孫思萌，侯美佳，馮啟崢，石 博，劉嘉利，師東方

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

感染性腹瀉是引起幼畜死亡的主要疾病，由產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）引起的仔豬黃痢和仔豬白痢、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）引起的豬水腫病和斷奶仔豬腹瀉嚴(yán)重影響仔豬健康[1-2]。ETEC 和STEC 通過菌毛（也稱為黏附素）黏附在宿主小腸絨毛上皮細(xì)胞，增殖并產(chǎn)生腸毒素（ST、LT）和志賀毒素變異體（Shiga toxin variantsⅡ，Stx2e），引發(fā)腹瀉、腸毒血癥，水腫和神經(jīng)癥狀[3-4]。菌毛能夠與宿主腸黏膜中的特異性受體結(jié)合使細(xì)菌能夠抵御腸道蠕動引發(fā)的沖刷作用，這是ETEC 致病的先決條件[5-6]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，大腸桿菌（E.coli）攜帶的黏附素基因與毒素基因呈正相關(guān)性，60%帶有毒素基因的E.coli 菌株均表達(dá)黏附素基因[7]。除黏附作用外，菌毛還具有其它生物學(xué)功能。研究表明，F(xiàn)4 菌毛蛋白可誘導(dǎo)Th17 相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)和B 細(xì)胞類別轉(zhuǎn)換，其主要亞基faeG 參與細(xì)菌生物膜的形成和細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)——群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）[8-9]。因此，對幼畜腹瀉物中分離的E.coli 鑒定時，除檢測腸毒素基因外，同時也要對分離菌的菌毛基因進(jìn)行檢測，有助于較全面地了解致病菌的生物學(xué)特性和流行病學(xué)溯源，對其致病機(jī)制和免疫機(jī)制研究也具有重要意義。

目前檢測E.coli 菌毛的方法有電子顯微鏡檢查法、D-甘露糖抵抗血凝與血凝抑制試驗、棉籽糖發(fā)酵試驗、細(xì)胞黏附試驗和免疫血清學(xué)技術(shù)及核酸探針技術(shù)[10]。由于菌毛分型較多，同型菌毛中還存在不同亞型，因此難以進(jìn)行快速鑒別[11]。上述方法均存在費(fèi)時費(fèi)力、特異性低等缺陷，而且需要進(jìn)行菌毛化培養(yǎng)。多重PCR 能夠通過一個反應(yīng)同時檢測多種微生物或檢測一種微生物的多個基因片段，具有成本低、操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用。張興民等建立的檢測致山羊腹瀉的4種病原菌的多重PCR 方法，孟相秋等建立的檢測ETEC 4 種腸毒素基因的多重PCR 方法[12-13]，顯著提高了對目的基因的檢測效率。

本研究建立了可同時檢測ETEC 常見的F 抗原（菌毛）F4（K88）、F5（K99）、F6（987P）、F41 和STEC 常見的F18 等5 種菌毛基因的多重PCR 方法，為ETEC 和STEC 菌毛的鑒定提供一種有效的檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 大腸桿菌參考菌株C83903（O141∶K85，K88ab）、C83915（O9∶K103，987P）、C83920（O101∶K30，K99、F41）、C83684（O139，F(xiàn)18）購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；E. coli DN48A（F17）、DN77C（F18ac）以及90 株E.coli 由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院獸醫(yī)傳染病學(xué)教研室從犢牛糞便中分離鑒定并保存；參考菌株豬霍亂沙門氏菌CVCC503、豬丹毒桿菌CVCC124、巴氏桿菌CVCC430 由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院藥理與毒理學(xué)教研室張秀英教授提供。Trans 2k Plus ⅡMolecularMarker、10×loading buffer、EasyTaqDNA 聚合酶（5 U/μL）、10×EasyTaq buffer（含Mg2+）、dNTPs（2.5 mmol/mL）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成 參照GenBank 中E.coli 菌毛基因保守序列設(shè)計5 對分別擴(kuò)增E. coli F4、F5、F6、F41、F18 菌毛保守基因的特異性引物，由哈爾濱新海工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1），各引物工作液濃度為20 μmol/L。

1.3 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 采用煮沸法提取1.1中所有細(xì)菌的DNA[13]，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采?5 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以E. coli 參考菌株C83903、C83915、C83920、C83684 的DNA 及其等比例混合物為模板，無菌去離子水為陰性對照，對影響PCR 的EasyTaq 聚合酶濃度、dNTPs 濃度、退火溫度以及延伸時間等因素進(jìn)行優(yōu)化。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以電泳條帶特異、清晰，引物二聚體最少的反應(yīng)條件為優(yōu)化的反應(yīng)條件。

