宋丹丹，那 雷，王曉鈞

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

TRIM5α 是TRIM 蛋白家族的重要成員之一。TRIM 蛋白家族是三結(jié)構(gòu)域家族，包括N 端RING 鋅指結(jié)構(gòu)、B-box 結(jié)構(gòu)和一個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)（Coiled coil，CC）。這3 個(gè)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)稱為RBCC 結(jié)構(gòu)域。除了RBCC 結(jié)構(gòu)域外，TRIM5α C 端還有一個(gè)B30.2（SPRY）結(jié)構(gòu)域。TRIM5α是一種限制逆轉(zhuǎn)錄病毒跨種間感染的宿主蛋白，其SPRY 結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合逆轉(zhuǎn)錄病毒的衣殼蛋白，加速衣殼解體，導(dǎo)致病毒反轉(zhuǎn)錄復(fù)合體降解，進(jìn)而阻礙病毒復(fù)制過(guò)程。同時(shí)，TRIM5α也作為一種模式識(shí)別受體，特異性識(shí)別逆轉(zhuǎn)錄病毒的衣殼蛋白所形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，招募E2 泛素結(jié)合酶復(fù)合體UBC13-UEV1A，催化形成游離的K63 多聚泛素鏈，在TAB2、TAB3 作用下活化TAK1，最終通過(guò)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活A(yù)P-1和NF-κB信號(hào)通路，抑制病毒復(fù)制[1-2]。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證明恒河猴TRIM5α激活A(yù)P-1 信號(hào)通路除了依賴于RING 結(jié)構(gòu)域外，還需要完整的SPRY 結(jié)構(gòu)域[3]。雖然馬TRIM5α（eqTRIM5α）不具有完整的SPRY 結(jié)構(gòu)域，但在293T 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的eqTRIM5α可以利用人源相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白強(qiáng)烈激活A(yù)P-1 和NF-κB 信號(hào)通路[4]。

本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)篩選到EIAV 的Rev 蛋白可以負(fù)調(diào)控宿主eqTRIM5α介導(dǎo)的AP-1信號(hào)通路，但是其機(jī)制還不清楚。本研究將pcDNA3.1-EIAV-Rev-HA 質(zhì)粒分別與含eqTRIM5α及下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白TAK1、TAB2、P38 和c-Jun 基 因 的 質(zhì) 粒 共 轉(zhuǎn) 染HEK 293T 細(xì)胞，利用熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)及western blot 試驗(yàn)，證明EIAV 的Rev 蛋白顯著下調(diào)eqTRIM5α介導(dǎo)的AP-1 信號(hào)通路，是通過(guò)蛋白酶體途徑特異性降解P38 蛋白完成，本研究為進(jìn)一步理解EIAV 與宿主蛋白相互作用及病毒逃逸機(jī)制提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與細(xì)胞 pcDNA3.1-TAK1-Flag（簡(jiǎn)稱pTAK1-Flag，全文pcDNA3.1 載體均按該簡(jiǎn)稱）、pTAB2-Flag 和pc-Jun 真核表達(dá)質(zhì)粒由瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)Luban 教授惠贈(zèng)；pGL3-AP-1-Luc 報(bào)告質(zhì)粒、pRL-TK內(nèi) 參 質(zhì) 粒、pcDNA3.1、peqTRIM5α-HA、pEIAVRev-HA、pP38-Flag 質(zhì)粒和HEK 293T 細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 Polyjet 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自SignaGen Laboratories公司；鼠抗Flag單克隆抗體（MAb）購(gòu)自O(shè)riGene公司；鼠抗HA MAb、鼠抗β-actin MAb、蛋白酶體抑制劑MG132、DMSO 均購(gòu)自Sigma 公司；IRDye800CW標(biāo)記的羊抗鼠IgG 購(gòu)自KPL 公司；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購(gòu)自Promega 公司；細(xì)胞裂解液1（150 mmol/L Tris-Cl、 50 mmol/L NaCl、 5 mmol/L EDTA、 1%Triton X-100，PH=7.6）、細(xì) 胞 裂 解 液2（50 mmol/L HEPES、50 mmol/L KCl、0.25%NP-40、1 mmol/L DTT、100 mmol/L NaCl，PH=7.9）均由本實(shí)驗(yàn)室配制。

