熊和麗，宋建領(lǐng)，王金萍，苗海生，李華春

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

藍(lán)舌病是由藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的嚴(yán)重危害牛、羊等反芻動(dòng)物的蟲媒病毒病，在熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)分布廣泛。該病主要侵害綿羊，尤其對純種細(xì)毛羊敏感，發(fā)病率約30 %，部分血清型死亡率高達(dá)80 %。BTV 屬于呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬病毒，病毒粒子呈二十面體對稱，由10 個(gè)分節(jié)段的雙股RNA 組成，病毒基因組由19 200 bp 組成，編碼7 種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1-VP7)和4種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NS3a 和NS3b)，總分子量為1.3×104ku，是迄今認(rèn)為分子量最大的RNA 病毒[1]。病毒顆粒外層衣殼由VP2 和VP5 兩種蛋白組成，其中VP2 由L2 基因編碼，是病毒的主要型特異性抗原和血凝素蛋白[2]，與病毒的毒力、受體結(jié)合[3-5]、細(xì)胞吸附作用和宿主特異性免疫有關(guān)[6-7]，VP2 蛋白長956 個(gè)氨基酸、不同血清型VP2 序列差異最大，約占病毒總蛋白的40 %。因此，對VP2蛋白表位的研究具有重要的意義，將對構(gòu)建有效的亞單位疫苗、型特異性診斷方法提供科學(xué)依據(jù)，為該病的防控奠定理論基礎(chǔ)。本研究在獲得BTV1 特異性抗體的基礎(chǔ)上，應(yīng)用BTV1 特異性抗體淘選M13 噬菌體展示的7 肽隨機(jī)肽庫，獲得與BTV1 特異性抗體結(jié)合的噬菌體擬位，比對分析噬菌體擬位的共有序列，在病毒VP2 蛋白中查找相同(似)區(qū)域，結(jié)合不同噬菌體擬位與BTV1 特異性抗體的免疫反應(yīng)性分析結(jié)果，進(jìn)行VP2 蛋白表(擬)位分析。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 利用蔗糖密度梯度離心純化BTV1病毒，將純化的病毒用MEM 液稀釋為50 μg/mL 抗原含量，滅活、乳化，免疫綿羊，制備BTV1 高免血清，經(jīng)硫酸銨沉淀法純化，純化后血清中和效價(jià)為1∶512，并且與其他血清型BTV 無交叉反應(yīng)。

藍(lán)舌病陰性對照抗體和BTV 由本實(shí)驗(yàn)室保存；包被重組蛋白G 的磁性珠、噬菌體展示的7 肽隨機(jī)肽庫和ER2738 大腸埃希氏菌購自美國Beverly New England 生物實(shí)驗(yàn)室；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗M13 抗體購自Amersham-Pharmacia 公司。

1.2 肽庫庫容量滴定及評(píng)價(jià) 利用TBS 將待滴定肽庫作10-1～10-12稀釋，取100 μL 稀釋液與100 μL處于對數(shù)生長期的ER2738 大腸埃希氏菌懸液混合，室溫孵育20 min 后，加至3 mL 融化后于42 ℃水浴箱保溫的Agarose Top(頂層瓊脂糖營養(yǎng)液)，立即涂布LB/Agar/Tet/X-gal/IPTG 平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，滴定噬菌體蝕斑形成單位(pfu)，計(jì)算噬菌體濃度。隨機(jī)挑選20 個(gè)藍(lán)色的孤立蝕斑對攜帶的插入序列進(jìn)行測序，評(píng)價(jià)7 肽插入序列的隨機(jī)性和肽庫的庫容量。

1.3 生物淘選 參照7 肽隨機(jī)肽庫試劑盒說明及文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行，并做部分調(diào)整。10 μL BTV 1 型特異性抗體、30 μL 噬菌體肽庫(約含9×1010pfu)及160 μL 含2 %脫脂奶粉的TBS(pH7.5)混合，室溫震蕩孵育30 min，與蛋白G 包被磁性珠混合，室溫震蕩孵育20 min，緩沖液洗滌，用100 μL 0.2 mol/L HCl(pH2.2)溶液(含1 mg/mL BSA)洗脫結(jié)合于磁性珠上的噬菌體，并迅速中和至中性。對每一輪淘選獲得的洗脫液，除少量稀釋后按1.2 方法涂布平板，其余用ER2738 增殖、純化后，進(jìn)行下一輪淘選。第2 輪和第3 輪分別使用5 μL 和2 μL BTV1 型 特異性抗體，以增強(qiáng)淘選的特異性。經(jīng)3 輪“淘選--擴(kuò)增--淘選”，可富集與BTV1 型特異性抗體特異性結(jié)合的噬菌體。

