共轉(zhuǎn)染
- 長(zhǎng)鏈非編碼RNA PCAT19對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖與侵襲的影響及其作用機(jī)制
PCAT19（共轉(zhuǎn)染組），并分成si-PCAT19組、si-NC組及共轉(zhuǎn)染組，待各組細(xì)胞系培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.3 RNA提取和qRT-PCR使用TRIzol 試劑從細(xì)胞系中提取總RNA。用逆轉(zhuǎn)錄酶將分離的RNA轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA）。使用 SYBR Green實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增成cDNA產(chǎn)物。使用 SYBR Green RT-PCR檢測(cè)PCAT19及miR-195-5p的表達(dá)。PCAT19的表達(dá)以GAPDH為內(nèi)參，標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH的對(duì)
中國(guó)普通外科雜志 2023年9期2023-11-02
- lncRNA SNHG1靶向miR-145-5p/PDCD4軸對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響
5pmimic共轉(zhuǎn)染于H9c2細(xì)胞，48 h后觀察熒光素酶活性變化。分別構(gòu)建PDCD4野生型質(zhì)粒 （PDCD4-WT） 和突變型質(zhì)粒 （PDCD4-MUT），將PDCD4-WT和PDCD4-MUT分別與mimic NC或miR-145-5pmimic共轉(zhuǎn)染于H9c2細(xì)胞，48 h后觀察熒光素酶活性變化。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以x-±s表示，多組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步2組數(shù)據(jù)的比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<
- LncRNA NORAD通過(guò)miR-199a-3p調(diào)控ZNF217對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、凋亡及化療敏感性的影響
or NC組（共轉(zhuǎn)染si-NORAD和inhibitor NC）、si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor組（共轉(zhuǎn)染si-NORAD和miR-199a-3p inhibitor），各組加入2 μg/mL的DDP處理24 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.6 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將各組H460/DDP細(xì)胞接種于96孔板中，按照1.5中分組處理，培養(yǎng)48 h，每孔各加入10 μL CCK-8溶液，37oC孵育30 min，酶標(biāo)儀測(cè)量各孔的吸光度（
中國(guó)肺癌雜志 2023年7期2023-09-04
- lncRNA HCG18靶向miR-34b-5p/FOXP1軸促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的機(jī)制研究
b-5p組)、共轉(zhuǎn)染si-HCG18與anti-miR-NC(si-HCG18+anti-miR-NC組)、si-HCG18與anti-miR-34b-5p(si-HCG18+anti-miR-34b-5p組)、miR-34b-5p mimics與pcDNA(miR-34b-5p+pcDNA組)、miR-34b-5p mimics與pcDNA-FOXP1(miR-34b-5p+pcDNA-FOXP1組)。轉(zhuǎn)染12 h后,更換為含10% FBS的RPMI 1
蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) 2023年6期2023-08-02
- LncRNA XIST調(diào)節(jié)miR-545-3p/SMAD5軸對(duì)人成骨細(xì)胞增殖、遷移及成骨分化的影響
和miR-NC共轉(zhuǎn)染)、pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic組(pcDNA3.1-XIST和 miR-545-3p mimic共轉(zhuǎn)染)。對(duì)hOB細(xì)胞先進(jìn)行上述轉(zhuǎn)染24 h,再在分化培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7 d,然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.5 qRT-PCR檢測(cè)XIST、miR-545-3p表達(dá) 使用Trizol試劑提取細(xì)胞中的總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。分別以GAPDH、U6為內(nèi)參,使用2-
河北醫(yī)藥 2023年4期2023-04-08
- LINC00342調(diào)控miR-384對(duì)肺鱗癌細(xì)胞增殖侵襲遷移的影響研究
itor-NC共轉(zhuǎn)染)、si-LINC00342+ miR-384 inhibitor組(si-LINC00342和 miR-384 inhibitor共轉(zhuǎn)染)。轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000 Transfection Reagent操作步驟進(jìn)行。1.3.3RT-qPCR法檢測(cè)LINC00342、miR-384表達(dá)：使用Trizol提取各組細(xì)胞中的總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板上RT-qPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。LINC
河北醫(yī)學(xué) 2023年2期2023-03-13
- circ-BRWD1靶向調(diào)控作用miR-132-3p介導(dǎo)FOXO1成骨
-132-3p共轉(zhuǎn)染入BMSCs后檢測(cè)FOXO1的表達(dá)水平：RT-qPCR分析檢測(cè)control、agomiR-NC、agomiR-132-3p、agomiR-132-3p+pcDNA3.1、agomiR-132-3p+pc-circ-BRWD1轉(zhuǎn)染的BMSCs細(xì)胞中FOXO1的相對(duì)表達(dá)。將pc-circ-BRWD1與agomiR-132-3p或sh-FOXO1共轉(zhuǎn)染BMSCs后檢測(cè)特異性成骨分化相關(guān)因子Runx2的表達(dá)水平：RT-qPCR檢測(cè)在contr
醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐 2023年2期2023-02-04
- 長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)母系表達(dá)基因3(MEG3)對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響△
gomir組、共轉(zhuǎn)染組、共轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組，每組分配12只大鼠，再取12只大鼠按照10 mL·kg-1劑量自腹腔注入0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液，作為對(duì)照組。1.2.2 大鼠分組給藥及視網(wǎng)膜血管通透性檢測(cè)參照文獻(xiàn)[11] 給予大鼠藥物：LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)組大鼠玻璃體內(nèi)注射LncRNA MEG3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(濃度參照說(shuō)明書(shū)設(shè)定)；miR-145-5p agomir組大鼠玻璃體內(nèi)注射miR-145-5p agomir(濃度參照說(shuō)明書(shū)設(shè)定)；共轉(zhuǎn)染組
