王廣操，崔鵬超，何 玉，張夢(mèng)巖，苑文濤，王先煒

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

豬細(xì)小病毒 3型(Porcine parvovirus 3，PPV3)已相繼于香港[1]， 德國(guó)[2]、 羅馬尼亞[3]和匈牙利[4]等地區(qū)和國(guó)家報(bào)道。PPV3屬于Hokovirus屬，基因進(jìn)化樹(shù)顯示PPV3與人細(xì)小病毒4型、5型(PARV4/5)和牛細(xì)小病毒4型(Bovine parvovirus，BPV4)的同源性很高，3者處于同一進(jìn)化分支[5-6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)該病的感染率越來(lái)越高，并且存在突破種屬屏障的可能。Cadar報(bào)道稱，2006年～2007年 PPV3在羅馬尼亞的檢出率為22.8%，2010年～2011年檢出率為50.5%[7]；Csa'gola等認(rèn)為PPV3正處在突破種屬屏障、逐漸適應(yīng)新宿主的過(guò)程[8]。感染范圍廣、適應(yīng)能力強(qiáng)是PPV3的主要特征。

目前PPV3的檢測(cè)方法研究局限于PCR檢測(cè)和基因測(cè)序。研究表明，PPV3的結(jié)構(gòu)蛋白能夠識(shí)別不同宿主細(xì)胞的特異性受體，這對(duì)其侵入機(jī)體起著至關(guān)重要的作用[9]。因此，本研究通過(guò)原核表達(dá)PPV3 VP2蛋白的主要抗原表位區(qū)蛋白，初步建立了檢測(cè)PPV3的間接ELISA方法，為PPV3早期感染的提供了有效的檢測(cè)方法。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 pET-28a載體、E.coliDH5α、E.coliBL21均由本實(shí)驗(yàn)室保存；PPV3陰、陽(yáng)性血清和376份血清均篩選自臨床送檢樣品；豬瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬圓環(huán)病毒 2型(PCV2)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬繁殖障礙與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒 1型(PPV1)和PPV2等陽(yáng)性血清均由本實(shí)驗(yàn)制備保存。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；限制性內(nèi)切酶、2×Taq Master Mix、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker均購(gòu)自TaKaRa公司；DNA回收試劑盒購(gòu)自上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Biomiga公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成 參照GenBank中登錄的PPV3 VP2基因序列(KC701330.1)，采用DNAStar軟件對(duì)VP2結(jié)構(gòu)蛋白的親水性、可及性及抗原性指數(shù)進(jìn)行分析，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物擴(kuò)增VP2蛋白的主要抗原表位編碼區(qū)，預(yù)期擴(kuò)增片段為540 bp。引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，引物序列為：5'-CCCGGATCCATGGGAC GAGAGTTT-3'(BamHⅠ)/5'-TTCGTCGACTTAGCCG GTATAACTT-3'(SalⅠ)。

1.3 目的片段的擴(kuò)增及克隆 采用酚氯仿法提取病毒基因組為模板，PCR反應(yīng)條件為：95℃5 min；94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 40 s； 72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ/SalⅠ酶切后克隆至pET-28a載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-540。

1.4 重組蛋白的表達(dá)、純化及鑒定 將重組質(zhì)粒pET-540轉(zhuǎn)化至受體菌BL21，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.6～0.8，經(jīng)終濃度為0.8 mM 的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h。于4℃離心收集菌體，超聲波裂解后分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析其表達(dá)形式。重組蛋白(rVP2)經(jīng)純化后進(jìn)行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)印至NC膜，以PPV3陽(yáng)性血清(1∶100)為一抗， HRP-SPA(1∶10000)為二抗， 進(jìn)行western blot鑒定。

1.5 間接ELISA方法的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化采用方陣滴定法，將抗原和血清按不同濃度進(jìn)行倍比稀釋，確定最佳包被濃度和最佳血清稀釋度?？乖鞍紫♂尳K濃度分別為 0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、4.0 μg/mL 和 8.0 μg/mL，血清稀釋度依次為 1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400和 0(空白對(duì)照)。以陽(yáng)性血清 OD450nm值介于1.0～1.2和陰性血清 OD450nm值低于 0.1，并且 P/N值最大的孔所對(duì)應(yīng)的抗原包被濃度和血清稀釋度為最佳抗原包被濃度和最佳血清稀釋度。

同時(shí)對(duì)抗原包被時(shí)間、封閉液的選擇及作用時(shí)間、最佳一抗作用時(shí)間、酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)和作用時(shí)間、顯色液和顯色時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化。

