周 謖 ，李 睿，朱鴻雁，張志超，方 靜，唐黎明，

(1．上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203；2．化妝品監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203)

鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，也稱(chēng)作Ames試驗(yàn)，由Bruce Ames教授于1970年建立[1]。Ames試驗(yàn)是一個(gè)廣泛應(yīng)用的通過(guò)細(xì)菌檢測(cè)化合物突變性的試驗(yàn)，通常使用營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)。它可以檢測(cè)90%的化學(xué)致癌物和非致癌物[2]。由于此試驗(yàn)方便、快捷、檢出率高，因此已被各大實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。

Ames試驗(yàn)中最主要的試驗(yàn)材料就是過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，菌液的濃度、活性對(duì)試驗(yàn)的結(jié)果影響很大。諸多試驗(yàn)規(guī)范和參考文獻(xiàn)中列出了對(duì)菌液濃度的要求為活菌數(shù)(1～2)×109個(gè)/mL[2-3]，雖然作出了這項(xiàng)規(guī)定，但如何獲得此濃度的菌液仍是一個(gè)問(wèn)題，有規(guī)范標(biāo)示37℃、100 r/min培養(yǎng)10 h或37℃靜置16 h即可達(dá)到這一濃度[4-5]，但是卻沒(méi)有任何試驗(yàn)證明，且不同實(shí)驗(yàn)室菌液擴(kuò)增的體系不同、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱的型號(hào)不同也會(huì)導(dǎo)致不同的結(jié)果，即使按上述條件操作也未必能獲得上述濃度的菌液。由于菌液的濃度在一定的范圍內(nèi)和其吸光度值[D(λ)值，λ為波長(zhǎng)數(shù)值]呈正比，因此本試驗(yàn)中，擬尋找出通過(guò)吸光度值測(cè)定鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中菌液濃度的方法。

1.1 材料

1.1.1 菌種 營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA102購(gòu)于美國(guó)Moltox公司。

1.1.2 試劑 2號(hào)營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購(gòu)于英國(guó)Oxoid公司，瓊脂粉購(gòu)于美國(guó)BD公司，0.9%生理鹽水購(gòu)于華裕(無(wú)錫)制藥有限公司，L-組氨酸和D-生物素購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.1.3 儀器 LA2-6AX生物安全柜購(gòu)于新加坡ESCO公司，BD240恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)于德國(guó)Binder公司，Vortex-Genie2漩渦混合器購(gòu)于美國(guó)Scientific Industries公司，INNOVA 40R恒溫培養(yǎng)搖床購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司，數(shù)顯恒溫金屬浴購(gòu)于美國(guó)Boekel公司，CKX41SF倒置顯微鏡購(gòu)于德國(guó)Leica公司，Spectra Max Plus384酶標(biāo)分析儀購(gòu)于美國(guó)Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的確定取培養(yǎng)過(guò)夜的營(yíng)養(yǎng)肉湯和菌液，按每孔100μL加入96孔板，每個(gè)樣本加8個(gè)復(fù)孔，用酶標(biāo)儀測(cè)定540和600 nm波長(zhǎng)下菌液的吸光度值，選取吸光度值較大的波長(zhǎng)數(shù)值。

1.2.2 菌液擴(kuò)增時(shí)間取頂層瓊脂500 mL，加熱融化后，加入50 mL組氨酸-生物素，混勻，按每管2 mL分裝，再每管加入0.5 mL PBS，備用。

從-80℃冰箱中取出凍存的菌液，37℃融化后，按每25μL菌液加入5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的比例擴(kuò)增，放入旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱，于37℃、100 r/min條件下培養(yǎng)，選取接種后0、2、4、6、8、10、12、14 h共8個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取出菌液，按每孔100μL加入96孔板，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)加8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)將培養(yǎng)相同時(shí)間的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作為本底對(duì)照，用酶標(biāo)儀于540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定D(540)值。

同時(shí)取上述8個(gè)時(shí)間點(diǎn)的菌液，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的菌液1 mL，加入9 mL生理鹽水，混勻，此稀釋倍數(shù)為1×101倍；再?gòu)拇讼♂尡稊?shù)中吸取菌液1 mL，加入9 mL生理鹽水，混勻，此稀釋倍數(shù)為1×102倍；按此10倍稀釋的方法逐步稀釋成1×101～1×1010倍共10個(gè)稀釋倍數(shù)。每個(gè)稀釋倍數(shù)取0.1 mL加入已準(zhǔn)備好的頂層瓊脂，在振蕩器上混勻，澆入營(yíng)養(yǎng)肉湯平板，鋪勻。每個(gè)稀釋倍數(shù)重復(fù)制作3皿，待冷凝后，倒置放入培養(yǎng)箱，24 h后選取1×101～1×1010共10個(gè)個(gè)稀釋倍數(shù)中平皿總菌落數(shù)在30～300范圍內(nèi)的平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算3皿菌落數(shù)均值，將菌落數(shù)均值乘以稀釋倍數(shù)，得到各時(shí)間點(diǎn)的菌液濃度。菌液濃度的計(jì)算公式為：菌液濃度(個(gè)/mL)=菌落數(shù)均值×進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)的稀釋倍數(shù)×10。以菌液擴(kuò)增時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌液濃度和D(540)值為縱坐標(biāo)，繪制菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)，確定菌液最佳擴(kuò)增時(shí)間。