眼科新進(jìn)展 2023年1期2023-02-01
- 缺氧誘導(dǎo)因子-1α、Notch1和Jagged1共轉(zhuǎn)染對(duì)急性心肌梗死模型大鼠心功能的改善作用
鼠分為模型組、共轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組，每組10只。①模型組：通過(guò)腹腔注射40 mg/kg 1%戊巴比妥鈉對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。氣管插管后，所有大鼠使用小動(dòng)物呼吸機(jī)接受正壓有氧通氣，并在左側(cè)第4肋間打開(kāi)胸部，切開(kāi)心包后將心臟外化。使用6-0絲線縫合冠狀動(dòng)脈左前降支，距主動(dòng)脈根部約3～5 mm。通過(guò)梗死區(qū)域的局部發(fā)紺驗(yàn)證AMI模型的制備成功。②共轉(zhuǎn)染組：在冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎過(guò)程中將HIF-1α、Notch1、Jagged1共轉(zhuǎn)染慢病毒注射到大鼠心臟的胸前組織中，即在梗死
陜西醫(yī)學(xué)雜志 2022年11期2022-11-11
- lncRNA FOXD2-AS1對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制研究
位點(diǎn)（表3）。共轉(zhuǎn)染 WT-lncRNA FOXD2-AS1+miR-331-3p mimics的細(xì)胞熒光素酶活性較共轉(zhuǎn)染WT-lncRNA FOXD2-AS1+miR-NC的 細(xì) 胞 低（0.46±0.03 vs 1.00±0.08，t=18.961，P＜0.05），而共轉(zhuǎn)染 MUT-lncRNA FOXD2-AS1+miR-331-3p mimics的細(xì)胞熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染MUT-lncRNA FOXD2-AS1+miR-NC的細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（
現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué) 2022年8期2022-10-10
- 動(dòng)脈炎病毒PRRSV和EAV的Nsp4蛋白對(duì)mTANK蛋白的降解
NK-HA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后收取細(xì)胞裂解液，于4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清加入1 μg小鼠IgG和20 μL Protein A+G，于4 ℃緩慢搖晃4 h，去除非特異性吸附.于4 ℃、1 000×g離心5 min，取上清加入1 μg Flag單抗，于4 ℃緩慢搖晃12 h，加入40 μL蛋白A+G繼續(xù)搖晃4 h，于4 ℃、1 000×g離心5 min，棄上清，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，最后用100 μL PBS
- 非洲豬瘟病毒MGF360-14L靶向MAVS抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生
MAVS或空載共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)，具體操作步驟參見(jiàn)雙熒光素酶說(shuō)明書(shū)(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司)。1.2.3 免疫共沉淀試驗(yàn)(Co-IP) HEK293T細(xì)胞傳代培養(yǎng)于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%左右，依據(jù)具體試驗(yàn)轉(zhuǎn)染p3×Flag-MGF360-14L、p-CMV-eGFP-MGF360-14L、pcDNA3.1-Myc-TRIM21、pcDNA3.1-HA-MAVS、p3×Flag-MAVS、pCDEF-H
畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2022年9期2022-09-30
- lncRNA SNHG6通過(guò)microRNA-26b-5p對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用機(jī)制研究*
-5p抑制組、共轉(zhuǎn)染組。對(duì)照組采用空載質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，SNHG6 敲減組采用si-SNHG6 慢病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，miR-26b-5p 抑制組采用空載質(zhì)粒及miR-26b-5p-inhibitor 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，共轉(zhuǎn)染組同時(shí)采用si-SNHG6慢病毒載體及miR-26b-5p-inhibitor 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。1.5 方法1.5.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染過(guò)程按照Lipofectamine 2000 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，參照細(xì)胞分組的干預(yù)內(nèi)容進(jìn)行轉(zhuǎn)染，于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)
中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志 2022年16期2022-08-31
- 長(zhǎng)鏈非編碼RNA ENST00000415964調(diào)控miR-214/DKK3對(duì)急性白血病細(xì)胞增殖、凋亡的影響
iR-NC組(共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ENST-00000415964和miR-NC)，pcDNA3.1-ENST00000-415964+miR-214組(共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ENST00-000415964和miR-214)，pcDNA3.1-ENST00000415-964+si-NC組(共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-ENST00000415964和si-NC)，pcDNA3.1-ENST00000415964+si-DKK3組(共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1
中國(guó)老年學(xué)雜志 2022年8期2022-07-25
- miR-498靶向磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
和OE-NC 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、miR-NC+OE-PCK1 組（miR-NC 和OE-PCK1 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、miR-498 mimics+OE-NC 組（miR-498mimics 和OENC 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、miR-498 mimics+OE-PCK1 組（miR-498 mimics 和OE-PCK1 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、antimiR-NC+si-NC 組（anti-miR-NC 和si-NC 組共轉(zhuǎn)染細(xì)胞）、anti-miR-NC+si-PCK1 組（an
