熊 強，姜曉燕，丁立新，劉曉丹，周平坤，丁庫克，

(1．中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫(yī)學所，北京 100088；2．軍事醫(yī)學科學院軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所，北京市放射生物學重點實驗室，北京 100850)

【關鍵字】IER5；Sf9細胞；桿狀病毒表達系統(tǒng)；鑒定

早期快速反應基因5(immediate-early response gene 5，IER5)是早期慢反應基因家族的一員，最早是由Williams等人發(fā)現(xiàn)并命名[1]。該基因位于1號染色體長臂2區(qū)5帶3亞帶(1q25.3)，含2 350個核苷酸，無內(nèi)含子。IER5基因的開放閱讀框編碼327個氨基酸，和其他早期慢反應基因家族pip92、IER2、ETR101一樣，氨基酸末端含豐富的脯氨酸，但與pip92、IER2、ETR101基因不同的是，IER5的轉(zhuǎn)錄激活不需要磷酸激酶C誘導[2]。

我們的前期工作發(fā)現(xiàn)，輻射能夠誘導腫瘤細胞IER5基因表達上調(diào)[3]；IER5基因的表達抑制可提高細胞分裂進入G2/M期的比例，促進細胞分裂，提高細胞對輻射的拮抗性，即IER5基因沉默使受輻射的宮頸癌與肝癌細胞發(fā)生G2/M期阻滯，參與了細胞周期調(diào)控[4]；IER5的表達顯著降低HeLa細胞電離輻射誘導DNA雙鏈斷裂的修復效果[5]；輻射刺激下IER5抑制了CDC25B基因的表達，參與了對CDC25B基因的調(diào)控[6-7]。但我們尚未進行IER5蛋白結構方面的探索。

近年來，昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)由于具有安全性好、重組蛋白表達量高、能同時表達多個基因、重組蛋白翻譯后加工完整等特點，因而受到廣泛應用[8-9]。昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)始于20世紀80年代，Smith等[10]人在昆蟲細胞中通過以桿狀病毒作為載體表達出了具有生物活性的人β干擾素。自此之后，經(jīng)過研究者們不斷地改進優(yōu)化，昆蟲桿狀病毒表達載體已經(jīng)有非常成熟的應用。目前，市面上已經(jīng)有大量商品化的昆蟲表達系統(tǒng)，其中應用較為廣泛是BD公司的BaeuloGold表達系統(tǒng)和Thermo公司的Bac-to-Bac表達系統(tǒng)。王浩等[11]比較了這兩種表達系統(tǒng)的效果，發(fā)現(xiàn)Bac-to-Bac表達系統(tǒng)表達效果更好。

本研究擬通過Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)克隆和表達IER5蛋白，進而為后續(xù)蛋白質(zhì)結晶和分析研究該蛋白的結構，結合其結構知識進一步解釋在體內(nèi)的功能及作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

E.coli DH5α、質(zhì)粒中小提試劑盒購自北京天根生化科技公司，DH10Bac、草地夜貪蛾卵巢細胞Sf9、pFastBac1載體、Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑、sf-900Ⅱ SFM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Thermo Fisher公司，桿狀病毒穿梭載體bacmid小量抽提試劑盒購自Beyotime公司，限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ、Hin dⅢ、Q5高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶購自NEB公司，瓊脂糖購自BioFrox公司，DNA凝膠回收試劑盒購自北京擎科新業(yè)生物公司，IER5單克隆抗體購自Sigma公司，F(xiàn)ITC標記的山羊抗兔IgG購自Cell Signaling Technology公司，所有引物均由北京中美泰和生物公司合成。

1.2 引物設計與合成

根據(jù)NCBI中IER5基因(Genbank登錄號：NC_000001.11，基因ID：51278)序列，利用PrimerPremier5.0軟件設計帶有His標簽引物，同時根據(jù)載體多克隆位點信息引入酶切位點(Eco RⅠ和Hin dⅢ)和相應的保護堿基，引物序列為：上游引物5′-CCGGAA TTCGATGcatcatcaccatcaccatGAGTTCAAGCTGGAGGCT C-3′，下游引物 5′-CCCAAGCTTGTCAGAAGGCCAC GATGGCTGTGC-3′，下劃線表示酶切位點，小寫表示His標簽序列。

1.3 IER5基因PCR擴增

以HeLa細胞cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系為50μL：5×Q5反應緩沖液10μL，10 mol/L dNTPs 1μL，上下游引物各2.5μL，cDNA模板1 μL，5×Q5 High GC Enhancer 10 μL，Q5超保真DNA聚合酶，雙蒸水補至50μL。PCR反應條件：98℃預變性30 s；98℃變性10 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，共32個循環(huán)；72℃延伸2 min；4℃保存。

1.4 重組轉(zhuǎn)移載體p FastBac1-IER5構建及鑒定

用Eco RⅠ和Hin dⅢ酶分別對回收后的IER5基因目的片段和質(zhì)粒pFastBacTM1雙酶切。用T4 DNA連接酶連接雙酶切后的目的片段和質(zhì)粒片段，過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含100μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單個陽性克隆菌落，繼續(xù)培養(yǎng)后用天根質(zhì)粒中小提試劑盒提取質(zhì)粒，并用Eco RⅠ和Hin dⅢ酶雙酶切鑒定。將雙酶切鑒定正確的菌株送公司測序，測序正確的重組載體命名為pFastBac1-IER5。

