郭 燕，竇文超，趙廣英

(浙江工商大學 食品與生物工程學院/浙江省食品安全重點實驗室，浙江 杭州 310018)

奶牛乳腺炎是奶牛場最常見、經濟損失最嚴重的疾病之一，其中作為發(fā)病率較高的隱性乳腺炎，無明顯的臨床癥狀，但如不及時確診和治療，可影響奶的質量和安全。在致奶牛乳腺炎的病原微生物中，金黃色葡萄球菌(Staphylococus aureus)是引起奶牛乳腺炎最為主要的病原菌[1]，因此建立S.aureus性乳腺炎的快速診斷方法十分必要。

利用便攜式電流型葡萄糖傳感器(Personal Amperometric Glucose Meter，簡稱血糖儀)檢測血糖，具有儀器價格低，操作簡單，便攜等優(yōu)點[2]，現(xiàn)已成為一項成熟技術并被廣泛地應用于糖尿病患者的血糖監(jiān)控[3]。由于該技術的諸多優(yōu)點，已引起其他領域研究者的關注。例如，通過利用蔗糖酶標記功能DNA 檢測非葡萄糖(Glucose，Glc)的目標物，包括DNA、生物標記物、小分子毒素和金屬離子[4-7]，這些方法雖然有效地擴大了血糖儀的檢測范圍，但使用的DNA、抗體以及酶標記物等生物制劑的制備較繁瑣，活性等易受貯存時間和貯存環(huán)境等條件作用而降低，影響檢測結果的準確性。因此，探求借鑒于血糖儀的更加簡便、準確和穩(wěn)定的檢測體系很有意義。本研究將血糖儀應用于S.aureus 的定性和定量初步快速檢測，避免了使用DNA、抗體、酶等生物制劑，建立了一種簡便、快速、穩(wěn)定、靈敏和經濟的S.aureus 定性和定量初步快速檢測技術，為奶牛乳腺炎的臨床診斷提供了新的檢測方法。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 S.aureus(ZJGSMC1S0605)、大腸埃希氏菌(E.coli,ATCC 8739)、枯草芽孢桿菌(B.Subtilis，ATCC 6633)、蠟樣芽孢桿菌(B.cereus,ATCC 10987)、阪崎腸桿菌(E.sakazakii，ATCC 29544)、副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus，ZIGSFSL 1P0901)、沙門氏菌(Salmonella，CMCC 50770)、費式檸檬酸桿菌(C.freundii，ATCC 43864)、腐敗希瓦氏菌(S.putrefaciens，ATCC 8071)均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；雞白痢沙門氏菌(S.pullorum，79-1)購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心；檢測用培養(yǎng)基：Glc-Baird-Parker 培養(yǎng)液、Glc-7.5 % NaCl 肉湯培養(yǎng)基和Glc-7.5 % NaCl-Baird-Parker 培養(yǎng)液均由本實驗室制備；On Call Plus 血糖儀、血糖測試條購自艾康生物技術有限公司。

1.2 檢測用培養(yǎng)基的選擇與改進

1.2.1 培養(yǎng)基的初步確定 基于培養(yǎng)基的選擇原則[8-11]，初步確定Baird-Parker 培養(yǎng)液和7.5 % NaCl 肉湯為基礎培養(yǎng)基以確保對目的菌的高選擇性，經研究確定需要添加Glc 的適宜初始濃度后，即可作為后期研究用培養(yǎng)基，根據(jù)研究結果，經進一步選擇或改進后，即可確定作為快速檢測目標菌的專用培養(yǎng)基。

1.2.2 菌種液的制備 將S.aureus 斜面菌種接種于50 mL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37±1 ℃下靜置培養(yǎng)20 h，作菌種培養(yǎng)液(國標法[8]測得S.aureus 含量為108cfu/mL)。

1.2.3 培養(yǎng)基中Glc 初始濃度的選擇 在血糖儀可測Glc 濃度范圍內，分別配制Glc 濃度為5.0 mmol/L、10.0 mmol/L、15.0 mmol/L、20.0 mmol/L 的Baird-Parker 培養(yǎng)液和7.5 % NaCl 肉湯培養(yǎng)基各50 mL 于錐形瓶中，分別從每個錐形瓶移取5 mL 培養(yǎng)液于試管中，再分別吸取1 mL 種子液加于上述培養(yǎng)液中，混勻，于37±1 ℃下振蕩培養(yǎng)，分別按對應時間(0 h，2 h，4 h，6 h，8 h)將試管取出，通過血糖儀及其配套酶修飾電極測定培養(yǎng)物中Glc 的濃度，并計算Glc 濃度變化的差值ΔC[ΔC=C1-C2，其中C1為培養(yǎng)物中0 h 測得的Glc 濃度，C2為同一培養(yǎng)物中一定待確定測試條件(如菌液濃度、pH 值、培養(yǎng)溫度等)下培養(yǎng)一定時間測得的Glc 濃度。

