楊 倩，魏文燕，汪開毓,2*，劉 韜，何晟毓，謝 恒，李良玉，劉家星

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 魚病研究中心，四川 成都 611130；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物疾病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130；3. 四川成都市農(nóng)林科學(xué)院 水產(chǎn)研究所，四川 成都 611130）

世界鮭魚養(yǎng)殖已有200 多年的歷史，目前已成為僅次鯉科魚和羅非魚后的世界第三大主要經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類。我國鮭魚養(yǎng)殖品種主要為虹鱒魚（Oncorhynchusmykiss），年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的1%以下，每年都需要大量進(jìn)口[1]。現(xiàn)階段我國正在加快開發(fā)冷水魚資源，擴(kuò)大鮭魚的養(yǎng)殖范圍與規(guī)模，實(shí)現(xiàn)鮭魚養(yǎng)殖的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。然而，病毒性疾病卻成為制約鮭魚水產(chǎn)養(yǎng)殖進(jìn)一步擴(kuò)大的主要因素之一[2-3]。

大量研究證明了干擾素（IFN）在動物抗病毒反應(yīng)中的重要性。魚類中病毒誘導(dǎo)的IFN 暫且定義為Ⅰ型IFN，它們通過和哺乳動物I 型IFN 相同的Jak/STAT 信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)抗病毒基因的表達(dá)[4-5]。目前發(fā)現(xiàn)的虹鱒Ⅰ型IFN 可以細(xì)分為6 個(gè)亞組，IFNa、IFNb、IFNc、IFNd、IFNe 和IFNf[6]。IFNa 是鮭魚中最早發(fā)現(xiàn)的I 型IFN[7]。研究表明，病毒感染會誘導(dǎo)鮭魚IFNa 基因的大量表達(dá)，如傳染性鮭魚貧血病毒（ISAV）感染會增加IFNa 在TO 細(xì)胞系和鮭魚幼魚中的轉(zhuǎn)錄水平[8-9]，IFNa 可能在鮭魚的抗病毒反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。病毒對抗生素治療不敏感，疫苗的研制則需要考慮病毒變異和多樣性，而IFN 因其高效廣譜的抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)活性，常作為藥物被廣泛的應(yīng)用于臨床。目前利用基因工程生產(chǎn)IFN已成為了獲取IFN 的主要方法[10-11]。因此本研究克隆表達(dá)了具有生物活性的虹鱒IFNa，以期為后續(xù)虹鱒病毒性疾病的防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及主要試劑 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a（+）購自美國Invitrogen公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司；Prime ScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time）購自TaKaRa 公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ購自德國Thermo Fisher 公司；Bio-ScaleTMMini NuviaTM IMAC Ni-Charged（1×5 mL）購自美國Bio-Rad 公司。RTG-2 細(xì)胞由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局惠贈。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 中登錄的IFNa 基因（AM489418）核苷酸序列，設(shè)計(jì)PCR 引物：IFNa-F：5'-GAATTCGACTGGATCCGACACCACTAC-3'（EcoRⅠ）/IFNa-R：5'-GCTCGAGGTACATCTGTGCCGCAAGGA T-3'（XhoⅠ），預(yù)期擴(kuò)增片段為453 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 虹鱒IFNa 基因的擴(kuò)增及重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建采用氯仿法提取虹鱒腎臟總RNA，利用Prime ScriptTMRT reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并以此cDNA 為模板，利用上述引物擴(kuò)增IFNa 基因。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s、57 ℃30 s、72 ℃1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min；4 ℃結(jié)束反應(yīng)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。按照DNA 膠回收試劑盒說明書純化目的片段，回收純化的PCR 產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ與XhoⅠ酶切后克隆至pET-32a（+）載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a（+）-IFNa。重組質(zhì)粒pET-32a（+）-IFNa 再經(jīng)單酶切（EcoRⅠ）和雙酶切（EcoRⅠ和XhoⅠ）鑒定正確后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 重組IFNa 蛋白的表達(dá)、純化及鑒定 將重組質(zhì)粒pET-32a（+）-IFNa 轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)至OD600nm值約0.6，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)4 h。收集菌體，超聲破碎細(xì)胞，離心后分別收集上清與沉淀，10%SDS-PAGE 凝膠電泳檢測目的蛋白的可溶性。按照Bio-Rad 中高壓層析系統(tǒng)操作說明進(jìn)行純化。純化后的rIFNa 蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，以小鼠抗6×His 標(biāo) 簽 抗 體（1∶10 000）為 一 抗，山 羊 抗 鼠IgG-HRP（1∶8 000）為二抗，進(jìn)行western blot 鑒定。最后將純化后的rIFNa 蛋白置于PBS 緩沖液中經(jīng)4 ℃低溫透析復(fù)性，檢測蛋白濃度，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后分裝，-80 ℃存儲備用。