表1 多重PCR 引物序列與靶基因擴(kuò)增長度Table 1 Multiplex PCR primer sequencesand the length of the target genes

1.4 特異性試驗 取參考菌株E. coli C83903、C83915、C83920、C83684 及其混合物、E. coli 分離菌株DN48A、豬霍亂沙門氏菌CVCC503、豬丹毒桿菌CVCC124 以及巴氏桿菌CVCC430 的DNA 作為模板進(jìn)行多重PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，評估該多重PCR 的特異性。

1.5 敏感性試驗 取37 ℃振搖過夜的參考菌株E. coli C83903、C83915、C83920、C83684 分別用滅菌生理鹽水做10-1～10-8連續(xù)稀釋，然后取各參考菌株不同稀釋度的菌液100 μL 涂布于LB 瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)16 h 后進(jìn)行菌落計數(shù)。同時取上述不同稀釋度的菌液各1 mL 制備DNA 模板，檢測多重PCR 的敏感性，并與常規(guī)PCR 敏感性相比較。常規(guī)PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：反應(yīng)體系為25 μL，其中10×EasyTaq buffer（含Mg2+）2.5 μL、2.5 mmol/mL dNTPs 2.0 μL、不同菌毛基因的上下游引物（20 μmol/L）各1 μL 共2 μL、5 U/μL EasyTaq DNA 聚合酶0.5 μL、DNA 模板各1 μL。用滅菌去離子水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃5 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃45 s、30 個循環(huán)；72 ℃7 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以檢測出菌毛基因所需的最低活菌數(shù)即為多重PCR 的檢測限。

1.6 重復(fù)性試驗 分別用3 個批次的EasyTaq buffer（含Mg2+）、dNTPs、EasyTaq DNA 聚合酶和上下游引物對參考菌株E. coli C83903、C83915、C83920、C83684 DNA 混合物進(jìn)行多重PCR 檢測，每個批次做3 個重復(fù)，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定多重PCR 方法的批內(nèi)和批間重復(fù)性。

1.7 臨床樣品檢測 實驗室前期以犢牛腹瀉糞便為樣品，于麥康凱瓊脂平板劃線分離E.coli，37 ℃培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取10～15 個粉紅色、表面光滑的圓形可疑菌落在麥康凱平板劃線純培養(yǎng)后，再經(jīng)生化鑒定和E.coli 持家基因（phoA）PCR 檢測，最終分離獲得90株E.coli。取上述90株E.coli分離株分別接種LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)16 h 后取1 mL 菌液用煮沸法制備DNA 作為模板，利用本試驗建立的多重PCR 檢測E.coli 菌毛基因，并用常規(guī)PCR 檢測驗證。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié) 果

2.1 優(yōu)化的多重PCR 反應(yīng)條件 經(jīng)優(yōu)化后的多重PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：反應(yīng)體系為25 μL，其中10×EasyTaq buffer（含Mg2+）2.5 μL、2.5 mmol/mL dNTPs 2.0 μL、5種菌毛基因的上下游引物（20 μmol/L）各1 μL 共10 μL、5 U/μL EasyTaq DNA 聚合酶1 μL、提取的4 株E.coli 參考菌株的DNA 模板各1 μL。用滅菌去離子水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃5 min；94 ℃30 s、60 ℃35 s、72 ℃90 s、30 個循環(huán)；72 ℃7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶清晰，大小分別為770 bp（F4）、533 bp（F5）、422 bp（F6）、643 bp（F41）、1 140 bp（F18），與預(yù)期大小一致。表明優(yōu)化后的反應(yīng)條件可同時擴(kuò)增出5 種菌毛的特異性基因片段。

2.2 特異性試驗 特異性試驗結(jié)果顯示，本實驗建立的多重PCR 僅從E. coli 參考菌株C83903、C83920、C83915、C83684、DN77C的DNA模板中擴(kuò)增出770 bp、533 bp 和643 bp、422 bp、1 140 bp、1 140 bp 的目的條帶，大小與預(yù)期一致，而從E.coli DN48A、豬霍亂沙門氏菌CVCC503、豬丹毒桿菌CVCC124、巴氏桿菌CVCC430 的DNA 模板中未擴(kuò)增到目的條帶（圖1）。表明該多重PCR 具有較強(qiáng)的特異性。