1.4 噬菌體克隆的ELISA 檢測 在第3 輪淘選后涂布的平板上分別隨機(jī)挑選48 個(gè)孤立的藍(lán)色噬菌體蝕斑，增殖培養(yǎng)后，以BTV1 特異性抗體及陰性對照BTC 陰性抗體為包被抗體，HRP 標(biāo)記的鼠抗M13 抗體為檢測抗體，OPD 為底物，進(jìn)行ELISA 檢測。當(dāng)樣品針對BTV1 特異性抗體OD490nm值與針對陰性抗體的OD490nm值存在2 倍或2 倍以上差異時(shí)，判為陽性。

1.5 外源插入多肽序列分析 根據(jù)野生型噬菌體pIII 基因中對所有fd-tet 衍生載體均保守的區(qū)域，設(shè)計(jì)引物 FUSE-U：5'-GCAAGCTGATAAACCGATA C-3'/FUSE-D：5'-CCATGTACCGTAACACTGAG-3'，經(jīng)PCR 擴(kuò)增包含外源插入多肽序列(7 肽編碼序列)的基因片段(產(chǎn)物大小約330 bp)，PCR 產(chǎn)物純化后，以FUSE-D 為引物進(jìn)行測序。采用DNAMAN Version 5.2.2 軟件進(jìn)行序列比對，分析7 肽序列中的共有序列。

1.6 競爭性ELISA 以BTV1 特異性抗體為包被抗體，BTV1 和BTV16 抗原為競爭劑或阻斷劑，同時(shí)設(shè)BHK 細(xì)胞凍融裂解液為緩沖液對照，HRP 標(biāo)記的抗M13 抗體為檢測抗體，OPD 為底物，對噬菌體擬位進(jìn)行競爭性ELISA 分析。檢測OD490nm值。按以下公式計(jì)算抑制率：抑制率(%)=(OD490nm緩沖液對照-OD490nm試驗(yàn))/OD490nm緩沖液對照×100 %。設(shè)置陽性、陰性及空白對照，同步進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體展示隨機(jī)肽庫的庫容量評(píng)價(jià) 通過肽庫庫容量滴定，顯示肽庫噬菌體濃度為8.8×1011pfu/mL。隨機(jī)挑選20 個(gè)克隆的序列比對分析結(jié)果顯示：20個(gè)噬菌體克隆中有1 個(gè)無插入序列，其余19 個(gè)克隆展示的7 肽序列各不相同，并且序列與序列之間無相同(相似或共有)序列。

2.2 BTV1 特異性抗體淘選獲得噬菌體克隆的ELISA分析 BTV1 特異性抗體第3 輪淘選獲得的噬菌體洗脫液，經(jīng)稀釋涂布培養(yǎng)后，隨機(jī)挑選96 個(gè)蝕斑增殖培養(yǎng)，經(jīng)ELISA 檢測與BTV1 特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合的噬菌體克隆，結(jié)果顯示58 個(gè)噬菌體克隆為陽性，部分檢測結(jié)果見圖1。

圖1 BTV1 特異性抗體淘選后噬菌體克隆ELISA 分析Fig.1 ELISA analysis of phage clones after panning by serotype-specific antibody against BTV1

2.3 陽性噬菌體克隆外源插入序列的PCR 擴(kuò)增挑選24 個(gè)陽性噬菌體克隆，經(jīng)PCR 擴(kuò)增包含外源插入序列(7 肽編碼序列)的基因片段，分別獲得大小約330 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)。

2.4 陽性噬菌體克隆展示的7 肽序列比對分析對第3 輪淘選后的24 個(gè)陽性噬菌體，經(jīng)PCR 擴(kuò)增純化后進(jìn)行測序，根據(jù)獲得的核苷酸序列推導(dǎo)7 肽氨基酸序列，結(jié)果表明24 個(gè)陽性克隆展示的7 肽氨基酸序列在有11 種不同的7 肽序列，TPNDHQT 11個(gè)(11/24)、SPNSSDK 4 個(gè)(4/24)、TSTPNEQ 1 個(gè)(1/24)、TTTPNAT 1 個(gè)(1/24)、TTTPNSF 1 個(gè)(1/24)、MTTPNDK 1 個(gè)(1/24)、TPNDHQT 1 個(gè)(1/24)、FKQNPNQ 1 個(gè)(1/24)、AVKDNVS 1 個(gè)(1/24)、QPDASNN 1 個(gè)(1/24)、PYNKYAP 1 個(gè)(1/24)。含有共有序列TPN 的有16 個(gè)7 肽序列，共有序列PN 的有21 個(gè)7 肽序 列(表1)。經(jīng)比較分析，在BTV1 VP2蛋白的第865 位氨基酸至873 位氨基酸序列為865THPNKCLVA873，與獲得BTV1 特異性抗體識(shí)別的共有序列TPN 相似。