實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2022年11期2022-07-18
- miR-133a-3p靶向BMP9調(diào)控人頜骨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化和凋亡的研究
i-con組（共轉(zhuǎn)染anti-miR-133a-3p和si-con后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)）、anti-miR-133a-3p＋si-BMP9組（共轉(zhuǎn)染anti-miR-133a-3p和si-BMP9后進(jìn)行成骨誘導(dǎo)）。1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)成骨分化過(guò)程中miR-133a-3p和BMP9 mRNA的表達(dá) 收集成骨誘導(dǎo)7 d的hOBMSCs，采用Trizol法提取hOBMSCs總RNA，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的純度。按cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR G
實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志 2022年2期2022-05-05
- lncRNA HOTAIRM1與miR-125b對(duì)肝細(xì)胞癌生物學(xué)行為影響
或miR-NC共轉(zhuǎn)染。將重組載體與miR-NC或miR-125b模擬物共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞。共轉(zhuǎn)染48 h后，棄掉原培養(yǎng)基，用100 μL PBS洗滌培養(yǎng)孔1遍，吸盡剩余的PBS；使用去離子水將5×PLB稀釋成l×PLB；向96孔板中加入50 μL 1×PLB，裂解細(xì)胞15 min；96孔酶標(biāo)板中(白色不透光的)每孔加上步驟的上清液10 μL，再加入100 μL LARII，靜止2 s；每孔加入Stop&Glo Reagent終止反應(yīng)，靜止2 s后，進(jìn)
錦州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 2022年1期2022-03-30
- EIAV Rev 核輸出活性檢測(cè)系統(tǒng)的建立
DDV-HA）共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，利用western blot 在細(xì)胞裂解液中可檢測(cè)到Gag 的表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)Gag 的表達(dá)來(lái)評(píng)估Rev 的核輸出活性。1 材料與方法1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞pLGFD3-8、pcDNA-HA、pcDNA-RevFDDV-HA、pEGFP-N1 質(zhì)粒、HEK293T 細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存；pcDNA-RevL36A-HA 是在pcDNARevFDDV-HA 的基礎(chǔ)上獲得的L36A 突變質(zhì)粒；pcDNARevUK-HA
中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2022年1期2022-03-22
- circ_0091581靶向miR-136對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
miR-NC(共轉(zhuǎn)染)、si-circ_0091581與anti-miR-136(共轉(zhuǎn)染)分別轉(zhuǎn)染至融合至70%的SCL-1細(xì)胞，分別記為si-NC組、si-circ_0091581組、miR-NC組、miR-136組、si-circ_0091581+anti-miR-NC組、si-circ_0091581+anti-miR-136組。1.2.2qRT-PCR檢測(cè)基因的表達(dá)水平CSCC組織、癌旁組織與各組SCL-1細(xì)胞的總RNA通過(guò)Trizol試劑提取，反
醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào) 2022年12期2022-02-02
- LncRNA H19通過(guò)miR-370-3p/RAF1軸對(duì)腦膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞增殖侵襲和放療敏感性的影響及機(jī)制
：T98G細(xì)胞共轉(zhuǎn)染2μg H19 wt質(zhì)粒和miR-370-3p mimics；mimics NC+H19 wt組：T98G細(xì)胞共轉(zhuǎn)染2μg H19 wt質(zhì)粒和mimics NC；H19 mut+miR-370-3p mimics組：T98G細(xì)胞共轉(zhuǎn)染2μg H19 mut質(zhì)粒和miR-370-3p mimics；mimics NC+H19 mut組：T98G細(xì)胞共轉(zhuǎn)染2μg H19 mut質(zhì)粒和mimics NC；③inhibitor NC組：T98G
河北醫(yī)學(xué) 2021年12期2022-01-04
- circ_0084927靶向miR-623調(diào)控喉癌TU177細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制研究
0084927共轉(zhuǎn)染TU177細(xì)胞，孵育48 h后用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將螢火蟲(chóng)熒光素酶活性歸一化為海腎熒光素酶活性表示相對(duì)熒光素酶活性。2 結(jié)果2.1circ_0084927和miR-623在喉癌組織中的表達(dá) 與癌旁組織比較，喉癌組織中circ_0084927相對(duì)表達(dá)水平升高，miR-623相對(duì)表達(dá)水平降低(P表1 喉癌組織和癌旁組織circ_0084927和miR-623的表達(dá)水平比較2.2干擾circ_0084927表達(dá)
解放軍醫(yī)藥雜志 2021年12期2022-01-03
- miR-206靶向FAM83A影響Wnt/β-catenin通路調(diào)控胰腺癌放療敏感性
pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-206 mimics和陰性對(duì)照pcDNA)、miR-206+FAM83A組(共轉(zhuǎn)染miR-206 mimics和過(guò)表達(dá)FAM83A質(zhì)粒pcDNA FAM83A)。1.3qPCR實(shí)驗(yàn) 使用Trizol提取細(xì)胞中總RNA，通過(guò)cDNA合成試劑盒將RNA樣本轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-206/FAM83A mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。其中，miR-206的上游引物為5′-CAGATCCGATTGGAATG
中國(guó)老年學(xué)雜志 2021年23期2021-12-08
- GAS5靶向miR-222-3p對(duì)牙周膜干細(xì)胞成骨分化的影響機(jī)制