1.2.3 菌液D(540)值和平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定菌液濃度取頂層瓊脂500 mL，加熱融化后，加入50 mL組氨酸-生物素，混勻，按每管2 mL分裝，再每管加入0.5 mL PBS，備用。

根據(jù)1.2.2中確定的最佳擴(kuò)增時(shí)間擴(kuò)增菌液，取擴(kuò)增好的菌液5 mL，加入5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯，混勻，此稀釋倍數(shù)為1×21倍；再?gòu)拇讼♂尡稊?shù)中吸取菌液5 mL，加入5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯，混勻，此稀釋倍數(shù)為1×22倍；按此2倍稀釋的方法逐步稀釋成1×21～1×29倍共9個(gè)稀釋倍數(shù)；未進(jìn)行任何稀釋的菌液記為1×20倍(見(jiàn)表1)。取1×20～1×29共10個(gè)稀釋倍數(shù)的菌液，按每孔100 μL加入96孔板，每個(gè)稀釋倍數(shù)加8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)將培養(yǎng)相同時(shí)間的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作為本底對(duì)照，測(cè)定D(540)值。

表1 菌液D(540)值測(cè)定和平板菌落計(jì)數(shù)時(shí)的稀釋倍數(shù)

取1×20～1×29共10個(gè)稀釋倍數(shù)的菌液，按1.2.2中的方法進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)(見(jiàn)表1)。以各稀釋倍數(shù)的D(540)值為橫坐標(biāo)，菌液濃度為縱坐標(biāo)，作散點(diǎn)圖，求回歸方程。

2 結(jié)果

2.1 吸光度值測(cè)定波長(zhǎng)

培養(yǎng)過(guò)夜的營(yíng)養(yǎng)肉湯和菌液在96孔板中分別測(cè)定了D(540)值和D(600)值，測(cè)得8個(gè)復(fù)孔的吸光度值見(jiàn)表2。在540 nm下菌液的吸光度值顯著高于600 nm，因此選取吸光度值較大的540 nm進(jìn)行測(cè)定。

表2 營(yíng)養(yǎng)肉湯和菌液在不同測(cè)定波長(zhǎng)下的吸光度值

2.2 菌液擴(kuò)增時(shí)間

根據(jù)不同擴(kuò)增時(shí)間下的D(540)值-菌液濃度繪制曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。菌液的吸光度值基本呈現(xiàn)出了逐漸上升的趨勢(shì)，而菌液濃度在培養(yǎng)2 h后迅速升高，約10 h達(dá)到最高值，隨后逐漸下降，因此最佳的擴(kuò)增時(shí)間為培養(yǎng)10 h。

圖1 不同擴(kuò)增時(shí)間下的D(540)值和菌液濃度

2.3 菌液D(540)值和菌液濃度測(cè)定

菌液在1×20～1×29等10個(gè)稀釋倍數(shù)測(cè)定了吸光度值，8個(gè)復(fù)孔的D(540)值(扣除營(yíng)養(yǎng)肉湯的本底值)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 菌液D(540)值的測(cè)定

根據(jù)表3各復(fù)孔的D(540)值分別計(jì)算1×20～1×29共10個(gè)稀釋倍數(shù)的D(540)均值，選取1×101～1×1010共10個(gè)稀釋倍數(shù)中平板菌落數(shù)在30～300范圍內(nèi)的稀釋倍數(shù)計(jì)算出菌液濃度，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 菌液濃度的計(jì)算和選擇

以1×20～1×29共10個(gè)稀釋倍數(shù)的D(540)均值為橫坐標(biāo)，菌液濃度為縱坐標(biāo)，作散點(diǎn)圖(見(jiàn)圖2)。設(shè)置截距為0后，添加趨勢(shì)線(xiàn)，可得直線(xiàn)回歸方程y=4×109x(R2=0.999 6，方程中x為D(540)值，y為菌液濃度，單位為個(gè)/mL)。

圖2 D(540)值-菌液濃度圖(第1次)

隨后，按照相同的方法選取了另一株凍存的菌株TA102進(jìn)行了重復(fù)測(cè)試，確認(rèn)直線(xiàn)回歸方程的準(zhǔn)確性。選取1×20～1×29共10個(gè)稀釋倍數(shù)，測(cè)得的D(540)值和菌液濃度結(jié)果見(jiàn)表5，繪制的D(540)值-菌液濃度圖見(jiàn)圖3。

表5 第2次試驗(yàn)測(cè)定的D(540)值和菌液濃度

圖3 D(540)值-菌液濃度圖(第2次)