圖2 陽性噬菌體克隆插入序列PCR 擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of insert sequence from positive phage clones

表1 淘選后噬菌體展示的7 肽序列比對分析Table 1 Alignment of peptide sequences displayed by phage after panning

2.4 競爭性ELISA 檢測 對噬菌體擬位(TPNDHQT)進(jìn)行競爭性ELISA 分析，結(jié)果顯示：在緩沖液空白對照成立的前提下，噬菌體擬位(TPNDHQT)與BTV1 特異性抗體間的結(jié)合，能夠被BTV1 特異性抑制或阻斷，抑制率隨病毒抗原濃度降低而降低，而不能被BTV16 抑制或阻斷(圖3)。BTV1 VP2蛋白865THPN868與淘選的噬菌體共有序列TPN 相似。BTV 其他22 個(gè)亞型病毒阻斷結(jié)果證明：BTV12 和BTV22 也能阻斷7 肽TTTPNSF 與BTV1 陽性血清的結(jié)合，其他20 個(gè)血清型BTV 均不能阻斷7 肽TTTPNSF 與BTV1 陽性血清的結(jié)合。

3 討論

圖3 噬菌體擬位(KVMDRWL)競爭性ELISA 分析Fig.3 Analysis of phage mimotope(NLPHLRTHTALS)by competitive ELSIA

VP2 蛋白是BTV 主要型特異性抗原，大多數(shù)能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的抗原表位均存在于VP2 蛋白上，國內(nèi)有采用單克隆抗體進(jìn)行BTV VP2 抗原表位鑒定的報(bào)告[8-9]。采用多克隆抗體也可篩選獲得具有免疫原性的噬菌體克隆，Mennuni 等采用糖尿病恢復(fù)期病人血清中的免疫球蛋白獲得多個(gè)對糖尿病特異的多肽片段[10]。采用分子生物學(xué)軟件預(yù)測病毒蛋白可能的表位區(qū)域，需要進(jìn)一步研究確證。采用噬菌體肽庫進(jìn)行病毒表位分析，可獲得表位及其關(guān)鍵性氨基酸準(zhǔn)確定位結(jié)果[11]。

本研究采用針對BTV1 特異性抗體淘選獲得共有序列TPN 與BTV1 VP2 蛋白865THPN868與淘選的噬菌體共有序列TPN 相似。經(jīng)ELISA、競爭性ELISA 分析，攜帶TPN 基序的噬菌體能與BTV1 特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合，并且該結(jié)合能被天然病毒抗原特異性抑制或阻斷，表明TPN 序列及其側(cè)翼序列真實(shí)模擬病毒蛋白上與BTV1 特異性抗體結(jié)合的抗原決定簇或表位的結(jié)構(gòu)和功能，提示BTV1 VP2 蛋白865THPN868氨基酸區(qū)域構(gòu)成BTV1 特異性表位。使用BTV1～24 的24 個(gè)血清型病毒對噬菌體擬位TTTPNSF 進(jìn)行阻斷分析，結(jié)果表明BTV12 和BTV22 也能阻斷7 肽TTTPNSF 與BTV1 陽性血清的結(jié)合，其他21 個(gè)血清型BTV 均不能阻斷7 肽TTTPNSF 與BTV1 陽性血清的結(jié)合。通過序列比對分析，發(fā)現(xiàn)BTV1、BTV12、BTV22 的VP2 蛋白均含有共有序列TPN，但其他21 個(gè)血清型BTV VP2蛋白均不含有共有序列TPN，BTV1、BTV12 和BTV22 可能存在共有的表位氨基酸序列。這與Maan 等研究結(jié)果不同血清型BTV 具有相同的核酸型相一致[12]。本研究結(jié)果將為BTV1 基因工程疫苗開發(fā)和型特異性診斷方法的建立奠定基礎(chǔ)。

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