2.3 敏感性試驗 對參考菌株E.coli C83903（F4）、C83915（F6）、C83920（F5、F41）、C83684（F18）不同菌液不同稀釋度菌落數(shù)在30～300 之間的平板進(jìn)行菌落計數(shù)，當(dāng)C83903、C83915菌液稀釋度為10-5時結(jié)果為53 cfu、31 cfu，當(dāng)C83920、C83684 菌液稀釋度為10-6時結(jié)果為37 cfu、69 cfu，由此計算，各菌液中的活菌數(shù)分別為C83903：5.3×107cfu/mL、C83915：3.1×107cfu/mL、C83920：3.7×108cfu/mL、C83684：6.9×108cfu/mL。敏感性試驗結(jié)果顯示，本實驗建立的多重PCR 在5 種菌毛基因同時存在時對F41 基因的最小檢出活菌數(shù)為3.7×107cfu/mL；對F4、F5、F6和F18 基因的最小檢出活菌數(shù)分別為5.3×105cfu/mL、3.7×106cfu/mL、3.1×105cfu/mL、6.9×105cfu/mL（圖2，表2）。

圖1 多重PCR 特異性試驗結(jié)果Fig.1 The result of specificity test for the multiplex PCR method

圖2 多重PCR 敏感性試驗結(jié)果Fig.2 The result of sensitivity test for the multiplex PCR method

表2 多重PCR 敏感性試驗分組及結(jié)果Table 2 The groupings and results of sensitivity test for multiplex PCR system

常規(guī)PCR對F4、F5、F6、F41和F18菌毛基因的最小檢出活菌數(shù)分別為5.3×102cfu/mL、3.7×103cfu/mL、3.1 × 103cfu/mL、 3.7 × 104cfu/mL 和6.9 × 104cfu/mL（圖3）。上述結(jié)果表明本實驗建立的多重PCR 方法同時檢出5 種菌毛基因所需的活菌數(shù)最小為3.7×107cfu/mL。

圖3 常規(guī)PCR 敏感性試驗結(jié)果Fig.3 The results of sensitivity test for conventional PCR system

2.4 重復(fù)性試驗 利用同一批次和不同批次的引物和試劑對4 種參考菌株DNA 混合物的多重PCR 檢測結(jié)果顯示，均能擴(kuò)增出與預(yù)期相符的特異性條帶（圖4），表明該檢測方法有很好的批內(nèi)重復(fù)性和批間重復(fù)性。

2.5 臨床樣本檢測 采用建立的多重PCR 方法對90 株E.coli 分離株進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，其中F4 陽性率為3.33%（3/90），F(xiàn)5 陽性率為2.22%（2/90），未檢測到F6、F41 和F18 陽性菌株，其試驗結(jié)果與常規(guī)PCR 檢測結(jié)果一致，表明該方法可用于E.coli 分離株菌毛基因的檢測。

圖4 多重PCR 重復(fù)性試驗結(jié)果Fig.4 The results of reproducibility test for the multiplex PCR method