1.3 EIAV Rev 對(duì)eqTRIM5α激活的AP-1 信號(hào)通路的檢測(cè) 待12 孔板中的HEK 293T 細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞融合度80%時(shí)，參照Polyjet 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，第一組轉(zhuǎn)染900 ng pcDNA3.1 空載體質(zhì)粒為陰性對(duì)照；第二組共轉(zhuǎn)染450 ng peqTRIM5α-HA+450 ng pcDNA3.1質(zhì)粒；第3 組共轉(zhuǎn)染450 ng peqTRIM5α-HA+450 ngpEIAV-Rev-HA 質(zhì)粒；第4 組共轉(zhuǎn)染450 ng pEIAVRev-HA+450 ng pcDNA3.1 質(zhì)粒，上述各組均同時(shí)轉(zhuǎn)染100 ng pGL3-AP-1-Luc（報(bào)告質(zhì)粒）和5 ng pRL-TK（內(nèi)參質(zhì)粒）。每組分別做3 個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染24 h 后，兩個(gè)重復(fù)組棄去上清液，每孔加100 μL 細(xì)胞裂解液1，4 ℃裂解10 min，室溫振蕩10 min。每孔分別取10 μL 上清液于微孔板中，參照Promega 說(shuō)明書，利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)每組螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶的活性值，兩者的活性比值即為每組所得數(shù)值，采用GraphPad Prism 5 分析數(shù)值。同時(shí)，為了證明每組質(zhì)粒均轉(zhuǎn)染成功，轉(zhuǎn)染24 h 后，每組的第三個(gè)重復(fù)組棄去上清液，每孔加入200 μL 細(xì)胞裂解液2，離心收集裂解物上清，分別以鼠抗HA MAb（1∶10 000）、鼠抗Flag MAb（1∶2 000）、鼠抗β-actin MAb（1∶20 000）為一抗室溫孵育2 h，以IRDye800CW 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶5 000）為二抗室溫避光孵育1 h，利用western blot 對(duì)每組蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。利用Image Studio Lite Ver 5.2 軟件進(jìn)行灰度分析，檢測(cè)eqTRIM5α、EIAV Rev 蛋白及β-actin的表達(dá)情況。

1.4 EIAV Rev 對(duì)TRIM5α下游轉(zhuǎn)導(dǎo)分子（TAK1、TAB2、P38、c-Jun）激活的AP-1 信號(hào)通路的檢測(cè)該部分設(shè)置4 個(gè)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)組。第1 個(gè)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)設(shè)置如下：第一組轉(zhuǎn)染900 ng pcDNA3.1 作為陰性對(duì)照；第二組共轉(zhuǎn)染450 ng pcDNA3.1+450 ng pTAK1-Flag質(zhì)粒；第三組共轉(zhuǎn)染450 ng pEIAV-Rev-HA+450 ng pTAK1-Flag 質(zhì) 粒；第4 組 共轉(zhuǎn)染450 ng pEIAV-Rev-HA+450 ng pcDNA3.1 質(zhì)粒。第2 個(gè)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)設(shè)置如下：第1、4 組同第一個(gè)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)；第2 組共轉(zhuǎn)染450 ng pcDNA3.1+450 ng pP38-Flag 質(zhì)粒；第3 組共轉(zhuǎn)染450 ng pEIAV-Rev-HA+450 ng pP38-Flag 質(zhì)粒。第3 個(gè)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)設(shè)置如下：第1、4 組同第一個(gè)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；第2 組共轉(zhuǎn)染450 ng pcDNA3.1+450 ng pP38-Flag質(zhì)粒；第3組共轉(zhuǎn)染450 ng pEIAV-Rev-HA+450 ng pP38-Flag 質(zhì) 粒。第4 個(gè) 轉(zhuǎn) 染試驗(yàn)設(shè)置如下：第1、4 組同第一個(gè)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)；第2組共轉(zhuǎn)染450 ng pcDNA3.1+450 ng pc-Jun 質(zhì)粒；第3組共轉(zhuǎn)染450 ng pEIAV-Rev-HA+450 ng pc-Jun 質(zhì)粒。上述各試驗(yàn)每組均同時(shí)轉(zhuǎn)染100 ng pGL3-AP-1-Luc（報(bào)告質(zhì)粒）和5 ng pRL-TK（內(nèi)參質(zhì)粒）。每組分別做3 個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染24 h 后裂解細(xì)胞，裂解方法、熒光素酶檢測(cè)方法和western blot 方法與1.3 中各方法一致。