1.3 菌液濃度及培養(yǎng)時間的選擇 在多支試管中分別加入5 mL 各含適量Glc 的上述兩種培養(yǎng)基，使用生理鹽水將菌種液稀釋至濃度為101cfu/mL～108cfu/mL，分別取1 mL 加至上述試管中，混勻，于37±1 ℃下振蕩培養(yǎng)，分別按對應時間(0 h、2 h、4 h、6 h、8 h)將試管取出，利用血糖儀及其配套酶修飾電極測定培養(yǎng)液中Glc 濃度。

1.4 測試底液最適pH 值的選擇 將濃度為108cfu/mL 的菌種液分別加入pH 值6.0～8.0 并含適量Glc 的上述兩種培養(yǎng)基中，混勻，于37±1 ℃下振蕩培養(yǎng)，分別在0 h 和培養(yǎng)最佳檢測時間，使用血糖儀及其配套酶修飾電極測定培養(yǎng)液中Glc 濃度，計算培養(yǎng)前后培養(yǎng)物中Glc 濃度變化的差值，并確定最適pH 值。

1.5 最適培養(yǎng)溫度的選擇 將濃度為108cfu/mL 的菌液分別加至含適量Glc 的上述兩種培養(yǎng)基中，混勻，分別在30±1 ℃～45±1 ℃下振蕩培養(yǎng)，在0 h和培養(yǎng)最佳檢測時間，通過血糖儀及其配套酶修飾電極測定培養(yǎng)液中Glc 濃度，計算培養(yǎng)前后培養(yǎng)物中Glc 濃度變化的差值，并確定最適培養(yǎng)溫度。

1.6 特異性試驗 選取濃度108cfu/mL 大腸埃希氏菌、副溶血性弧菌、阪崎腸桿菌、雞白痢沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、費式檸檬酸桿菌及腐敗希瓦氏菌進行特異性試驗。在最適條件下，采用血糖儀及其配套酶修飾電極對含有不同菌的培養(yǎng)液進行Glc 濃度的檢測，分別在0 h和最佳培養(yǎng)檢測時間檢測每個菌液的Glc 濃度，計算前后培養(yǎng)物中Glc 濃度變化的差值，并對比分析，必要時進行深入的改進研究。

1.7 標準曲線建立與驗證試驗

1.7.1 標準曲線建立 將菌種液進行101～107倍稀釋，在最適條件下，使用血糖儀及其配套酶修飾電極對不同濃度菌液培養(yǎng)物中的Glc 濃度進行測定，分別在0 h 和最佳培養(yǎng)檢測時間檢測每個菌液稀釋度的Glc 濃度，計算前后培養(yǎng)物中Glc 濃度變化的差值，對照國家標準BG47891.0-2010[8]計數(shù)S.aureus的含量，制作標準曲線。

1.7.2 驗證試驗 對照S.aureus 國標檢測方法中第二法的Baird-Parker 平板計數(shù)法檢測計數(shù)不同濃度菌液樣品，驗證標準曲線的準確性。

1.8 抗干擾性試驗 在多支試管中分別加入5 mL含適量Glc 的7.5 % NaCl 肉湯-Baird-Parker 培養(yǎng)液，先接種濃度為108cfu/mL 的S.aureus 1 mL，再分別接種1 mL 濃度為108cfu/mL 大腸埃希氏菌、副溶血性弧菌、阪崎腸桿菌、雞白痢沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、費式檸檬酸桿菌及腐敗希瓦氏菌。以接種2 mL 濃度為108cfu/mL S.aureus 為對照?；靹蚝笾糜?7 ℃培養(yǎng)，分別在0 h和最佳培養(yǎng)檢測時間采用血糖儀及其配套酶修飾電極檢測每個菌液的Glc 濃度，計算前后培養(yǎng)物中Glc 濃度變化的差值，并進行對比。

1.9 準確性試驗 將市售5 種牛奶樣品共75 份，分別隨機加入S.aureus 制備人工模擬試驗樣品，試驗樣品中的S.aureus 濃度在101cfu/mL～105cfu/mL，采用血糖儀進行檢測，并將檢測結果與國標法進行對比。