3 討 論

多重PCR 是在常規(guī)PCR 基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種可同時檢測多個目基因的方法，與常規(guī)PCR 技術(shù)相比，多重PCR 具有一次檢出多個目的基因、節(jié)約時間及實驗成本的優(yōu)點(diǎn)，但其體系更加復(fù)雜，可能存在多對引物之間形成引物二聚體；引物與非目的基因序列的結(jié)合產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增；延伸時間不足導(dǎo)致目的片段得不到充分的擴(kuò)增；多重PCR 反應(yīng)產(chǎn)物在低濃度凝膠中電泳難以分離等問題[14]。本實驗通過BLAST 和GenBank 序列數(shù)據(jù)庫確定每條引物（共10 條）的特異性，通過梯度PCR 確定最適退火溫度使不同的目的基因片段均能被較好的擴(kuò)增，同時延長延伸時間并增加體系內(nèi)DNA 聚合酶的量以確保充分?jǐn)U增目的基因。F4 菌毛的引物在50 ℃～60 ℃時均能擴(kuò)增出特異性條帶，而F5、F6、F41、F18 的引物在55 ℃～65 ℃能產(chǎn)生特異且單一的條帶，因此將多重PCR 退火溫度設(shè)定于60 ℃，與Casey 等檢測9種大腸桿菌毒力因子時所用延伸時間相同，退火時間略短，退火溫度高于其選擇的55 ℃以保證所有基因的特異性擴(kuò)增[15]。段新華等建立的4 重PCR 方法，擴(kuò)增的菌毛基因片段大小僅相差66 bp[16]，結(jié)果不易分辨，本實驗中各目的片段大小相差均超過100 bp，易于通過電泳分離。此外，通過序列比對發(fā)現(xiàn)，組成K88 菌毛的faeG 基因1 bp～86 bp 的序列與F41 基因58 bp～146 bp 的序列相似性可達(dá)85%，段新華等設(shè)計的F41 上游引物即處于這段區(qū)域，本實驗設(shè)計引物時避開了這段序列，避免在多個模板同時存在時對引物產(chǎn)生干擾，發(fā)生非特異性擴(kuò)增[16]。本實驗建立的多重PCR 方法檢測F41 菌毛基因的最小活菌數(shù)為3.7×107cfu/mL，敏感性明顯低于常規(guī)PCR，然而，經(jīng)37 ℃200 r/min 振蕩培養(yǎng)16 h 的E.coli菌液濃度即可達(dá)108cfu/mL，完全能夠滿足多重PCR的檢測要求。本實驗建立的E.coli 菌毛基因5 重PCR檢測方法的敏感性與華榮虹等建立的E.coli 菌毛基因4 重PCR 檢測方法的敏感性基本一致[17]。初步應(yīng)用本實驗建立的多重PCR 檢測方法對本實驗室前期從犢牛腹瀉糞便樣品中分離的90 株E.coli 分離株的菌毛基因進(jìn)行了檢測，僅檢測到3 株E.coli 攜帶F4基因，2 株E.coli 攜帶F5 基因，沒有檢測到F6、F41和F18 基因。引起犢牛腹瀉的病因較多，僅病原微生物就有病毒、細(xì)菌和寄生蟲，從檢測結(jié)果分析，雖然E.coli 分離株均來自犢牛腹瀉糞便，但引起腹瀉的主要病原可能是病毒或寄生蟲。另外，攜帶F6基因的ETEC 主要引起仔豬腹瀉，攜帶F18 基因的STEC 主要引起仔豬水腫病和斷奶仔豬腹瀉，在犢牛腹瀉糞便中常檢測不到。

E.coli 菌毛種類繁多，某些菌毛又包含不同的亞型，因此用血清學(xué)方法鑒別較為困難。F18 菌毛由FedA、FedB、FedC、FedE、FedF 亞單位組成，該菌毛有兩種亞型，分別為F18ab 和F18ac。對F18ab 和F18ac 菌株fedE、fedF 基因的多樣性分析顯示，fedE 基因的序列具有高度保守性，fedF 基因在289 bp～518 bp 堿基序列之間具有高度保守性[18-19]，因此本研究根據(jù)fedE 和fedF 基因保守序列設(shè)計了引物，試驗證明所設(shè)計的引物對F18ab 和F18ac 型菌毛基因均能檢出。F4 菌毛由FaeA、FaeB、FaeC、FaeD、FaeE、FaeF、FaeG、FaeH、FaeI、FaeJ 共10 個亞單位組成，其可分為3 種亞型：F4ab、F4ac、F4ad。faeG 基因是F4 菌毛的主要結(jié)構(gòu)蛋白亞單位基因，直接參與和易感宿主腸上皮細(xì)胞大分子受體的特異性結(jié)合，任士飛等人對faeG 基因克隆分析后發(fā)現(xiàn)F4ab、F4ac 和F4ad 的faeG 序列存在2 處主要堿基序列差異，第1 處在304 bp～306 bp 堿基序列中，第2處在491 bp～499 bp 堿基序列之間[20]。本實驗在設(shè)計引物時避開了這兩處序列，而在faeG 基因兩端最保守的部分設(shè)計特異性引物，并利用Primer5 軟件和BLAST 比對GenBank 數(shù)據(jù)庫中大量菌毛基因的參考序列，證實了引物區(qū)的序列保守性以確保該引物能檢測F4 菌毛所有亞型的基因。

本實驗建立的多重PCR 方法能特異性擴(kuò)增目的基因，并產(chǎn)生彼此差異超過100 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物，可通過2%瓊脂糖凝膠電泳分離，所有的陰性對照均未擴(kuò)增出任何條帶，同時也表現(xiàn)出很好的敏感性和重復(fù)性。對90 株從犢牛糞便中分離的E.coli 的檢測表明該多重PCR 的檢測結(jié)果與常規(guī)PCR 的檢測結(jié)果完全相同，且該方法明顯提高了檢測效率，可以用于臨床檢測。該多重PCR 方法具有較好的特異性和敏感性，希望能在E.coli 快速分離鑒定、流行病學(xué)調(diào)查和疾病診斷中發(fā)揮作用。