1.5 EIAV Rev 對(duì)TRIM5α 下游轉(zhuǎn)導(dǎo)分子激活的western blot 檢測(cè) 待6 孔板中的HEK 293T 細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞融合度80%時(shí)，參照Polyjet 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，第一孔共轉(zhuǎn)染1 μg pTAK1-Flag+1 μg pcDNA3.1質(zhì)粒；第二孔共轉(zhuǎn)染1 μg pTAK1-Flag+1 μg pEIAVRev-HA 質(zhì)粒；第3 孔共轉(zhuǎn)染1 μg pTAB2-Flag+1 μg pcDNA3.1 質(zhì)粒；第4 孔共轉(zhuǎn)染1 μg pTAB2-Flag+1 μg pEIAV-Rev-HA 質(zhì)粒；第5 孔共轉(zhuǎn)染1 μg pP38-Flag+1 μg pcDNA3.1 質(zhì)粒；第6 孔共轉(zhuǎn)染1 μg pP38-Flag+1 μg pEIAV-Rev-HA 質(zhì) 粒。每 孔 分 別 做3 個(gè) 重 復(fù)。轉(zhuǎn)染24 h 后，棄去上清液，每孔加入200 μL 細(xì)胞裂解液2，離心收集裂解物上清，分別以鼠抗HA MAb（1∶10 000）、鼠抗Flag MAb（1∶2 000）、鼠抗β-actin MAb（1∶20 000）為一抗室溫孵育2 h，以IRDye800CW標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶5 000）為二抗室溫避光孵育1 h，經(jīng)western blot 檢 測(cè)TAK1、TAB2、P38、EIAV Rev 蛋白及β-actin 的表達(dá)情況，并經(jīng)Image Studio Lite Ver 5.2 軟件進(jìn)行灰度分析。

1.6 蛋白酶體抑制劑恢復(fù)試驗(yàn) 待6 孔板中的HEK 293T 細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞融合度80%時(shí)，利用Polyjet轉(zhuǎn)染試劑分別共轉(zhuǎn)染1 μg pP38-Flag+1 μg pEIAVRev-HA（分 別 作 為 兩 個(gè) 實(shí) 驗(yàn) 組2 和3）和1 μg pP38-Flag+1 μg pcDNA3.1（作為陰性對(duì)照組1）。轉(zhuǎn)染24 h 后，實(shí)驗(yàn)3 組加入20 μmol/L 蛋白酶體抑制劑MG132，實(shí)驗(yàn)2組和陰性對(duì)照組分別加入相同濃度DMSO，作用24 h 后按1.3 的western blot 方法分別檢測(cè)P38、EIAV Rev 蛋白及β-actin 蛋白表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 整理數(shù)據(jù)，按照T-test 統(tǒng)計(jì)方法對(duì)上述試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，p＜0.05 或p＜0.01 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 EIAV Rev 對(duì)eqTRIM5α激活的AP-1 信號(hào)通路的檢測(cè)結(jié)果 為了探究EIAV Rev 蛋白影響eqTRIM5α激活的AP-1 信號(hào)通路的機(jī)制，本試驗(yàn)通過(guò)熒光素酶系統(tǒng)檢測(cè)EIAV Rev 蛋白對(duì)eqTRIM5α激活的AP-1信號(hào)通路的影響。結(jié)果顯示：eqTRIM5α 與pcDNA3.1 共轉(zhuǎn)染后激活A(yù)P-1 信號(hào)通路的倍數(shù)為26.0；eqTRIM5α與EIAV Rev 共轉(zhuǎn)染后激活A(yù)P-1 信號(hào)通路的倍數(shù)為0.4；單轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 和共轉(zhuǎn)染EIAV Rev和pcDNA3.1后激活A(yù)P-1信號(hào)通路的倍數(shù)分別為1.0和0.8（圖1A）。Western blot 試驗(yàn)結(jié)果顯示：eqTRIM5α、EIAV Rev 蛋白大小分別為40 ku、20 ku，與預(yù)期大小一致（圖1B），表明熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果成立。熒光素酶試驗(yàn)表明eqTRIM5α 可以激活A(yù)P-1 信號(hào)通路，而EIAV Rev 則顯著抑制eqTRIM5α對(duì)AP-1 的激活作用（p＜0.01）。

