胞核，作為轉(zhuǎn)錄因子與特定基因結(jié)合發(fā)揮作用。人類性腺組織和生殖器官中存在維生素D受體。人類維生素D結(jié)合蛋白具有遺傳多態(tài)性［1］，不同種族間維生素D 結(jié)合蛋白的表型不同［2］。敲除維生素D受體的小鼠不能產(chǎn)生成熟卵母細(xì)胞，表明維生素D 對(duì)小鼠卵泡發(fā)育至關(guān)重要［3］。然而，維生素D在卵泡發(fā)育過(guò)程中的作用尚不清楚。體外受精（in vitro fertilization，IVF）可觀察卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞受精、胚胎發(fā)育、著床以及最終的臨床結(jié)局，為研究卵泡內(nèi)維生素D 水平與卵母細(xì)胞發(fā)育的關(guān)系提供了獨(dú)特的條件。近年來(lái)有學(xué)者報(bào)道，卵泡液25-（OH）D 水平可影響IVF 的臨床結(jié)局，如植入率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率，但研究結(jié)論各不相同，推測(cè)可能與研究人群的種族不同有關(guān)［4-5］。目前IVF臨床妊娠率為50%左右［6］，影響IVF 妊娠結(jié)局的因素主要為胚胎質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性。本研究旨在探討繼發(fā)性不孕且需行IVF 治療的女性卵泡液25-（OH）D水平與卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟、胚胎質(zhì)量及臨床結(jié)局是否相關(guān)，為提高IVF 臨床妊娠率提供新思路。′

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2019 年6 月—9 月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生殖中心初次就診且需進(jìn)行IVF的192例繼發(fā)性不孕患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：既往有妊娠史，而后無(wú)避孕連續(xù)12 個(gè)月未孕且需行IVF 治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）男方因素所致繼發(fā)性不孕。（2）男方或女方有吸煙、酗酒史。（3）高血壓、糖尿病、自身免疫性疾病、甲狀腺功能異常、惡性腫瘤。（4）重要臟器（如心、腦、肺、肝、腎等）疾患。（5）入組前3個(gè)月內(nèi)補(bǔ)充維生素D 及芳香化酶抑制劑。入組患者年齡24～32歲，平均（27.99±2.85）歲。根據(jù)繼發(fā)性不孕原因分為4組：輸卵管因素組（慢性輸卵管炎癥、輸卵管阻塞）58例、子宮內(nèi)膜異位癥組［依據(jù)2013 年歐洲人類生殖及胚胎學(xué)會(huì)（ESHRE）共識(shí)［7］診斷］45 例、多囊卵巢綜合征（PCOS）組（依據(jù)2004 年鹿特丹標(biāo)準(zhǔn)［8］診斷）47 例、卵巢儲(chǔ)備不足組（依據(jù)2011 年Bologna標(biāo)準(zhǔn)診斷［9］）42例。根據(jù)卵泡液25-（OH）D水平聚類分析分為2組，A組121例，B組71例。本研究通過(guò)我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，征得研究對(duì)象同意，并簽署知情同意書(shū)。

1.2 藥物與儀器 重組人促卵泡刺激素注射液（商品名果納芬，默克雪蘭諾有限公司，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)S20160040，規(guī)格：450 IU）、醋酸加尼瑞克注射液［商品名晴樂(lè)，正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20183025，規(guī)格：0.5 mL：0.25 mg（以加尼瑞克計(jì)）］、重組人絨毛膜促性腺激素（HCG）（商品名艾澤，默克雪蘭諾有限公司，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)S20130091，規(guī)格：250 μg）；21 G 單腔取卵針（庫(kù)克澳大利亞有限公司，國(guó)械注進(jìn)20192181581，型號(hào)K-OPS-6035-RWHET）；25-（OH）D試劑盒（英國(guó)IDS公司）；JC028酶標(biāo)儀（瑞士澳斯邦公司）。