2 結果

2.1 檢測條件的確定 為獲得最佳檢測效果，我們通過實驗對培養(yǎng)基/培養(yǎng)物中Glc 初始濃度、檢測時間、培養(yǎng)基pH 值及培養(yǎng)溫度進行優(yōu)化，結果如表1 所示。對于培養(yǎng)基/培養(yǎng)物中Glc 初始濃度的確定，濃度為108cfu/mL 菌種液置于不同濃度的Glc-Baird-Parker 液體培養(yǎng)物和Glc-7.5 % NaCl 肉湯培養(yǎng)物中，分別在不同時間(0 h，2 h，4 h，6 h，8 h)采用血糖儀測定培養(yǎng)物中Glc 濃度，得出的計算結果顯示，Glc-Baird-Parker 培養(yǎng)物中，20.0 mmol/L的培養(yǎng)物中Glc 濃度變化的差值(ΔC)最大、最明顯，而在Glc-7.5% NaCl 肉湯培養(yǎng)物中，Glc 初始濃度為15.0 mmol/L 時，培養(yǎng)物中ΔC 最大、最明顯。因此，結果如圖1 所示，在后續(xù)研究中選擇Baird-Parker 培養(yǎng)液的Glc 的初始濃度為20.0 mmol/L，7.5%NaCl 肉湯培養(yǎng)基的Glc 的初始濃度為15.0 mmol/L。對于檢測時間的確定，培養(yǎng)物中ΔC 隨菌液濃度的增加也相應增大，且都隨培養(yǎng)時間的增長而增大，培養(yǎng)6 h 時Glc 濃度已與0 h 有較明顯差別，因此，確定檢測培養(yǎng)時間為6 h。如S.aureus 含量過少，培養(yǎng)6 h 后ΔC 過小難以判定時可延長培養(yǎng)時間至24 h，差值會變大而易于計數(shù)。對于適宜pH 和適宜溫度的確定，pH 值7.4 時，ΔC 值達最大，即變化最明顯，因此選擇培養(yǎng)液pH7.4。培養(yǎng)溫度為37±1 ℃時，ΔC 達最大值，因此最適培養(yǎng)溫度選擇37±1 ℃。

2.2 特異性的測定 為驗證該方法的特異性，在最佳檢測條件下，對10 種致病菌進行了檢測，結果顯示，除B.cereus 和B.subtilis 培養(yǎng)物中ΔC 變化較大，其它幾種菌培養(yǎng)物中ΔC 變化不明顯(圖1A)，分析認為是Glc-Baird-Parker 培養(yǎng)基的選擇性不強所致。V.parahaemolyticus 培養(yǎng)物中ΔC 變化沒有其它幾種菌明顯，但較S.aureus 的明顯要小(圖1B)，分析認為V.parahaemolyticus 是嗜鹽性細菌，使它培養(yǎng)物中的ΔC 變化沒其它幾種菌的ΔC 變化大，但它在此鹽濃度下受到了生長抑制而導致消耗Glc量明顯少于S.aureus 消耗的。圖1A 和圖1B 顯示，這兩種培養(yǎng)基不能實現(xiàn)對S.aureus 嚴格的特異性選擇，而特異性是衡量檢測方法優(yōu)劣的一個非常重要的指標，好的檢測方法在特異性方面應該達到高標準。為此，根據(jù)相關文獻[12-13]，進一步總結、分析和研究，設計一種新型改良培養(yǎng)液，測試結果如圖1C 所示：S.aureus 的ΔC 值遠大于其它致病菌的，特異性較好。因此確定該培養(yǎng)液為血糖儀及其配套酶修飾電極測定S.aureus 的專用培養(yǎng)基，定名為“便攜式血糖儀專用改良Baird-Parker 培養(yǎng)液(PGMmodified Baird-Parker liquid culture medium)”。

表1 檢測條件的確定Table 1 Optimization of the measurement conditions

圖1 特異性試驗Fig.1 Specificity tests of the PGM

2.3 標準曲線設定與驗證

2.3.1 線性關系與標準曲線設定 最佳條件下培養(yǎng)6 h 后檢測得目標菌不同基礎含量與ΔC 在103cfu/mL～107cfu/mL(國標方法測得)，與菌液濃度的對數(shù)成良好線性關系(圖2A)，線性方程：ΔC=0.74 lg[cfu·ml-1]-0.75，相關系數(shù)為0.992，檢出下限為2.6×102cfu/mL(S/N=3)。對菌含量少于檢出限者可延長培養(yǎng)時間至24 h，菌液濃度為101cfu/mL～102cfu/mL 檢測獲得的ΔC 如圖2B 所示，保證滿足計數(shù)要求，線性方程：ΔC=2.92 lg[cfu·ml-1]-2.93，相關系數(shù)為0.993，檢出限為2.3×101cfu/mL(S/N=3)。