iR-NC組：共轉(zhuǎn)染GAS5-siRNA和antimiR-NC；GAS5-siRNA+antimiR-222-3p組：共轉(zhuǎn)染GAS5-siRNA和antimiR-222-3p，其中，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。將hPDLSCs接種至6 孔板，培養(yǎng)至70%匯合度時(shí)，按照脂質(zhì)體3000說(shuō)明書(shū)對(duì)hPDLSCs進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染6 h后換液，培養(yǎng)48 h收集各組細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)GAS5和miR-223-3p表達(dá)水平評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率后，再以成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)。1.4 茜素紅染色
實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志 2021年2期2021-04-27
- LncRNA-MEG3和KLF4在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用及可能機(jī)制
模擬或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染C666-1細(xì)胞，36 h后雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)（Promega公司，美國(guó)）分析螢火蟲(chóng)和雷尼拉信號(hào)。熒光素酶活性用微量平板閱讀器定量。1.7 Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)用RIPA緩沖液分離總蛋白、10%SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，蛋白質(zhì)定量分析采用Bradford法，用皮爾斯ECL試劑盒顯示PVDF膜上的靶蛋白條帶?？贵w稀釋如下：抗KLF（1:1000）、抗Bcl-2（1:1000）和抗bax
腫瘤防治研究 2021年3期2021-04-12
- 過(guò)表達(dá)蛋白合成與分泌相關(guān)蛋白提高CHO細(xì)胞anti- hLAG3產(chǎn)量
G3的抗體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入ExpiCHO- S細(xì)胞中，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后72 h培養(yǎng)物上清中抗體產(chǎn)量的變化。僅轉(zhuǎn)染了pCAG- Hygro- IRES2- EGFP載體和anti- hLAG3輕重鏈的細(xì)胞上清中抗體的產(chǎn)量為24.21 μg/mL。為了更直觀地體現(xiàn)各蛋白對(duì)ExpiCHO- S細(xì)胞生產(chǎn)anti- hLAG3的影響，將轉(zhuǎn)染了各蛋白表達(dá)載體的細(xì)胞上清的抗體產(chǎn)量用相對(duì)產(chǎn)量(Cr)表示(式(2))。Cr=Cm/24.21×100%(2)式中，Cm為實(shí)測(cè)產(chǎn)量(μg/
- 長(zhǎng)鏈非編碼RNA-ATB對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制研究
tors 組、共轉(zhuǎn)染sh-ATB+miR-200c inhibitors 組、共轉(zhuǎn)染o/e-ATB+miR-200c inhibitors 組、共轉(zhuǎn)染miR-200c inhibitors+sh-DNMT3B 組、共轉(zhuǎn)染miR-200c mimics+sh-DNMT3B 組。1.3.2 qRT-PCR采用miRNeasy Mini Kit 提取miRNA，使用TaqMan MicroRNA Assay 試劑盒檢測(cè)miR-200c 的相對(duì)表達(dá)量，并使用App
中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志 2021年4期2021-03-16
- MEK5α 和MEK5β 調(diào)控Beclin 1 啟動(dòng)子
與p-354 共轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,MEK5αCA 顯著上調(diào)熒光素酶活性,而MEK5αDN 顯著下調(diào)熒光素酶活性(見(jiàn)圖2(a)),表明MEK5α能夠正向調(diào)控Beclin 1 啟動(dòng)子活性.然后分別轉(zhuǎn)染不同量的MEK5αCA,結(jié)果表明少量MEK5αCA(0.3 μg)對(duì)Beclin 1啟動(dòng)子活性無(wú)顯著作用,中量MEK5αCA(0.8 μg)可顯著上調(diào)Beclin 1 啟動(dòng)子活性,而多量MEK5αCA(2.4 μg)可進(jìn)一步
- LncRNA UCA1靶向miR-206/CLOCK對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的影響
W1783細(xì)胞共轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒，與LncRNA UCA1序列shRNA一同構(gòu)建。LV-con為對(duì)照組。將慢病毒載體加入LncRNA UCA1片段構(gòu)建LV-LncRNA UCA1。miR-206模擬或陰性對(duì)照(NC)通過(guò)Lipo- fectamine 2000(Invitrogen，美國(guó))進(jìn)行轉(zhuǎn)染。1.2.4蛋白質(zhì)印跡法 通過(guò)10%十二烷基硫酸鈉凝膠電泳提取蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜(Millipore，美國(guó))?？笶-鈣粘蛋白抗體(1:500，ab4077
貴州醫(yī)藥 2020年12期2021-01-19
- MicroRNA-212-3p與靶基因轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2基因3'UTR的關(guān)系研究*
β2-Luc 共轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞37℃水浴復(fù)蘇Saos-2 細(xì)胞，加入DMEM 培養(yǎng)基（含10% FBS）后置于37℃、50%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用DMEM 培養(yǎng)基（含10% FBS）制備Saos-2 單細(xì)胞懸液，按照2×105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞均勻地接種到細(xì)胞培養(yǎng)板（12 孔），置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)1.8×105個(gè)/孔時(shí)，使用無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用LipofectamineTM2000 進(jìn)行
中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志 2020年24期2021-01-04
- miR-203a-3p抗彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的作用及機(jī)制研究
C-mimic共轉(zhuǎn)染，24 h后使用雙熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定熒光素酶活性。1.2.7免疫印跡 收集細(xì)胞并用RIPA裂解液提取總蛋白，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。上樣后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h，洗膜后一抗孵育4 ℃過(guò)夜，加二抗室溫孵育2 h，ECL試劑檢測(cè)蛋白。2 結(jié) 果2.1miR-203a-3p在DLBCL組織中的表達(dá)水平 與RH組織比較，DLBCL組織中miR-203a-3p的表達(dá)水平顯著降低(P2.2過(guò)表達(dá)miR-20
福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 2020年5期2020-12-15