2.2 EIAV Rev 對(duì)TRIM5α 下游轉(zhuǎn)導(dǎo)分子（TAK1、TAB2、P38、c-Jun）激活的AP-1 信號(hào)通路的檢測(cè)結(jié)果 為了進(jìn)一步研究EIAV Rev 負(fù)調(diào)控TRIM5α激活A(yù)P-1 信號(hào)通路的分子機(jī)制，本試驗(yàn)利用AP-1 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)EIAV Rev 對(duì)TRIM5α下游重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子TAK1、TAB2、P38、c-Jun 激活的AP-1 信號(hào)通路的影響。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組pEIAV-Rev-HA+pTAK1 組、pEIAV-Rev-HA+pTAB2 組、pEIAV-Rev-HA+pP38 組 和pEIAV-Rev-HA+pc-Jun 組 對(duì)AP-1 信號(hào)通路的激活倍數(shù)分別為7.7、0.1、0.6、9.8；對(duì)照組pTAK1+pcDNA3.1 組、pTAB2+pcDNA3.1 組、pP38+pcDNA3.1 組和pc-Jun+pcDNA3.1 組對(duì)AP-1 信號(hào)通路的激活倍數(shù)分別為60.0、1.5、6.3 及12.0；單轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 和 轉(zhuǎn) 染pEIAV-Rev-HA+pcDNA3.1 后 對(duì)AP-1 信號(hào)通路的激活倍數(shù)分別為1.0 和0.8?？梢?jiàn)，EIAV Rev 對(duì)TAK1、TAB2、P38 介導(dǎo)的AP-1 信號(hào)通路的激活作用分別下調(diào)了87%、93%、90%，而對(duì)于c-Jun 激活的AP-1 信號(hào)通路無(wú)明顯影響（p＞0.05）（圖2A、2B、2C、2D）。Western blot 試 驗(yàn) 結(jié) 果 顯 示：EIAV Rev、TAK1、TAB2、P38 和c-Jun 蛋白大小分別約為20 ku、78 ku、80 ku、40 ku 和43 ku，與預(yù)期大小一致（圖2E、2F、2G、2H），表明各蛋白均在293T細(xì)胞中得到了表達(dá)，熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果成立。熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果表明，EIAV Rev 對(duì)TAK1、TAB2、P38 介導(dǎo)的AP-1信號(hào)通路均有下調(diào)作用，而其對(duì)c-Jun激活的AP-1 信號(hào)通路的下調(diào)作用無(wú)明顯影響。

圖2 EIAV Rev 對(duì)TAK1（A、E）、TAB2（B、F）、P38（C、G）、c-Jun（D、H）激活的AP-1 熒光素酶試驗(yàn)和western blot 試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Effect of EIAV Rev protein on AP-1 luciferase activity and western blot activated by TAK1(A/E),TAB2(B/F),P38(C/G)and c-Jun（D/H）

2.3 EIAV Rev 對(duì)TRIM5α下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子（TAK1、TAB2、P38）蛋白表達(dá)水平的影響 為了進(jìn)一步確定EIAV Rev 是否通過(guò)影響P38 蛋白表達(dá)而發(fā)揮對(duì)AP-1 信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控作用，本研究通過(guò)共轉(zhuǎn)染試驗(yàn)經(jīng)western blot 檢測(cè)細(xì)胞中EIAVRev、TAK1、TAB2和P38 的表達(dá)，以β-actin 為內(nèi)參對(duì)照。結(jié)果顯示，EIAV Rev、TAK1、TAB2和P38分別約為20 ku、78 ku、80 ku、40 ku，與預(yù)期大小一致，而pEIAV-Rev-HA+pP38-Flag 組 與pcDNA3.1+pP38-Flag 組 相 比，前者的P38 蛋白表達(dá)顯著減少（圖3A）?；叶确治鼋Y(jié)果顯示，在過(guò)表達(dá)P38 的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染pEIAV-Rev-HA（Rev+）與未轉(zhuǎn)染pEIAV-Rev-HA（Rev-）相比，EIAV Rev 顯著降低P38 蛋白的表達(dá)水平；在共轉(zhuǎn)染TAK1、TAB2 的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染Rev+與Rev-均對(duì)TAK1 和TAB2 蛋白水平無(wú)明顯影響（圖3B）。結(jié)果表明，EIAV Rev 通過(guò)下調(diào)P38 蛋白表達(dá)發(fā)揮對(duì)AP-1 信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控作用。

2.4 蛋白酶體抑制劑恢復(fù)試驗(yàn)結(jié)果 為了明確EIAV Rev 對(duì)P38 蛋白的下調(diào)作用是否由蛋白酶的降解造成的，本研究將共轉(zhuǎn)染pP38-Flag+pEIAVRev-HA 的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組在轉(zhuǎn)染24 h 后分別加入蛋白酶體抑制劑MG132 和DMSO（作為對(duì)照組），陰性對(duì)照組（pP38-Flag+pcDNA3.1 組）加入DMSO，作用24 h后經(jīng)western blot 檢測(cè)。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中加MG132 組與只加DMSO 組相比，MG132 恢復(fù)了過(guò)表達(dá)Rev 后P38 蛋白的表達(dá)，且表達(dá)水平與陰性對(duì)照組一致（圖4A）?；叶确治鼋Y(jié)果顯示，加入MG132之后，P38 蛋白的表達(dá)量增加（圖4B）。結(jié)果表明，EIAV Rev 蛋白是通過(guò)蛋白酶體途徑降解P38 蛋白從而下調(diào)P38 蛋白的表達(dá)。