圖2 Glc 濃度變化(ΔC)與S.aureus 濃度對數(shù)的關系Fig.2 The standard curve between the logarithmic value of S.aureus concentration and the change of the glucose concentration(ΔC)in culture medium under optimal condition

2.3.2 標準曲線驗證 將新建立的方法對照標準方法的檢測結果進行相關性分析后建立線性回歸模型(圖3)，結果表明對于S.aureus 含量在101cfu/mL～107cfu/mL 的樣品，血糖儀快速檢測法和國標法檢測結果的相關性良好，即快速檢測方法是可行的。

圖3 兩種檢測方法的對數(shù)值標準曲線Fig.3 The logarithmic standard curve by Baird-Parker and PGM

2.4 抗干擾能力檢驗 評定在同一個培養(yǎng)物中共存的其它種類細菌可能產生的對血糖儀快速檢測S.aureus 結果準確性的影響的試驗結果顯示，在S.aureus和其它幾種菌的接種量均為108cfu/mL 時，S.aureus與對照組的ΔC 差距不大(圖4)。因此，這幾種菌的存在，對S.aureus 檢測結果的影響很小，表明該檢測體系的抗干擾能力強。

圖4 干擾性試驗Fig.4 Detection of S.aureus in the presence of other bacteria

2.5 準確性 為驗證該方法的準確性，將人工制備的模擬樣品，在最佳條件下，分別用該方法與國標法對各樣品進行檢測，結果顯示，與國標法相比，該方法具有較高的準確率(表2)，兩者符合率為94.67 %，表明血糖儀可以用于臨床牛奶樣品中S.aureus 的檢測。

表2 國標法與血糖儀方法檢測結果對照Table 2 Comparisons of two methods for S.aureus detections

3 討論

S.aureus 是最常引起奶牛乳腺炎的細菌，在S.aureus 感染引起的奶牛乳腺炎中存在著不同程度的乳腺纖維化，嚴重的導致乳腺硬化，最終失去泌乳功能[1]，而且S.aureus 一旦在畜群中定植則很難或幾乎不能根除，同時它也是乳腺炎復發(fā)和使宿主機體終生帶菌的主要原因[14]。因此，對引起奶牛乳腺炎的S.aureus 進行快速檢測十分重要，將血糖儀用于快速檢測致奶牛乳腺炎S.aureus 具有簡便、快速、靈敏、經濟安全等優(yōu)勢。該方法將乳汁樣品直接混入改良Baird-Parker 培養(yǎng)液中，不用增菌和分純培養(yǎng)，37±1 ℃培養(yǎng)，目標菌含量在103cfu/mL 以上培養(yǎng)6 h，在101cfu/mL～102cfu/mL 培養(yǎng)24 h，即可直接對培養(yǎng)物進行檢測，經計算可獲得S.aureus的定性和定量檢測結果；并且不需要貴重儀器、耗材和試劑，檢測一份樣品僅需人民幣2～3 元，不需要接觸和釋放有毒有害試劑。

本研究采用血糖儀及其配套酶修飾電極，對改良Baird-Parker 培養(yǎng)液接種待測樣品的37±1 ℃的6 h培養(yǎng)物進行檢測和計算，通過獲得的Glc 濃度變化的差值ΔC，對S.aureus 即可實現(xiàn)初步快速檢測，又可實現(xiàn)在103cfu/mL～107cfu/mL 濃度范圍內的定量快速檢測，檢出限為2.6×102cfu/mL(S/N=3)；將培養(yǎng)時間延長至24 h 再檢測，即可實現(xiàn)對于101cfu/mL～102cfu/mL 濃度菌液樣品的初步快速檢測，檢出限為2.3×101cfu/mL(S/N=3)。由此證明，血糖儀及其配套酶修飾電極能夠初步快速定性和定量檢測改良Baird-Parker 培養(yǎng)液6 h/24 h 培養(yǎng)物中的S.aureus，具有非常簡便、快速和經濟的顯著突出優(yōu)點，為獸醫(yī)臨床對致奶牛乳腺炎S.aureus 的快速檢測提供了方法。

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