1.6 臨界值的確定 采用已建立的ELISA方法篩選出40份PPV3陰性血清(OD450nm<0.25)。根據(jù)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)原理計(jì)算OD450nm的平均值()和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，并以此確定血清樣品為陽(yáng)性或陰性的臨界值：若檢測(cè)樣品的OD450nm≥±3SD則為陽(yáng)性，OD450nm<±2SD則為陰性，介于兩者之間為可疑。

1.7 特異性試驗(yàn) 采用建立的ELISA方法，分別檢測(cè) CSFV、FMDV、PCV2、PRV、PRRSV、PPV1和PPV2的陽(yáng)性血清，同時(shí)設(shè)立PPV3陽(yáng)性、陰性對(duì)照，檢測(cè)該方法特異性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 采用同一批次表達(dá)純化的rVP2包被酶標(biāo)板，按照已建立的ELISA方法對(duì)3份陽(yáng)性血清(強(qiáng)陽(yáng)、中陽(yáng)和弱陽(yáng))和2份陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，每份樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)。同時(shí)使用3個(gè)不同批次表達(dá)純化的rVP2同時(shí)包被酶標(biāo)板，進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)。

1.9 臨床血清樣品的檢測(cè) 利用建立的間接ELISA方法對(duì)來(lái)自江蘇、山東、浙江、安徽、四川和廣東等地的376份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，收集數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 以提取的PPV3 DNA為模板，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增獲得約為540 bp的目的片段，與預(yù)期相符(圖略)。將其克隆至原核表達(dá)載體pET-28a中，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ/SalⅠ酶切鑒定，結(jié)果表明重組質(zhì)粒pET-540構(gòu)建正確。

2.2 重組蛋白的表達(dá)、純化及鑒定 將重組質(zhì)粒pET-540經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示有40 ku的蛋白條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，表明rVP2得到了表達(dá)，并且以包涵體的形式存在(圖1A)。采用常規(guī)包涵體純化方法制備純化的重組蛋白。Western blot結(jié)果顯示該重組蛋白可以與PPV3陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性(圖 1B)。

圖1 重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE(A)檢測(cè)和western blot(B)鑒定Fig.1 Detection and identification of the recombinant VP2 expression by SDS-PAGE(A)and western blot(B)

2.3 間接ELISA方法的建立

2.3.1 最佳反應(yīng)條件的確定 經(jīng)方陣滴定試驗(yàn)，最終確定該間接ELISA的最優(yōu)反應(yīng)條件見(jiàn)表1。37℃顯色6 min。

表1 間接ELISA檢測(cè)方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Table 1 The optimized conditions of the indirect ELISA

2.3.2 臨界值的確定 采用建立的間接ELISA方法檢測(cè)40份陰性血清，結(jié)果顯示：血清的為0.194，SD為0.041，因此+3SD和+2SD分別為0.317和0.276，即當(dāng)血清OD450nm值大于0.317時(shí)判定為陽(yáng)性，小于0.276時(shí)判定為陰性，介于兩者之間時(shí)為可疑(圖 2)。

圖2 陰性血清OD450nm值分布圖Fig.2 OD450nmvalue of negative sera distribution

2.4 特異性試驗(yàn) 使用建立的ELISA方法同時(shí)檢測(cè) CSFV、FMDV、PCV2、PRV、PPV1、PPV2和PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，結(jié)果顯示除PPV3陽(yáng)性血清為陽(yáng)性外，其余病原血清的OD450nm值均為陰性(表2)，表明該方法具有良好的特異性。

表2 間接ELISA的特異性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of specificity test of indirect ELISA

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 使用同一批次和3個(gè)不同批次表達(dá)純化的rVP2包被酶標(biāo)板，以建立的ELISA方法檢測(cè)。結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于10%，表明該方法具有良好的重復(fù)性(表3)。

表3 間接ELISA重復(fù)性試驗(yàn)(n=6)Table 3 Repeatability assay for indirect ELISA(n=6)

2.6 臨床血清樣品的檢測(cè) 利用建立的間接ELISA方法對(duì)376份臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示其中PPV3陽(yáng)性血清105份(強(qiáng)陽(yáng)性63份，弱陽(yáng)性42份)，疑似陽(yáng)性血清18份，陰性血清253份。PPV3抗體陽(yáng)性檢出率為27.9%，表明我國(guó)PPV3的感染較為嚴(yán)重，本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA方法可用于PPV3的臨床檢測(cè)。

