朱丹彤，艾有為，林躍智，馬建章，王曉鈞*，侯志軍*，張明海*

(1.東北林業(yè)大學(xué) 野生動物資源學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150001)

APOBEC3G(A3G)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的天然免疫慢病毒限制因子，通過誘導(dǎo)病毒cDNA 超突變，降低病毒感染性，發(fā)揮重要的抗病毒作用[1]。Vif(Virion infectivity factor)是除了馬傳染性貧血病毒(EIAV)以外，其他慢病毒均編碼的一種病毒輔助蛋白，分子量為23 ku，是慢病毒在某些細(xì)胞中復(fù)制所必需的輔助蛋白。Vif 通過招募基于Cul5、Elongin B、Elongin C 和Rb 組成的Cullin5-ring ligase(CRL5)E3 泛素連接酶復(fù)合物與A3G 結(jié)合，誘導(dǎo)多種APOBEC3 蛋白的泛素化及降解，解除APOBEC3介導(dǎo)的抗病毒作用[2-3]。HIV-1 的研究發(fā)現(xiàn)，Vif 對APOBEC3G 降解作用還需要另外一種因子CBF-β 的參與。CBF-β 是RUNX 家族轉(zhuǎn)錄輔助因子，可與RUNX 家族的蛋白形成異二聚體，該復(fù)合物對于細(xì)胞分化具有重要功能。在HIV-1 感染過程中，CBF-β 的缺失會導(dǎo)致Vif 失去對A3G/F 降解作用[4-5]。CBF-β 廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞，其存在可以提高Vif的穩(wěn)定性和可溶性，抑制Vif 的寡聚化。未寡聚化的Vif 更利于E3 泛素連接酶復(fù)合物的形成。同時，CBF-β 的表達(dá)可以提高Vif 與Cul5 的結(jié)合，從而有效的招募E3 泛素連接酶復(fù)合體并與之穩(wěn)定結(jié)合，有利于Vif 對A3G 的降解作用。其中aa15-aa126 為CBF-β 發(fā)揮該功能的關(guān)鍵區(qū)域[6-7]。由此，CBF-β 在HIV-1 編碼的VIf 對A3G 的降解作用是至關(guān)重要的。除HIV-1 之外，最近研究發(fā)現(xiàn)SIVmac(恒河猴)編碼的Vif 蛋白對A3G 的降解作用也同樣需要CBF-β 的輔助作用[8]。

在HIV-1 及SIVmac 的相關(guān)研究顯示CBF-β 的重要作用[8]。但這一結(jié)果是否適用其他來源的慢病毒還不清楚。本研究通過CBF-β 對不同屬的靈長類慢病毒來源的Vif 生化特性的改變，來探索CBF-β促進(jìn)靈長類慢病毒Vif 的原因和機(jī)制，證明SIVagm編碼的Vif 對A3G 的降解同樣需要CBF-β 的輔助作用，并且其第38 位色氨酸對于該蛋白的活性具有關(guān)鍵作用。

1 材料和方法

1.1 重組質(zhì)粒及細(xì)胞 pcDNA-HIV-1-Vif-HA、pcDNASIVagm-Vif、pcDNA-HIV-1-Vif W38S-HA、pcDNASIV-Vif W38S-HA、pVR-CBF-β-myc-flag、293T 細(xì)胞及293T siRNACBF-β細(xì)胞系均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所馬傳染病與慢病毒創(chuàng)新團(tuán)隊提供；人A3G(pcDNA-A3G-V5)以及非洲綠猴A3G(pcDNAA3Gagm-V5)表達(dá)重組質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所基礎(chǔ)免疫創(chuàng)新團(tuán)隊鄭永輝研究員提供。

1.2 主要試劑 Plasmid Mini Kit I 購自O(shè)MEGA 公司；HiPure Plasmid Maxiprep Kit 購自Invitrogen 公司；鼠抗HA、鼠抗beta-actin、Flag 抗體、V5 抗體和放線菌酮(CHX)均購自Sigma 公司；DyLightTM羊抗鼠IgG 購自ROCK-LAND 公司。

1.3 CBF-β 對SIVagm Vif 功能的影響 按照磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染法，設(shè)立對照組和實驗組2 個轉(zhuǎn)染組，對照組將3 μg A3G、1 μg A3G 和1 μg pcDNAHIV-1-Vif-HA、1 μg A3G 和1 μg pcDNA-HIV-1-Vif-HA 及1 μg CBF-β 分別轉(zhuǎn)染293T siRNACBF-β；實 驗組將3 μg A3Gagm、1 μg A3Gagm 和1 μg pcDNASIV-Vif-HA、1 μg A3Gagm 和1 μg pcDNA-SIV-Vif-HA 及1 μg CBF-β 分別轉(zhuǎn)染293T siRNACBF-β，同時用空載體pcDNA3.1 補平轉(zhuǎn)染質(zhì)?？偭坎町?。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞并裂解，進(jìn)行SDS-PAGE，將轉(zhuǎn)印蛋白的PVDF 膜用5 %的脫脂乳封閉，分別以HA 抗體(1:10 000)、V5 抗體(1∶5 000)、Flag 抗體(1∶5 000)、actin 抗體(1∶10 000)為一抗，以DyLightTM羊抗鼠IgG 為二抗(1∶10 000)，通過紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(YQ09-0052)檢測各個實驗組的蛋白表達(dá)情況。