1.3 卵巢刺激方案 卵巢刺激開(kāi)始于月經(jīng)周期第2天或第3天。根據(jù)患者體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)、基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平、抗苗勒管激素（AMH）給予皮下注射重組人促卵泡刺激素注射液（藥物劑量150～225 IU/d）治療，當(dāng)?shù)? 個(gè)卵泡直徑達(dá)到12 mm 或雌二醇達(dá)到200 ng/L 時(shí)，開(kāi)始給予皮下注射醋酸加尼瑞克注射液0.25 mg/d抑制垂體分泌促黃體生成素，當(dāng)至少1 個(gè)卵泡直徑達(dá)到18 mm 或2 個(gè)卵泡最大直徑達(dá)到16 mm時(shí)，給予皮下注射HCG 250 μg。

1.4 卵泡液的收集 皮下注射HCG 36 h 后，陰道超聲引導(dǎo)下，將21 G 單腔取卵針連接到-110 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）封閉真空系統(tǒng)，選擇最大直徑≥16 mm的卵泡進(jìn)行取卵，將卵泡液放入無(wú)菌容器中，立即檢查卵泡液中是否存在卵母細(xì)胞，當(dāng)存在卵母細(xì)胞時(shí)，將卵母細(xì)胞置于培養(yǎng)皿中，將卵泡液（除外沖洗液和血液污染）3 000 r/min 離心10 min，取上清液置于到-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.5 實(shí)驗(yàn)室檢查 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法，按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)卵泡液25-（OH）D 水平。抽取研究對(duì)象清晨空腹靜脈血2 mL，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定外周血激素水平，包括雌二醇、孕酮、黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）。

1.6 卵泡數(shù)及卵泡直徑的測(cè)量 由我科同一主治醫(yī)師行陰道彩超測(cè)量卵泡數(shù)及卵泡直徑。

1.7 胚胎評(píng)估 依照2011 年Istanbul 共識(shí)［10］中所述胚胎發(fā)育標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估。培養(yǎng)第3天（D3）的優(yōu)質(zhì)胚胎即有8個(gè)對(duì)稱的、非碎片的卵裂球。在培養(yǎng)的第5天（D5），在胚泡期考慮3個(gè)指標(biāo)：內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的發(fā)育、滋養(yǎng)外胚層的出現(xiàn)和囊胚腔的擴(kuò)張。D5優(yōu)質(zhì)囊胚是指擴(kuò)張囊胚，囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變薄（4級(jí)）及正在孵出的囊胚，囊胚的一部分從透明帶中逸出（5 級(jí)），具有高質(zhì)量的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（A 級(jí)：細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密）和滋養(yǎng)外胚層（A 級(jí)：上皮細(xì)胞層由較多的細(xì)胞組成，結(jié)構(gòu)致密）。

1.8 各指標(biāo)計(jì)算 IVF正常受精率=D1出現(xiàn)2原核（PN）及2極體（PB）卵子數(shù)/IVF 加精卵子總數(shù)×100%；D3 優(yōu)質(zhì)胚胎形成率=D3 優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵子數(shù)×100%；D5 優(yōu)質(zhì)囊胚形成率=D5 優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)/正常受精卵子數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠（胚胎移植后35 d行B超檢查可見(jiàn)子宮內(nèi)孕囊）周期數(shù)/胚胎移植總周期數(shù)×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示。應(yīng)用K-均值聚類分析識(shí)別卵泡液25-（OH）D不同水平群體。2組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間的比較采用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料以例或例（%）表示，2組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同繼發(fā)性不孕病因組一般資料及卵泡液25-（OH）D 的比較 4 組患者年齡、BMI、雌二醇、孕酮、LH、FSH及卵泡液25-（OH）D水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.2 K-均值聚類分析2 組一般資料以及卵泡液25-（OH）D 的比較 根據(jù)卵泡液25-（OH）D 水平進(jìn)行K-均值聚類分析，B 組卵泡液25-（OH）D 水平顯著高于A 組（P＜0.01）；B 組HCG 日（皮下注射HCG當(dāng)日）大卵泡數(shù)及雌二醇、孕酮水平較A組顯著升高（P＜0.01）；2 組患者年齡、BMI、促性腺激素（Gn）治療量、HCG 日卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、LH、FSH，啟動(dòng)日（卵泡刺激第1天）雌二醇、孕酮、LH及FSH水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