- LncRNA SOX2OT海綿吸附miR-34a促進(jìn)SOX2表達(dá)增強(qiáng)大腸癌多藥耐藥
mimic(共轉(zhuǎn)染SOX2OT、NC mimic)、SOX2OT+miR-34a(共轉(zhuǎn)染SOX2OT、miR-34a mimic)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT-116細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，以5×103個(gè)/孔的濃度接種于96孔板中，每孔加入100 μL完全培養(yǎng)基。過(guò)夜貼壁后加入5個(gè)濃度梯度的5-FU、VCR、CDDP和TAXOL，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，孵育48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，待其完全混勻，放入孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD
實(shí)用腫瘤學(xué)雜志 2020年5期2020-11-13
- 利用同源重組技術(shù)構(gòu)建Hoxa5、BMP6真核表達(dá)載體及共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞表達(dá)
載體通過(guò)與單、共轉(zhuǎn)染比較基因表達(dá)量的變化來(lái)研究Hoxa5和BMP6之間的作用關(guān)系，旨在為更深層次上研究毛囊功能基因奠定基礎(chǔ)。1 材料和方法1.1 試驗(yàn)材料健康的30日齡胎羊由青島畜牧所奧特種羊場(chǎng)提供；TRIzol、KpnⅠ、倒置顯微鏡、熒光定量PCR等均購(gòu)自Bio-Rad公司[9]。1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 引物設(shè)計(jì) 選取綿羊Hoxa5基因(GenBank登錄號(hào)為NM-001009431.1)CDS區(qū) 和BMP6基因(GenBank登錄號(hào)為NM-0011
華北農(nóng)學(xué)報(bào) 2020年4期2020-08-31
- 利用同源重組構(gòu)建Chordin、BMP6 真核表達(dá)載體及共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞表達(dá)的研究
、BMP6質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后在細(xì)胞水平上驗(yàn)證兩基因間的相互作用，為進(jìn)一步的分子育種工作提供依據(jù)。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取40 日齡的健康胎羊（由青島奧特種羊場(chǎng)提供）并及時(shí)消毒處理。TRIZol（Roche）試劑、蛋白裂解液、EcoRI 限制性內(nèi)切酶、KpnI 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、pcDNA3.1 質(zhì)粒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DMEM（基礎(chǔ)培養(yǎng)基）、胰蛋白酶、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清、DPBS（磷酸緩沖鹽溶液）、Lipofectamine
中國(guó)畜牧雜志 2020年7期2020-07-24
- EIAV Rev 蛋白拮抗eqTRIM5α介導(dǎo)的AP-1 信號(hào)通路的機(jī)制研究
性對(duì)照；第二組共轉(zhuǎn)染450 ng peqTRIM5α-HA+450 ng pcDNA3.1質(zhì)粒；第3 組共轉(zhuǎn)染450 ng peqTRIM5α-HA+450 ngpEIAV-Rev-HA 質(zhì)粒；第4 組共轉(zhuǎn)染450 ng pEIAVRev-HA+450 ng pcDNA3.1 質(zhì)粒，上述各組均同時(shí)轉(zhuǎn)染100 ng pGL3-AP-1-Luc（報(bào)告質(zhì)粒）和5 ng pRL-TK（內(nèi)參質(zhì)粒）。每組分別做3 個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染24 h 后，兩個(gè)重復(fù)組棄去上清液，每孔加
中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2020年1期2020-06-05
- CARMA3和MMP-9在乳腺癌細(xì)胞增殖侵襲中的作用
行下一步檢測(cè)。共轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3+MMP-9 siRNA，方法按上述步驟轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3，36小時(shí)后收集細(xì)胞檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)分為pCMV6-CARMA3組、空載體組、control siRNA組、MMP-9 siRNA組和共轉(zhuǎn)染pCMV6-CARMA3+MMP-9 siRNA組。1.2.3 CARMA3與MMP-9蛋白的表達(dá) 采用Western blot法對(duì)比乳腺癌細(xì)胞系與乳腺正常上皮細(xì)胞系中CARMA3與MMP-9蛋白的表達(dá)。收集乳腺癌
浙江實(shí)用醫(yī)學(xué) 2020年6期2020-05-08
- siRNA下調(diào)VEGF基因沉默對(duì)人舌癌細(xì)胞株Tca8113的生物學(xué)作用
式細(xì)胞術(shù)結(jié)果在共轉(zhuǎn)染Tea8113細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果顯示，G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少， G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多，且細(xì)胞凋亡率升高與脂質(zhì)體空載組及正常對(duì)照組相比差異非常顯著。見(jiàn)表2。表1 siRNA正義組與其他各組對(duì)Teag8113細(xì)胞增殖抑制率表2 轉(zhuǎn)染siRNA24 h后細(xì)胞周期進(jìn)程及凋亡率2.5 VEGF含量表達(dá)siRNA轉(zhuǎn)染Teag8113細(xì)胞上清液中VEGF含量檢測(cè)明顯低于各對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。表3
中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué) 2019年11期2019-11-26
- 流感病毒NS1蛋白與宿主蛋白DOK6的相互作用研究
5-DOK6 共轉(zhuǎn)染至6 孔板中密度為80 %的293T 細(xì)胞，同時(shí)分別轉(zhuǎn)染pCAGGS-Flag-NS1+pCAGGS 和 pCAGGS-V5-DOK6+pCAGGS 作 為對(duì)照，每種質(zhì)粒各1 g。轉(zhuǎn)染48 h 后，按200 μL/孔加入NP40 (含PMSF)，裂解細(xì)胞30 min，離心，收集上清全細(xì)胞裂解液(Whole cell lysates，WCL)，取20 μL 作為對(duì)照 ，剩余的樣品加入20 μL Anti-Flag M2 親和瓊脂糖珠過(guò)夜結(jié)
中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2019年10期2019-11-22
- miR-195過(guò)表達(dá)對(duì)人口腔鱗癌細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制