1.4 CHX 對Vif 蛋白穩(wěn)定性檢測 通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法，設(shè)立兩個實驗組，對照組將3 μg pcDNA-HIV-1-Vif-HA 與CBF-β 質(zhì)?；蛘呦鄳?yīng)量的pcDNA3.1 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞；實驗組將3 μg pcDNA-SIVVif-HA 與CBF-β 質(zhì)?；蛘呦鄳?yīng)量的pcDNA3.1 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)293T 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h 之后換成含有終濃度100 μg/mL CHX(放線菌酮)的完全培養(yǎng)液，分別在加入CHX 后的0 h、1 h、2 h、6 h 和12 h 收 獲細(xì)胞，并將細(xì)胞裂解。進(jìn)行SDS-PAGE，將轉(zhuǎn)印蛋白的PVDF 膜用5 %的脫脂乳封閉，分別以HA 抗體(1∶10 000)、Flag 抗體(1∶5 000)、actin 抗體(1∶10 000)及DyLightTM羊抗鼠IgG 為二抗(1:10 000)進(jìn)行孵育，對蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。

1.5 SIVagm Vif 功能試驗 通過點突變技術(shù)把HIV-1 Vif 和SIVagm Vif 的38 位色氨酸(W)突變成絲氨酸(S)并且以Bam HⅠ和NotⅠ為酶切位點加入HA 標(biāo)簽，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA-HIV-1 Vif W38SHA 和pcDNA-SIV Vif W38S-HA 進(jìn)行相應(yīng)的實驗。通過磷酸鈣沉淀法，分別將3 μg pcDNA-A3G 與pcDNA-HIV-1 Vif W38S-HA、3 μg pcDNA-A3Gagm與pcDNA-SIVagm-Vif W38S-HA 轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h 后收集細(xì)胞并裂解，進(jìn)行SDS-PAGE，將轉(zhuǎn)印蛋白的PVDF 膜用5 %的脫脂乳封閉，分別以HA抗體(1∶10 000)、V5 抗體(1∶5 000)、actin 抗體(1∶10 000)及DyLightTM羊抗鼠IgG 為二抗(1∶10 000)進(jìn)行孵育，對蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 CBF-β 輔助SIVagm Vif 降解A3Gagm 的檢測結(jié)果 分別采用CBF-β/SIVagm Vif/A3Gagm 3 種重組質(zhì)粒和SIVagm Vif/A3Gagm 2 種重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞并采用A3G 單轉(zhuǎn)染及相關(guān)HIV 重組質(zhì)粒組合作為對照組進(jìn)行對比性分析。并采用western blot 檢測目的蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，同CBF-β 對HIV-1 Vif 和A3G 的作用相同，在SIVagm 中，CBF-β 的表達(dá)組中Vif 蛋白的表達(dá)顯著高于其他2組(圖1A，圖1B 第4 列)，同 時Vif/SIVagm Vif 對A3G/A3Gagm 蛋白降解作用顯著高于未加入CBF-β的對照組(圖1A，圖1B)。上述結(jié)果表明，SIVagm Vif 對A3Gagm 的降解也需要CBF-β 的輔助。

圖1 在293T 細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染48 h 后檢測Vif 介導(dǎo)的A3G 降解需要CBF-βFig.1 The degradation of Vif mediated A3G with the expression of CBF-β in 293T cells at 48 hrs post cotransfections

2.2 CBF-β 對SIVagm Vif 細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性的檢測結(jié)果 CHX 是一種在真核生物中對蛋白質(zhì)生物合成過程有抑制效應(yīng)的化合物。結(jié)果2.1 顯示，加入CBF-β 的實驗組SIVagm Vif 的表達(dá)顯著高于其他2組。為進(jìn)一步探索CBF-β 提高Vif 表達(dá)的機(jī)制，采用 將CBF-β 和Vif 表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HIV-1-Vif-HA、pcDNA-SIV-Vif-HA 共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后，通過CHX進(jìn)行蛋白穩(wěn)定性試驗。由于CHX 能夠抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白合成，但對蛋白降解沒有影響。通過CHX 的處理后，在與單獨表達(dá)SIVagm Vif 組相比，加入CBF-β 的實驗組SIVagm Vif 的表達(dá)水平顯著升高，同時與CHX 的作用時間呈負(fù)相關(guān)(圖2)。表明，CBF-β 不僅促進(jìn)HIV-1 Vif 在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，也能促進(jìn)SIVagm Vif 在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。