2.3 2 組胚胎評(píng)估及臨床結(jié)局的比較 B 組IVF 正常受精率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎形成率、D5優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、臨床妊娠率均顯著高于A組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

Tab.1 Comparison of general information and 25-(OH)D levels in follicular fluid between four groups of patients表1 不同病因組一般資料及卵泡液25-（OH）D水平的比較

Tab.2 Comparison of general information and 25-(OH)D levels in follicular fluid between two groups表2 2組研究對(duì)象一般資料及卵泡液25-（OH）D水平的比較

Tab.3 Comparison of embryo evaluation and clinical outcomes between two groups表3 2組研究對(duì)象胚胎評(píng)估及臨床結(jié)局的比較

3 討論

目前認(rèn)為維生素D缺乏是一個(gè)全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題［11］。人類80%～90%的維生素D 來(lái)源于日光照射皮膚合成，其余通過(guò)飲食獲得。25-（OH）D經(jīng)1α-羥化酶轉(zhuǎn)化為活性形式1，25（OH）2D。1α-羥化酶及維生素D受體存在于卵巢、子宮、胚胎、睪丸、前列腺等組織中，因此可在生殖器官局部形成維生素D的活化形式并發(fā)揮作用。女性類固醇激素主要產(chǎn)生于卵巢顆粒細(xì)胞中，維生素D 通過(guò)其受體可以調(diào)節(jié)卵巢類固醇激素生成［12］。有研究證實(shí)維生素D有利于月經(jīng)周期恢復(fù)和子宮內(nèi)膜增殖［13-14］，促進(jìn)卵泡發(fā)育［15］。

女性不孕病因包括盆腔因素如慢性輸卵管炎癥、輸卵管積水或阻塞、輸卵管異常、子宮內(nèi)膜異位癥、生殖器腫瘤、生殖道發(fā)育異常等，以及排卵障礙如PCOS、卵巢功能減退和早衰、持續(xù)性無(wú)排卵等。本研究入組患者病因包括：輸卵管因素、PCOS、子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢儲(chǔ)備不足。多數(shù)學(xué)者僅對(duì)單一病因女性不孕癥患者血清/卵泡液25-（OH）D 進(jìn)行相關(guān)性研究，如輸卵管因素［6］、PCOS［16］、子宮內(nèi)膜異位癥［17］、卵巢儲(chǔ)備不足［18］患者與健康對(duì)照女性相比，血清25-（OH）D水平均較低。而關(guān)于女性不孕癥不同病因組別之間血清/卵泡液25-（OH）D 比較的研究尚少見(jiàn)。本課題組在前期研究中證實(shí)卵泡液25-（OH）D水平與血清25-（OH）D水平高度相關(guān)，可反映體內(nèi)25-（OH）D儲(chǔ)存狀態(tài)［19］。本研究已排除可能影響25-（OH）D水平的潛在混雜因素（如糖尿病、高血壓、吸煙）［20］，結(jié)果顯示在不同繼發(fā)性不孕原因分組中，卵泡液25-（OH）D水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此在分析繼發(fā)性不孕患者卵泡液25-（OH）D水平時(shí)，暫不考慮病因因素。本研究樣本量較小，可擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)卵泡液維生素D正常水平的標(biāo)準(zhǔn)。本研究根據(jù)卵泡液25-（OH）D水平進(jìn)行聚類分析，將研究對(duì)象分為卵泡液25-（OH）D 低水平和高水平2 組，2 組卵泡液25-（OH）D 水平有顯著差異。2組患者年齡、BMI、Gn治療量、HCG日卵泡數(shù)、獲卵數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在HCG日，B組較A組外周血雌二醇、孕酮水平更高且有更多的大卵泡，提示在卵泡液25-（OH）D高水平組卵巢對(duì)藥物刺激的反應(yīng)較好。Kyrou 等［21］報(bào)道，在HCG 日大量的大卵泡與較高水平的雌二醇、孕酮相關(guān)。恒河猴動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明卵泡液中1，25（OH）2D3以劑量和階段依賴的方式影響卵泡的存活和生長(zhǎng)以及卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，低劑量組1，25（OH）2D3促進(jìn)竇前卵泡存活，高劑量組卵泡直徑增大［22］，與本研究的結(jié)果相似。在人類顆粒細(xì)胞模型中，卵泡液中25（OH）D不足（＜75 nmol/L）的小卵泡（＜14 mm）與卵泡液中25（OH）D 水平≥75 nmol/L 的小卵泡相比，前者AMH 受體-ⅡmRNA 水平是后者2 倍［23］。而AMH 可降低卵泡對(duì)FSH 的敏感性及卵巢顆粒細(xì)胞芳香化酶的活性，阻礙卵泡發(fā)育［24］。推測(cè)維生素D通過(guò)可抑制AMH受體-Ⅱ的表達(dá)，降低AMH 對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的作用，從而促進(jìn)卵泡成熟［25］。