圖3 EIAV Rev 對(duì)TRIM5α下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子表達(dá)的影響（A）及灰度分析（B）Fig.3 Effect of EIAV Rev on the expression of TRIM5α down stream signal transduction factor(A)and grayscale analysis(B)

圖4 MG132 對(duì)P38 表達(dá)的恢復(fù)效果（A）及灰度分析（B）Fig.4 Effect of MG132 on P38 expression(A)and grayscale analysis(B)

3 討 論

TRIM5α是逆轉(zhuǎn)錄病毒衣殼的細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體，通過(guò)SPRY 結(jié)構(gòu)域特異性識(shí)別逆轉(zhuǎn)錄病毒的衣殼蛋白所形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，招募泛素結(jié)合酶復(fù)合體UBC13-UEV1A，并在其作用下催化形成游離的K63多聚泛素鏈，進(jìn)而在TAB2、TAB3 作用下活化TAK1，通過(guò)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活A(yù)P-1和NF-κB信號(hào)通路，使細(xì)胞處于抗病毒狀態(tài)[1]。不同種屬的TRIM5α基因翻譯的蛋白結(jié)構(gòu)差異很大，犬和貓的TRIM5α基因是不完整的，不具有抗病毒活性，研究報(bào)道TRIM5α需要通過(guò)SPRY結(jié)構(gòu)域結(jié)合病毒衣殼蛋白從而發(fā)揮抗病毒功能[5-7]。本實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道eqTRIM5α蛋白不具有完整的SPRY 結(jié)構(gòu)域，但過(guò)表達(dá)eqTRIM5α在293T 細(xì)胞中仍然可以抗EIAV 的感染[8]，也證明了過(guò)表達(dá)eqTRIM5α在293T 細(xì)胞中可以很好的激活天然免疫應(yīng)答，推測(cè)eqTRIM5α抗EIAV 活性依賴于其激活的天然免疫。

EIAV 隸屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬，主要感染馬巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致馬持續(xù)感染和反復(fù)的病毒血癥[9]，對(duì)馬行業(yè)影響重大。EIAV 是基因組最為簡(jiǎn)單的慢病毒且能造成潛伏感染，至今發(fā)現(xiàn)其僅包含Gag、Pol、Env 3 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白以及Tat、Rev、S2 3 個(gè)輔助蛋白。本實(shí)驗(yàn)室前期以EIAV 為模型病毒通過(guò)熒光素酶試驗(yàn)篩選到Rev 蛋白，并且首次發(fā)現(xiàn)Rev 蛋白可以顯著下調(diào)eqTRIM5α激活的AP-1 信號(hào)通路。Rev蛋白是EIAV 的重要輔助蛋白之一，主要承擔(dān)在病毒復(fù)制晚期向核外轉(zhuǎn)運(yùn)未完全剪切的mRNA 的作用，以促進(jìn)病毒的組裝[10]。該蛋白全長(zhǎng)為165 個(gè)氨基酸，主要包括精氨酸富集區(qū)、核定位信號(hào)、核輸出信號(hào)、RNA 結(jié)合域（ARM）[11]。

為探究Rev 蛋白負(fù)調(diào)控eqTRIM5α激活的AP-1信號(hào)通路的具體階段，將pcDNA3.1-EIAV-Rev-HA分別與TRIM5α 下游關(guān)鍵轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白TAK1、TAB2、P38 和c-Jun 基因的質(zhì)粒及AP-1 熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染HEK 293T 細(xì)胞。結(jié)果顯示EIAV-Rev 顯著抑制TAK1、TAB2 和P38 激活的AP-1 通路，而對(duì)c-Jun 激活的AP-1 通路無(wú)明顯影響，表明EIAV-Rev 對(duì)TRIM5α激活的AP-1 通路的負(fù)調(diào)控作用發(fā)生在p38 與c-Jun 之間。進(jìn)一步的western blot 試驗(yàn)表明EIAVRev 顯著抑制p38 蛋白的表達(dá)。并且加入蛋白酶體抑制劑MG132 則恢復(fù)了p38 蛋白的表達(dá)，表明EIAV Rev 蛋白通過(guò)蛋白酶體途徑降解P38 蛋白，導(dǎo)致依賴于P38 蛋白的AP-1 信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控作用。但是，Rev 怎樣直接或間接導(dǎo)致P38 蛋白的降解有待于進(jìn)一步研究，本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步理解EIAV 與宿主的相互作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。