5 mimic共轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染FGF7-wt+miR-195)、FGF7-wt與對(duì)照共轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染FGF7-wt+vector)、FGF7-mut與miR-195 mimic共轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染FGF7-mut+miR-195)、FGF7-mut與對(duì)照共轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染FGF7-mut+vector)，分別完成轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，根據(jù)雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.5 SCC-4細(xì)胞內(nèi)miR-195、FGF7 mRNA表達(dá)檢測(cè)
山東醫(yī)藥 2019年25期2019-09-18
- miR-105靶向調(diào)控FUT4影響骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的研究
si-NC組；共轉(zhuǎn)染miR-105模擬物和FUT4 cDNA的細(xì)胞記為miR-105 mimic+pc-FUT4組，共轉(zhuǎn)染miR-105模擬物和FUT4 cDNA對(duì)照的細(xì)胞記為miR-105 mimic+pc-NC組；共轉(zhuǎn)染miR-105抑制劑和FUT4 siRNA的細(xì)胞記為miR-105 inhibitor+si-FUT4組，共轉(zhuǎn)染miR-105抑制劑和FUT4 siRNA對(duì)照的細(xì)胞記為miR-105 inhibitor+si-NC組。1.6 雙熒光素酶
中華骨與關(guān)節(jié)外科雜志 2019年6期2019-07-22
- miR-130b對(duì)宮頸癌細(xì)胞修復(fù)TNF-α誘導(dǎo)性基因組雙鏈DNA斷裂作用的影響及機(jī)制
酸(NC組)，共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CDKN1A和miR-130b mimics (CDKN1A+miR-130b組)、pcDNA3.1和miR-130b mimics (pcDNA3.1+miR-130b組)。轉(zhuǎn)染4 h，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。1.3 miR-130b、CDKN1A影響細(xì)胞修復(fù)雙鏈DNA斷裂觀察1.3.1 細(xì)胞干擾處理 CDKN1A組、pcDNA3.1組細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后，分別用終濃度為100 ng/mL TNF-α或PBS處理細(xì)
山東醫(yī)藥 2019年2期2019-02-15
- miR-9對(duì)人胃癌細(xì)胞株活化白細(xì)胞黏附分子基因表達(dá)的靶向調(diào)控作用
μg質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分組如下：(1)未轉(zhuǎn)染的空白對(duì)照組；(2)共轉(zhuǎn)染miR-NC、psiCHECK-2-ALCAM或psiCHECK-2-ALCAM-mut；(3)共轉(zhuǎn)染miR-9 mimics、psiCHECK-2-ALCAM或psiCHECK-2-ALCAM-mut；(4)共轉(zhuǎn)染miR-9 inhibitor、psiCHECK-2-ALCAM或psiCHECK-2-ALCAM-mut；每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染24 h后，每孔用PBS洗2次，加入100
胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志 2019年1期2019-01-24
- 慢病毒介導(dǎo)miR-34a表達(dá)對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤自噬的影響及機(jī)制研究△
MGB1載體及共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1的慢病毒載體及培養(yǎng)液接種至Y79細(xì)胞。按照接種載體分組，將Y79細(xì)胞株分為4組，分別為轉(zhuǎn)染miR-34a組、轉(zhuǎn)染HMGB1組、共轉(zhuǎn)染miR-34a+HMGB1組及陰性對(duì)照組。1.2.2miR-34a慢病毒載體的構(gòu)建及cDNA轉(zhuǎn)染獲取的人miR-34a序列，從Genbank中查閱HMGB1的cDNA序列，設(shè)計(jì)合成miR-34a及HMGB1前體引物，采用PCR方法擴(kuò)增含miR-34a及HMGB1前體片段，并克隆至慢
眼科新進(jìn)展 2019年1期2019-01-10
- miR-26a靶向HMGA1基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和遷移的影響
建好的質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染并分為3組，即miR-NC+miR-26a mimics組、Wt-HMGA1+miR-26a mimics組和Mut-HMGA1+miR-26a mimics組。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組SW480細(xì)胞中雙熒光素酶活性。1.5 CCK8法檢測(cè)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖活力 取轉(zhuǎn)染后生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的 miR-NC組、miR-26a mimics組和miR-26a inhib
- miR-581對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖與侵襲的影響及機(jī)制
miR-581共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48 h據(jù)Promega公司操作說(shuō)明，裂解細(xì)胞，加入熒光素酶底物，檢測(cè)熒光素酶活性，驗(yàn)證miR-581能否與PRDX1 3′UTR結(jié)合，證明miR-581是否能直接調(diào)控PRDX1。1.7 SW620細(xì)胞中PRDX1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。根據(jù)PRDX1蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小，配制凝膠，根據(jù)所測(cè)蛋白濃度適量加入蛋白樣品及每孔5 μL的蛋白Marker；跑膠，首先加壓80 V，保證
山東醫(yī)藥 2018年25期2018-07-20
- 基于miRNA-10b調(diào)控宮頸癌LncRNA-H19網(wǎng)絡(luò)通路機(jī)制的研究
RNA-10b共轉(zhuǎn)染組比較，pDNA-H19和miR-10b 共轉(zhuǎn)染組的miR-10b表達(dá)量下降(P0.05),說(shuō)明H19 抑制miRNA-10b的表達(dá)，見(jiàn)圖1。向過(guò)表達(dá)H19的HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-10b或miRNA-10 inhibitor共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增長(zhǎng)明顯高于pcDNA-mut-H19和miRNA-10b共轉(zhuǎn)染組(P圖1H19可抑制miRNA-10b的表達(dá)2.2H19促進(jìn)IGF1R表達(dá)用Western blot檢測(cè)IGF1R蛋白表達(dá)量顯示，p
中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué) 2018年3期2018-03-26
- miR—1203和HOTAIRrs7958904位點(diǎn)對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