本研究結(jié)果顯示，B組IVF正常受精率、D3優(yōu)質(zhì)胚胎形成率、D5優(yōu)質(zhì)囊胚形成率、臨床妊娠率高于A組，提示卵泡液25-（OH）D 可能有助于行IVF 治療的繼發(fā)性不孕女性卵母細(xì)胞成功受精、胚胎發(fā)育及臨床妊娠，可能與以下機(jī)制有關(guān)：（1）維生素D 通過(guò)AMH調(diào)節(jié)卵泡/卵母細(xì)胞成熟。人AMH基因啟動(dòng)子區(qū)域存在功能性維生素D反應(yīng)元件（VDRE），維生素D可直接影響AMH的表達(dá)［11］。AMH結(jié)合AMHR-Ⅱ受體，通過(guò)Smad1/5/8 信號(hào)通路調(diào)節(jié)卵泡/卵母細(xì)胞成熟［26］。（2）維生素D通過(guò)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性而影響臨床妊娠率［27］。維生素D可與子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中同源異型盒蛋白（homeobox protein A10，HOXA10）的受體結(jié)合，上調(diào)HOXA10 基因表達(dá)。在胚胎植入期HOXA10基因高表達(dá)是子宮內(nèi)膜容受性良好的關(guān)鍵標(biāo)志，同時(shí)HOXA10 是胚胎植入的必需基因，對(duì)女性生育力和胚胎著床至關(guān)重要。（3）維生素D 可通過(guò)參與免疫調(diào)節(jié)功能影響胚胎著床及早孕［28］。維生素D 通過(guò)抑制Th1 細(xì)胞增殖和促進(jìn)Th2細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)輔助性T淋巴細(xì)胞群［29］，Th1細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素（IL）-2 和腫瘤壞死因子-α 等細(xì)胞因子促進(jìn)細(xì)胞免疫，Th2 細(xì)胞可分泌IL-6、IL-10 等細(xì)胞因子促進(jìn)體液免疫，在正常妊娠母體中，細(xì)胞免疫受抑制，體液免疫增強(qiáng)，Th2細(xì)胞處于優(yōu)勢(shì)地位有利于母體免疫耐受［30-31］。

由于本研究是單中心研究，且樣本量較?。患又壳盁o(wú)卵泡液25-（OH）D 正常值標(biāo)準(zhǔn)，本研究分組標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)納入數(shù)據(jù)界定，因此也僅適合本研究。

綜上所述，不同病因的繼發(fā)性不孕女性卵泡液25-（OH）D水平無(wú)顯著差異；在繼發(fā)性不孕行IVF治療的女性中，卵泡液25-（OH）D 高水平更易產(chǎn)生大卵泡及優(yōu)質(zhì)胚胎，其臨床妊娠率也更高。