圖2 293T siRNACBF-β 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h 后 經(jīng)CHX 處理后Vif 蛋白表達(dá)水平的檢測Fig.2 The stabilization of Vif in presence of CHX in 293T siRNACBF-β from 24 hrs post the transfections

2.3 Vif W38S 點突變對CBF-β 的敏感性的檢測結(jié)果 有研究表明HIV-1 Vif 中第38 位色氨酸(W)對HIV-1 Vif 與CBF-β 的相互作用具有關(guān)鍵作用。將HIV-1 Vif 的第38 位色氨酸(W)突變成絲氨酸(S)之后，HIV-1 Vif 喪失與CBF-β 之間的相互作用，CBF-β不再促進(jìn)其細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性以及Vif 介導(dǎo)的A3G 降解的功能。為了檢測在SIVamg Vif 中與CBF-β 的關(guān)鍵結(jié)合部位是否也是第38 位色氨酸，將pcDNASIVagm-Vif W38S-HA 和CBF-β 共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，對比pcDNA-SIVagm Vif-W38S-HA 單獨轉(zhuǎn)染的CHX-蛋白穩(wěn)定性試驗，發(fā)現(xiàn)CBF-β 對SIVagm W38S 突變體的穩(wěn)定性同對HIV-1 Vif 同樣沒有促進(jìn)作用。此外，CBF-β 也喪失了促進(jìn)SIVagm W38S 細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性的能力(圖3A、B)。上述結(jié)果表明第38 位色氨酸對HIV-1 Vif、SIVagm Vif 與CBF-β 之間的相互結(jié)合作用至關(guān)重要。

2.4 Vif W38S 點突變對A3G 降解能力的檢測結(jié)果將A3G 與pcDNA-HIV-1-Vif W38S-HA、A3Gagm 與pcDNA-SIVagm Vif W38S-HA 共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后，收集樣品進(jìn)行western blot 檢測。結(jié)果顯示，野生型HIV-1/SIVagm Vif 蛋白能夠有效地下調(diào)細(xì)胞內(nèi)A3G/A3Gagm 的水平(圖4A、圖4B)，而Vif W38S 突變組對A3G 的降解作用顯著下降(圖4A，圖4B)。表明W38S 的突變不但改變了CBF-β 和Vif 的結(jié)合，同時也造成了Vif 誘導(dǎo)相應(yīng)物種A3G 降解的能力。

圖3 Vif 突變體對CBF-β 結(jié)合活性的檢測Fig.3 Detection of the binding activity of Vif mutant to CBF-β

圖4 Vif W38S 突變體對A3G 降解能力的檢測Fig.4 Detection of A3G degradation activity with Vif W38S mutant

3 討論

本研究顯示，CBF-β 能夠直接和Vif 結(jié)合影響其穩(wěn)定性，減少其寡聚化水平。從而利于Vif 招募相應(yīng)的因子，發(fā)揮對A3G 的降解作用。根據(jù)晶體結(jié)構(gòu)顯示，Vif 的蛋白結(jié)構(gòu)包括一大一小2 個結(jié)構(gòu)域[9]。CBF-β 能夠與Vif 大的結(jié)構(gòu)域發(fā)生緊密結(jié)合。而CBF-β 的羧基端則在Vif 的兩個結(jié)構(gòu)域間形成三明治結(jié)構(gòu)。另一個結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與CUL5-ELOC 結(jié)合。Vif 是處于復(fù)合體的核心位置。同時，結(jié)構(gòu)顯示與CBF-β-RUNX1 結(jié)合的區(qū)域為Vif 的α/β 區(qū)域，這一區(qū)域的關(guān)鍵氨基酸為第22 位色氨酸以及第38 位色氨酸[10]。這2 個氨基酸的破壞會打破CBF-β-Vif 及RUNX-CBF-β 的連接，從而影響復(fù)合物的形 成[11]。本研究也證實了這點。將HIV-1 Vif 與CBF-β 相互作用的第38 位色氨酸突變成絲氨酸之后，CBF-β 不再促進(jìn)HIV-1 Vif 在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，該HIV-1 Vif突變體隨即喪失了誘導(dǎo)A3G 降解的功能。由于不同種間的差異，SIVagm Vif 沒有第22 位色氨酸，所以將SIVagm Vif 相應(yīng)的第38 位色氨酸突變?yōu)榻z氨酸之后，觀察到CBF-β 不再促進(jìn)SIVagm Vif 在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，該突變體喪失了誘導(dǎo)A3Gagm 降解的功能。恒河猴和非洲綠猴慢病毒編碼的Vif 基因和CBF-β 作用的關(guān)鍵位點較為保守。因此，該位點將成為一個潛在的設(shè)計抗HIV-1 及SIV 藥物的靶點。

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