1203模擬物共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)。過(guò)表達(dá)載體、miR-1203模擬物或抑制物單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，熒光定量PCR檢測(cè)HOTAIR表達(dá)，BrdU檢測(cè)細(xì)胞增殖，Annexin V-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲。 結(jié)果 HOTAIR突變型增強(qiáng)了miR-1203對(duì)其的靶向結(jié)合；miR-1203可以下調(diào)突變型HOTAIR的表達(dá)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；但對(duì)野生型HOTAIR影響不顯著（P > 0.05）
中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2018年3期2018-03-07
- 何首烏中THSG和蒽醌類(lèi)成分對(duì)人孕烷X受體介導(dǎo)的CYP3A4的調(diào)控作用
的報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，10 μmol·L-1利福平（RIF）為陽(yáng)性對(duì)照，10 μmol·L–1酮康唑（TKZ）為陰性對(duì)照，用THSG（2.5，5，10 μmol·L-1）和蒽醌類(lèi)成分（2.5，5，10 μmol·L-1）分別處理24 h，進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。結(jié)果表明，空載質(zhì)粒pcDNA3.1與pGL4.17-CYP3A4共轉(zhuǎn)染時(shí)，THSG、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酸、蘆薈大黃素對(duì)CYP3A4的調(diào)控多為抑制效應(yīng)，大黃素對(duì)CYP3A4產(chǎn)生誘導(dǎo)
中國(guó)中藥雜志 2017年24期2018-01-29
- miR-125b靶向Smad4調(diào)控非創(chuàng)傷性股骨頭壞死骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化與增殖的相關(guān)性
好的質(zhì)粒做三組共轉(zhuǎn)染，即Wt-Smad4與miR-125b mimics、Mut-Smad4和miR-125b mimics以及 miR-NC與miR-125b mimics，檢測(cè)熒光素酶的活性；BMP-2誘導(dǎo)HMSC-bm分化，將miR-125b mimics和si-Smad4轉(zhuǎn)染到分化的細(xì)胞內(nèi)，以不轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為參照，檢測(cè)miR-125b靶向Smad4對(duì)細(xì)胞分化的影響；將miR-125b mimics、miR-125b inhibitor和miR-NC
中國(guó)老年學(xué)雜志 2017年2期2017-02-14
- 綿羊肺腺瘤病毒SU蛋白與Hyal-2蛋白的結(jié)合域研究
-hyal-2共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，運(yùn)用激光共聚焦方法結(jié)合免疫共沉淀方法確定SU蛋白和Hyal-2蛋白可能結(jié)合區(qū)域。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明,SU1-SU5與Hyal-2均存在細(xì)胞內(nèi)共定位。免疫共沉淀方法檢測(cè)缺失型蛋白SU1-SU5與綿羊Hyal-2均不存在相互作用。su基因所缺失區(qū)域238 bp～867 bp對(duì)于SU蛋白與受體的結(jié)合都是必不可少的。關(guān)鍵詞：綿羊肺腺瘤病毒；SU蛋白；Hyal-2蛋白；結(jié)合區(qū)域綿羊肺腺瘤病(OPA)是由綿羊肺腺瘤病毒(Ov
動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展 2016年4期2016-05-10
- SOCS3通過(guò)PYK2信號(hào)通路調(diào)控小細(xì)胞肺癌的HI F-1α表達(dá)及增殖潛能△
-HIF-1α共轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。1.2..22免疫熒光檢測(cè) 使用紅色熒光標(biāo)記，在倒置熒光顯微鏡下，分別檢測(cè)已轉(zhuǎn)染細(xì)胞株及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中SOCS3的表達(dá)水平。1.2..33細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制 將人小細(xì)胞肺癌株NCI-H446細(xì)胞、Ad5轉(zhuǎn)染細(xì)胞株、Ad5-SOCS3轉(zhuǎn)染細(xì)胞株和Ad5-SOCS3-HIF-1α共轉(zhuǎn)染細(xì)胞株分別移至培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于第4、8、12、16、20、24、28天使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板分別計(jì)算細(xì)胞增殖數(shù)。檢測(cè)SOCS3單獨(dú)轉(zhuǎn)染及SOCS3與HIF-1
癌癥進(jìn)展 2015年1期2015-12-22
- 靶向豬ATGL 基因的miRNA預(yù)測(cè)及鑒定
iRNA模擬物共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，最終利用雙熒光素酶報(bào)告基因法來(lái)檢測(cè)熒光素酶活性。試驗(yàn)成功構(gòu)建了含豬ATGL基因3′UTR序列的重組載體pMIR-ATGL-3′UTR，雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)顯示ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149能下調(diào)293T細(xì)胞中pMIR-ATGL-3′UTR的熒光素酶活性，而點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)證實(shí)了ssc-miR-1343與ssc-
畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2015年8期2015-03-22
- CBF-β 輔助SIVagm Vif 蛋白誘導(dǎo)限制因子APOBEC3G 的降解
A3.1 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組將3 μg pcDNA-SIVVif-HA 與CBF-β 質(zhì)粒或者相應(yīng)量的pcDNA3.1 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)293T 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h 之后換成含有終濃度100 μg/mL CHX(放線菌酮)的完全培養(yǎng)液，分別在加入CHX 后的0 h、1 h、2 h、6 h 和12 h 收 獲細(xì)胞，并將細(xì)胞裂解。進(jìn)行SDS-PAGE，將轉(zhuǎn)印蛋白的PVDF 膜用5 %的脫脂乳封閉，分別以HA 抗體(1∶10 000)、Flag 抗體(
中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2015年10期2015-03-09
- 乙型肝炎病毒前S2蛋白激活人酰基蛋白硫酯酶1啟動(dòng)子*