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于PPV3的檢測(cè)主要以PCR檢測(cè)和血清學(xué)試驗(yàn)為主，但步驟繁瑣，對(duì)設(shè)備要求較高，不適合批量檢測(cè)，而間接ELISA方法不僅敏感度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，而且具有低成本和易操作等優(yōu)點(diǎn)，已在臨床檢測(cè)中廣泛應(yīng)用[10]。目前，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)關(guān)于PPV3 ELISA檢測(cè)方法的報(bào)道，因此本實(shí)驗(yàn)建立了PPV3的ELISA方法，以期為該病的防制與檢測(cè)提供新的技術(shù)手段。

PPV3 VP2是該病毒最為重要的核衣殼結(jié)構(gòu)蛋白，本實(shí)驗(yàn)室前期表達(dá)了VP2全蛋白和一段截短蛋白，但VP2全蛋白表達(dá)量低并且純化效果不好，不適合大量表達(dá)和建立ELISA方法，而選用的截短序列為VP2中高度保守的一段，并且具有良好的親水性和免疫原性，因此選用rVP2作為檢測(cè)PPV3相關(guān)抗體的抗原。

本研究采用原核表達(dá)載體pET-28a表達(dá)重組蛋白并對(duì)其純化，有效去除了菌體蛋白，獲得純度較高的目的蛋白，提高了該方法的準(zhǔn)確性。通?？乖陌粷舛冗^(guò)高會(huì)造成抗原分子的多層化，進(jìn)而導(dǎo)致抗原-抗體復(fù)合物容易被洗掉，若抗原包被濃度過(guò)低，酶標(biāo)板表面會(huì)出現(xiàn)未被抗原吸附的空位，易出現(xiàn)假陰性[9,11]。本研究通過(guò)原核表達(dá)PPV3截短蛋白作為ELISA診斷抗原，通過(guò)對(duì)不同反應(yīng)條件的反復(fù)摸索，確立了間接ELISA方法的最佳反應(yīng)條件，并具有高度的特異性和良好的重復(fù)性。將該方法應(yīng)用于豬臨床血清的檢測(cè)，結(jié)果表明目前我國(guó)普遍存在PPV3的感染。

本研究通過(guò)原核表達(dá)PPV3 VP2截短蛋白作為包被抗原，初步建立了臨床檢測(cè)PPV3的間接ELISA方法，為臨床檢測(cè)血清和進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。

[1]Li Sheng-bin,Wei Yan-wu,Liu Jian-bo,et al.Prevalence of porcine hokovirus and its co-infection with porcine circovirus 2 in China[J].Arch Virol,2013,158(9):1987-1991.

[2]Adlhoch C,Kaiser M,EllerBrok H,et al.High prevalence of porcine Hokovirus in German wild Boar populations[J].Virol J,2010,7:171.

[3]Cadar D,Csagola A,Lorincz M,et al.Distribution and genetic diversity of porcine hokovirus in wild Boars[J].Arch Virol,2011,156(12):2233-2239.

[4]Cheung A K,Guang Wu,David Wang,et al.Identification and molecular cloning of a novel porcine parvovirus[J].Arch Virol,2010,155(5):801-806.

[5]Huang Lv,Zhai Shao-lun,Cheung A K,et al.Detection of a novel porcine parvovirus,PPV4,in Chinese swine herds[J].Virol J,2010,7:333.

[6]Cheng Wei-xia,Li Jin-song,Huang Can-ping,et al.Identification and nearly full-length genome characterization of novel porcine Bocaviruses[J].PLoS One,2010,5(10):e13583.

[7]Zhai Shao-lun,Yue Chen,Wei Zu-zhang,et al.High prevalence of a novel porcine Bocavirus in weanling piglets with respiratory tract symptoms in China[J].Arch Virol,2010,155(8):1313-1317.

[8]Wang Fang,Wei Yong-wei,Zhu Chun,et al.Novel parvovirus suBlineage in the family of parvoviridae[J].Virus Genes,2010,41(2):305-308.

[9]Blomstrom A L,Belak S,Fossum C,et al.Detection of a novel porcine Boca-like virus in the background of porcine circovirus type 2 induced postweaning multisystemic wasting syndrome[J].Virus Res,2009,146(1-2):125-129.

[10]趙剛，李剛，陳鐵橋，等.狂犬病病毒P基因的原核表達(dá)及間接ELISA方法的應(yīng)用[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2010，26(2)：163-167.

[11]Csagola A,Lorincz M,Cadar D,et al.Detection,prevalence and analysis of emerging porcine parvovirus infections[J].Arch Virol,2012,157(6):1003-1010.