根據(jù)同樣的方法，可得直線(xiàn)回歸方程y=4×109x(R2=0.992 8，方程中x為D(540)值，y為菌液濃度，單位為個(gè)/mL)。

3 討論

由于培養(yǎng)過(guò)程中菌液濃度是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，因此如何準(zhǔn)確的得出所要菌液的濃度一直是一個(gè)讓試驗(yàn)人員頭疼的問(wèn)題。常用的方法包括比濁法和平皿計(jì)數(shù)法，但是濁度儀在實(shí)驗(yàn)室中并不普及，而平板菌落計(jì)數(shù)法需要等24 h后菌落長(zhǎng)出方可計(jì)數(shù)，有一定的時(shí)間延遲，故也不方便應(yīng)用[6]。由于菌液濃度和吸光度值之間存在線(xiàn)性關(guān)系，故可以通過(guò)吸光度值的測(cè)定來(lái)判斷菌液濃度。林靜等[7]報(bào)道了在600 nm測(cè)定5種常見(jiàn)致病菌的吸光度值，段夢(mèng)奇等[8]發(fā)現(xiàn)550 nm比600 nm更適用于百日咳菌液的吸光度值測(cè)定，計(jì)芬芬等[9]比較了各種波長(zhǎng)，認(rèn)為國(guó)內(nèi)微生物定量細(xì)菌一般使用600 nm。對(duì)于Ames試驗(yàn)中所用到的營(yíng)養(yǎng)缺陷性鼠傷寒沙門(mén)氏菌，有的研究人員在540 nm下測(cè)定吸光度值，認(rèn)為D(540)值在0.1～0.2的范圍內(nèi)可滿(mǎn)足試驗(yàn)要求[2]，有的研究人員在600 nm下測(cè)定吸光度值[10]，因此在本試驗(yàn)中主要選擇這兩個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在540 nm時(shí)菌液的吸光度值顯著高于600 nm，因此選擇540 nm測(cè)定。

Ames試驗(yàn)中，菌液的濃度對(duì)試驗(yàn)影響較大，如菌液濃度太低，則會(huì)降低試驗(yàn)的敏感性[10]，如果菌液濃度太高，則細(xì)菌的活力會(huì)下降。針對(duì)本實(shí)驗(yàn)室凍存的營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門(mén)氏菌，通過(guò)接種后連續(xù)測(cè)定其0～14 h的菌液濃度和D(540)值，發(fā)現(xiàn)菌液的濃度變化基本呈現(xiàn)一個(gè)“S形”曲線(xiàn)，大約在培養(yǎng)10 h后達(dá)到了菌液的最大濃度，雖然此后吸光度值仍在上升，但是活菌數(shù)卻在下降，這是由于死亡的菌體也有一定的吸光度值所導(dǎo)致[11]。因此在本試驗(yàn)中，將接種物放于旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱中于37℃、100 r/min培養(yǎng)10 h，即可獲得對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的菌液。

各規(guī)范和文獻(xiàn)均要求菌液濃度為活菌的數(shù)目，即CFU(Colony-Forming Units)/mL，通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法折算出的菌液濃度就是CFU/mL，和業(yè)內(nèi)要求一致。隨后，本研究通過(guò)吸光度值測(cè)定和平板菌落計(jì)數(shù)法，建立了菌株TA102菌液濃度和吸光度值的直線(xiàn)回歸方程，兩次試驗(yàn)的結(jié)果均表明菌液濃度和D(540)值之間存在良好的線(xiàn)性關(guān)系，可通過(guò)直線(xiàn)回歸方程y=4×109x由D(540)值計(jì)算獲得菌液濃度。如菌液的D(540)值(扣除營(yíng)養(yǎng)肉湯的本底值)在0.25～0.50之間即可保證獲得菌液的濃度在(1～2)×109個(gè)/mL。2次試驗(yàn)培養(yǎng)10 h后獲得的菌液濃度分別為7.50×108個(gè)/mL和7.47×108個(gè)/mL，未達(dá)到109個(gè)/mL，但是考慮到稀釋時(shí)的損耗和2個(gè)粘連的菌體只會(huì)生長(zhǎng)出1個(gè)CFU，因此平板稀釋法的結(jié)果往往偏低。因此，本擴(kuò)增條件完全可以滿(mǎn)足(1～2)×109個(gè)/mL這個(gè)范圍。

在條件相同(同一批次凍存的菌液，相同的接種體系，相同的儀器)時(shí)，每次擴(kuò)增出來(lái)的菌液濃度都應(yīng)相近，即D(540)值相近，每次只需測(cè)定菌液的D(540)值(扣除營(yíng)養(yǎng)肉湯的本底值)是否在0.25～0.50之間即可知道這次擴(kuò)增的菌液濃度是否在(1～2)×109個(gè)/mL范圍內(nèi)。如D(540)值太低，則表明生長(zhǎng)狀態(tài)不好，菌液濃度不足，無(wú)法進(jìn)行試驗(yàn)；如D(540)值太高，則表明可能產(chǎn)生污染，也無(wú)法進(jìn)行試驗(yàn)。通過(guò)TA102菌液擴(kuò)增條件的摸索和確定，證明通過(guò)測(cè)定菌液吸光度值可對(duì)菌液濃度進(jìn)行預(yù)測(cè)和質(zhì)量控制，此法科學(xué)、簡(jiǎn)單、快捷。