高菽蔓，靳紅亮,2，張守峰，劉 曄，扈榮良*

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春 130122；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118)

犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus，CPIV)又稱副流感病毒5 型(Parainfluenza Virus 5，PIV5)，為單股負(fù)鏈不分節(jié)段RNA 病毒，屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)，副黏病毒亞科(Paramyxovirinae)，腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)，與同屬的猴病毒5 型(Simian virus 5，SV5)[1]、人SV5 分離株及人副流感病毒II 型(Human paramyxovirus type 2，hPIV2)抗原性密切相關(guān)，性質(zhì)相似[2]。各年齡段的犬均可以感染，是犬窩咳的主要病原之一[3]，幼犬對該病毒最易感，并且發(fā)病急，傳播快，病毒呈世界性分布，貓、倉鼠、豚鼠、豬均有感染報道[4]。

隨著反向遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，眾多病毒基因組成為具有巨大開發(fā)潛力的病毒活載體工具。研究表明，PIV5 極具作為開發(fā)新型疫苗的候選病毒載體[5]。PIV5 基因組大小為15 246 nt，從3' 端到5' 端編碼產(chǎn)生7～8 種常見結(jié)構(gòu)蛋白，包括核衣殼蛋白(NP)、V 蛋白(V)、磷酸化蛋白(P)、膜基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、小疏水性蛋白(SH,該蛋白在某些副流感病毒5 型中不存在[6])、血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)、聚合酶蛋白(L)，其中NP 基因高度保守[7]。

本研究對本實(shí)驗(yàn)室保存的CPIV CC-14 株進(jìn)行了全基因組的克隆、測序與NP 基因編碼區(qū)序列分析，充實(shí)了我國PIV5 基因組數(shù)據(jù)信息，為以PIV5 為載體的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 CPIV CC-14 株和MDCK 細(xì)胞均由軍事獸醫(yī)研究所流行病學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。Simply P 總RNA 提取試劑盒購自BioFlux 公司；膠回收試劑盒購自Axygen 公司；pMD18-T 載體購自TaKaRa公司。

1.2 引物設(shè)計及合成 參照SV5 全基因組序列，設(shè)計覆蓋CPIV CC-14 株基因組全長的14 對引物(表1)，引物由金唯智生物技術(shù)有限公司合成。

表1 CPIV 全基因組克隆引物Table 1 The primers of complete genome of CPIV

1.3 病毒全基因組的擴(kuò)增及克隆 按照Simply P總RNA 提取試劑盒說明書方法提取CPIV 細(xì)胞毒的總RNA，以各片段上游引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以其為模板進(jìn)行各基因片段的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆于pMD18-T 載體中，構(gòu)建14 個重組質(zhì)粒。

1.4 DNA 序列的測定和分析 重組質(zhì)粒由吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與Gen-Bank 中登錄的其他PIV5 序列進(jìn)行比對分析，利用DNAStar 軟件完成序列拼接并基于NP 基因編碼區(qū)核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行同源比對分析，采用MEGA 5.2 軟件繪制系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 CPIV CC-14 株全基因組克隆及序列分析 采用設(shè)計的14 對引物PCR 擴(kuò)增CPIV 各片段，并分別克隆于pMD18-T 載體中，構(gòu)建14 個重組質(zhì)粒。對其進(jìn)行測序、拼接及分析，結(jié)果顯示CPIV CC-14株全基因組序列長度為15 246 nt(KP893891)。這是國內(nèi)首次完成對CPIV 全基因組的克隆測序。

CPIV CC-14 株基因組具有PIV5 典型組成結(jié)構(gòu)，包括3' 引導(dǎo)序列(Leader sequence，即3'-UTR)、編碼7 個結(jié)構(gòu)蛋白(NP、V、M、F、HN、L)的6 段基因(表2)以及5' 末端序列(Tailer sequence，即5'-UTR)。其中3'-UTR 長55 bp，位于1 nt～55 nt，5'-UTR 長31 bp，位于15 216 nt～15 246 nt。該病毒每個基因均具有保守的轉(zhuǎn)錄起始信號和轉(zhuǎn)錄終止信號序列，這些保守序列參與mRNA 的起始和終止，是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號。各基因間均由基因間隔序列隔開，間隔序列較為保守，并且不構(gòu)成mRNA 成分。

據(jù)報道，SH 蛋白能夠抑制TNF-α 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程[8]，某些犬源和豬源的PIV5 SH 基因發(fā)生變異，無法編碼SH 基因，即不能產(chǎn)生小疏水蛋白，因此該蛋白對于病毒感染犬和豬是非必需的[6]。本研究對CPIV CC-14 株進(jìn)行全基因組測序，結(jié)果顯示該病毒不編碼SH 基因，該基因的缺失是否影響病毒與宿主之間相互作用等還有待進(jìn)一步研究。

CPIV CC-14 株的NP 基因長度為1 530 nt，位于全基因組的152 nt～1 681 nt，編碼NP 蛋白，為病毒核糖核蛋白體(Ribonucleoproteins,RNPs)的組成部分之一。有研究表明，副黏病毒科N 蛋白含有一個高度保守的中間區(qū)域F-X4-Y-X3-φ-S-φ-A-M，其中X 表示任意氨基酸殘基，φ 表示芳香族氨基酸，該區(qū)域與N-N 自我組裝以及N-RNA 相互作用有關(guān)。本研究CPIV CC-14 株恰好具有323FAAANYPLLY SYAM336氨基酸序列特征，與其相符合。

表2 CPIV CC-14 株基因組編碼蛋白Table 2 The encoding proteins of CPIV strain CC-14

2.2 基于NP 基因系統(tǒng)發(fā)生分析 本研究將CPIV CC-14 株與GenBank 中登錄的17 株P(guān)IV5 NP 基因編碼區(qū)序列進(jìn)行同源比對和系統(tǒng)發(fā)生分析。結(jié)果顯示，CPIV CC-14 株與GenBank 登錄的其他17 株P(guān)IV5 參考病毒株NP 基因核苷酸同源性為97.25 %～99.80 %，其中與英國豬源SER 株及長春牛源PV5-BC14 株同源性相同且最高，為99.80 %；與韓國犬源D277 株核苷酸同源性最低，為97.25 %。氨基酸同源性比較結(jié)果顯示，CPIV CC-14 株與17 株P(guān)IV5 參考病毒株NP 基因氨基酸同源性為98.62 %～99.80 %，與長春牛源PV5-BC14、美國猴源SV5、英國恒河猴源W3A、英國犬源CPI+及CPI-同源性相同且最高，為99.80 %；與韓國2 株犬源PIV5(D277 和08-1990)氨基酸同源性最低，為98.62 %。

利用MEGA 5.2 軟件基于NP 基因構(gòu)建并繪制系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹，分析結(jié)果顯示，CPIV CC-14 株與長春牛源PV5-BC14 株同屬一個分支，親緣關(guān)系最近；與韓國2 株犬源PIV5(D277 和08-1990)親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖1)。

本研究單獨(dú)對NP 基因進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增后，結(jié)果顯示，不同批次間NP 基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果之間存在個別堿基突變，甚至提前出現(xiàn)終止密碼子，造成個別氨基酸突變等，這些氨基酸突變是否影響病毒包裝和復(fù)制等，還有待進(jìn)一步研究。

本研究明確了CPIV CC-14 株的全基因背景，為以該病毒株為載體進(jìn)行重組疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

圖1 基于PIV5 NP 基因的系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of NP gene of PIV5 constructed with Neighbor Joining method

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