)-preS2共轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2，然后通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性來(lái)評(píng)價(jià)preS2對(duì)人APT1基因啟動(dòng)子的作用。數(shù)據(jù)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。結(jié)果測(cè)序結(jié)果證實(shí)pcDNA3.1(-)-preS2與pGL3-APT1與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符。pGL3-APT1的熒光素酶活性是陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pGL3-Control的熒光素酶活性的1.2倍(P肝炎病毒,乙型;病毒蛋白類(lèi)；蛋白質(zhì)前體；酰基蛋白硫酯酶1；啟動(dòng)子；反式激活乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)
重慶醫(yī)學(xué) 2015年29期2015-01-07
- CD14對(duì)生殖支原體LAMPs激活NF-κB的影響
g。1.2.5共轉(zhuǎn)染及NF-kB活性的測(cè)定 ①以pcDNA-CD14，pFLAG-TLR2， pNF-kB-luc及pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24 h后，再用LAMPs刺激8 h；②LAMPs用10 μg/mL sCD14 37℃共孵育30 min后，再刺激0.1 μg/mL pFLAG-TLR2，0.05 μg/mL pNF-kB-luc，0.005 μg/mL pRL-TK共轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞8 h。分別消化收集HeLa細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液20
中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào) 2014年8期2014-04-02
- 雙分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)的構(gòu)建及其在病毒學(xué)中的初步應(yīng)用
00 ng進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。具體步驟參照Fugene HD試劑說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。待轉(zhuǎn)染16 h后，棄去部分培養(yǎng)基，然后將細(xì)胞置于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光并拍照保存。2 結(jié)果2.1 Venus突變體的構(gòu)建根據(jù)突變體Venus與EYFP序列比較結(jié)果顯示，Venus共存在5個(gè)特異的氨基酸位點(diǎn)突變，分別為:F46L、F64L、M153T、V163A、S175G。構(gòu)建示意圖如圖1所示。在突變PCR過(guò)程中，為便于以后插入目的基因，在其N(xiāo)端分別引物了EcoRI，BamHI和XhoI
中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào) 2013年3期2013-07-04
- 小鼠DUSP1 3'-UTR雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng)的建立及功能鑒定
作為陽(yáng)性對(duì)照)共轉(zhuǎn)染，0.2μg LuDP/RL分別與0.1μg HuR表達(dá)載體(pcDNA 3.1-HuR-FLAG)和pCDNA3.1(作為對(duì)照)共轉(zhuǎn)染，0.2μg LuDP/RL分別與50nmol/L mmu-miR101a和Control dsRNA(作為對(duì)照)共轉(zhuǎn)染，48h后收獲細(xì)胞，采用Dual-Luciferase?Reporter Assay System檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。圖1 小鼠DUSP1 3'-UTR序
解放軍醫(yī)學(xué)雜志 2013年4期2013-04-01
- 豬繁殖與呼吸綜合征病毒相關(guān)豬microRNA的初步篩選
K－utr質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SUVEC，設(shè)立空載體對(duì)照，依照LipofectamineTM2000試劑說(shuō)明轉(zhuǎn)染96孔板，各自設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染設(shè)置組如下：1：psiCHECKTM－2vector，2：psiCHECK－utr，3：miRNA control；psiCHECK－utr，4：inhibitor control；psiCHECK－utr，5：miR－323；psiCHECK－utr，6：miR－323inhibitor；psiCHECK－utr，7：mi
中國(guó)獸醫(yī)雜志 2012年3期2012-11-23
- pBIFC-VN173-CXCR4 和pBIFC-VC155-NT21MP 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在活細(xì)胞內(nèi)的作用
.6 重組載體共轉(zhuǎn)染COS-7 細(xì)胞 將COS-7 細(xì)胞接種于24 孔板，每孔105個(gè)細(xì)胞，于500μl 無(wú)抗生素DMEM 完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)中37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%至90%且細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組:①pBIFC-VN173 和pBIFCVC155 共轉(zhuǎn)染組;②pBIFC-VN173-CXCR4 轉(zhuǎn)染組;③pBIFC-VC155-NT21MP 轉(zhuǎn)染組;④pBIFCVN173-CXCR4 和pBIFC-V
- hTPO和hNIS共轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞系H460介導(dǎo)放射性碘攝取的研究
增高，我們同時(shí)共轉(zhuǎn)染入人甲狀腺過(guò)氧化物酶（human thyroperoxidase, hTPO）基因，從而達(dá)到提高治療效果的目的。1 材料與方法1.1 材料和儀器 H460人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所惠贈(zèng)，pcDNA3.1/hNIS質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。G418硫酸鹽、DMEM高糖型培養(yǎng)基和脂質(zhì)體（LipofectamineTM2000）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；實(shí)驗(yàn)用酶類(lèi)均購(gòu)自日本Takara（寶生物）公司。125I購(gòu)自中
中國(guó)肺癌雜志 2010年6期2010-09-11
- TMD2前斷裂CFTR翻譯后的連接及氯離子通道功能
真核表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的真核細(xì)胞，瞬時(shí)表達(dá)觀察CFTR的剪接，膜片鉗記錄細(xì)胞的 CI?電流和通道開(kāi)放活性，為運(yùn)用雙AAV載體轉(zhuǎn)CFTR基因的CF基因治療研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料質(zhì)粒pMST (含split Ssp DnaB intein編碼序列)由加拿大Dalhousie大學(xué)醫(yī)學(xué)院Paul Liu教授實(shí)驗(yàn)室提供。含CFTR的質(zhì)粒pIRES2-EGFP-CFTR和幼年倉(cāng)鼠腎臟細(xì)胞 (Baby hamster kidney，BHK)
生物工程學(xué)報(bào) 2010年12期2010-02-09