1.5 重組IFNa 蛋白的抗病毒活性檢測 將RTG-2細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待鋪滿單層細(xì)胞后，每孔加入10 倍倍比稀釋的rIFNa 蛋白孵育12 h。利用1×104pfu/mL 濃度的傳染性造血器官壞死病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV）進(jìn)行感染，每孔200 μL，細(xì)胞對照則加無病毒的營養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)置pET-32a（+）空載體蛋白對照組。IHNV 感染5 d后，采用結(jié)晶紫溶液染色觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 虹鱒IFNa 基因的擴(kuò)增及重組表達(dá)載體的構(gòu)建利用PCR對虹鱒IFNa基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出約400 bp的目的條帶，與預(yù)期目的片段相符，初步確定為目的片段（圖1）。構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a（+）-IFNa采用單酶切（EcoRⅠ）和雙酶切（EcoRⅠ和XhoⅠ）進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示，EcoRⅠ單酶切得到約6 000 bp 的DNA 條帶，EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切得到約5 900 bp 的載體片段和約400 bp 的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。測序結(jié)果顯示插入基因位置與閱讀框均正確。本次克隆所得虹鱒IFNa 基因序列與NCBI 中已登錄的虹鱒IFNa 基因的序列存在一定差異，氨基酸序列同源性為98%，推測導(dǎo)致該差異的原因可能是地域性因素引起的虹鱒種質(zhì)資源之間的變化。

圖1 IFNa 基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒pET-32a（+）-IFNa 的酶切鑒定Fig.1 Amplification of IFNa gene and identification of recombinant plasmid pET-32a(+)-IFNa

2.2 重組IFNa 蛋白的表達(dá)、純化及鑒定 將pET-32a（+）-IFNa 重組菌經(jīng)IPTG 在37 ℃條件下誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE 檢測，結(jié)果顯示有35 ku 的蛋白條帶（圖2），與預(yù)測目的蛋白加標(biāo)簽蛋白大小基本一致，并且能夠在上清液中表達(dá)，表明該重組質(zhì)粒在大腸桿菌中獲得了可溶性表達(dá)。重組蛋白經(jīng)純化后進(jìn)行western blot 檢測，結(jié)果顯示rIFNa 蛋白大小與預(yù)期相符，表明重組質(zhì)粒pET-32a（+）-IFNa 能夠在BL21 中正確表達(dá)。由于目前對魚類IFN 分子方面的研究起步較晚，在測定魚類IFN 抗病毒活性方面尚無統(tǒng)一規(guī)定，因此很難比較不同魚類重組IFN 之間的活性高低。而此次表達(dá)的rIFNa 蛋白最大的優(yōu)勢在于獲得了部分可溶性表達(dá)，由于蛋白質(zhì)體外復(fù)性過程往往費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且不經(jīng)濟(jì)，rIFNa 蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)則具有一定的生產(chǎn)應(yīng)用前景。

2.3 重組IFNa 蛋白的抗病毒活性檢測 經(jīng)檢測，復(fù)性后的rIFNa 蛋白濃度約為0.5 mg/mL。采用細(xì)胞病變抑制法分析rIFNa 蛋白抗IHNV 活性，結(jié)果顯示，當(dāng)rIFNa 蛋白工作濃度在100 μg/mL 時(shí)才有約不到10%的細(xì)胞病變，未加rIFNa 蛋白的細(xì)胞對照孔和pET-32a（+）空載體蛋白對照孔則出現(xiàn)了嚴(yán)重細(xì)胞病變（圖3）。表明pET-32a（+）編碼的融合標(biāo)簽蛋白不具備相應(yīng)的抗病毒活性，而且不影響rIFNa 蛋白本身的抗病毒活性。大量研究也證實(shí)利用pET-32a（+）載體表達(dá)的IFN 具備較好的抗病毒活性[12-14]，表明其載體上的融合標(biāo)簽蛋白并不影響IFN 的生物學(xué)活性。IFN效價(jià)計(jì)算一般以能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞免受病毒侵害的最高稀釋度為一個(gè)單位，當(dāng)rIFNa 蛋白在0.1 μg/mL 時(shí)幾乎就能保護(hù)半數(shù)的細(xì)胞免受感染，由此可知rIFNa蛋白活性約為1×104U/mg，表明原核表達(dá)的虹鱒rIFNa 蛋白具有良好的抗病毒活性。

圖2 重組IFNa 蛋白表達(dá)的鑒定Fig.2 Identification of recombinant IFNa protein expression

圖3 不同濃度rIFNa 體外抗IHNV 病變效應(yīng)圖Fig. 3 The cytopathic effect of IHNV infection antagonised by the different concentrations of rIFNa proteins

與哺乳動物中的直系同源物一樣，IFN 系統(tǒng)的預(yù)先激活均會有效抑制魚類病毒的復(fù)制[15-16]。本研究預(yù)先用rIFNa 蛋白刺激RTG-2 細(xì)胞12 h 后感染IHNV，結(jié)果表明rIFNa 蛋白具有較好的抗IHNV 活性，表明rIFNa 蛋白可能是一種潛在的免疫增強(qiáng)劑。因此，本研究結(jié)果為虹鱒基因工程IFN 制劑的生產(chǎn)應(yīng)用奠定了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)，也為魚類廣譜抗病毒生物制劑的研制提供了重要的參考材料。