1.5 重組穿梭載體rBacmid-IER5構建及鑒定

將測序正確的重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-IER5轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH10Bac，涂布于含50μg/mL卡那霉素(kanamycin)，7μg/mL慶大霉素，10μg/mL四環(huán)素，100μg/mL鹵代吲哚基-β-D-半乳糖苷和40μg/mL異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)48 h。從平板上挑取白色克隆菌落，擴大培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒。利用PCR技術對重組穿梭質(zhì)粒進行鑒定，PCR引物為穿梭質(zhì)粒Bacmid的M13通用上下游引物(M13 正向引物：5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAA CG-3′；M13反向引物：5′-AGCGGATAACAATTTCA CACAGG-3′)。PCR鑒定反應條件為：95℃預變性3 min；95℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸3 min，共32個循環(huán)；72℃再延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定正確的重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒命名為rBacmid-IER5。

1.6 重組桿狀病毒的制備

參照Cellfectin Reagent轉(zhuǎn)染試劑說明書，分別取3μg rBacmid-IER5重組質(zhì)粒和8μL轉(zhuǎn)染試劑于300 μL無血清培養(yǎng)基中室溫孵育30 min后，將兩溶液混合室溫再孵育20 min。轉(zhuǎn)染Sf9細胞后5 h，將培養(yǎng)基換成含10%FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞出現(xiàn)明顯病變時，收集細胞及上清液，500 g離心5 min，去除細胞和大的細胞碎片，收集上清，即為P1重組桿狀病毒。將P1代病毒感染Sf9細胞，48 h后，離心收集上清，即P2代重組桿狀病毒。

1.7 間接免疫熒光試驗鑒定重組桿狀病毒

將Sf9昆蟲細胞以8×105個/皿的量鋪于35 mm細胞培養(yǎng)皿中，以MOI=1接種重組桿狀病毒，同時設立不接種病毒的Sf9細胞作為對照。待細胞出現(xiàn)明顯病變后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗3次后，用預冷的甲醇溶液固定細胞30 min。棄固定液，用PBS清洗3遍后用5%的封閉液室溫封閉1 h。棄封閉液，用PBS清洗3次后加入1∶400倍稀釋的兔源IER5單克隆抗體作為一抗，37℃孵育1 h。用PBS清洗3遍后，避光加入1∶500稀釋的FITC標記羊抗兔IgG，37℃孵育1 h。用PBS清洗3遍后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強弱并拍照。

1.8 重組蛋白SDS-PAGE和Western blot鑒定

將P2代病毒感染Sf9細胞，待細胞出現(xiàn)明顯病變時，收集細胞及提取蛋白質(zhì)。SDS-PAGE電泳結束后，用0.01%的考馬斯亮藍染液染色，脫色，成像分析結果。

電泳結束后將樣品轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素(nitrocellulose)膜。5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，加入1∶1 000稀釋的兔源抗IER5一抗，室溫放于低速搖床孵育2 h，用PBST清洗3遍。加入1∶2 000羊抗兔的二抗，室溫在搖床低速搖晃1 h，用PBST清洗3遍后加入化學發(fā)光液顯色。

2 結果

2.1 IER5基因擴增

利用HeLa細胞cDNA為模板進行PCR擴增IER5片段，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定結果如圖1所示，得到一條1 000 bp左右(1 022 bp)的條帶，與預期條帶大小一致。

圖1 IER5基因擴增片段

2.2 雙酶切鑒定重組轉(zhuǎn)移載體p FastBac1-IER5

將經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ酶切后的IER5片段和pFastBacTM1質(zhì)粒用T4DNA鏈接酶連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞。擴大培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ酶酶切，再用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。電泳結果如圖2所示，在1 000 bp和4 700 bp處有2條與預期大小一樣的條帶，與預期條帶大小一致，表明IER5基因已經(jīng)成功克隆入pFastBacTM1質(zhì)粒中，成功構建了重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-IER5。

圖2 雙酶切鑒定重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-IER5

2.3 PCR鑒定重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-IER5

提取質(zhì)粒后，用穿梭質(zhì)粒Bacmid上的通用引物M13對重組穿梭質(zhì)粒進行PCR鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3，在3 300 bp左右出現(xiàn)1條條帶，與預期大小一致，表明成功制備了重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-IER5。

2.4 轉(zhuǎn)染病毒后Sf9細胞形態(tài)學變化

Sf9細胞感染重組桿狀病毒后，每隔12 h觀察一次細胞的形態(tài)。如圖4B所示，大約到72 h左右，感染重組病毒后的細胞開始出現(xiàn)明顯變化，細胞直徑慢慢增加，折光性變強，逐漸脫壁直至細胞破碎死亡。但圖4A所示的未感染重組病毒的細胞無明顯變化。

圖3 PCR鑒定重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-IER5

2.5 重組IER5蛋白間接免疫熒光

用P2代重組桿狀病毒感染Sf9細胞，待細胞出現(xiàn)明顯病變時，用甲醛固定進行間接免疫熒光檢測。如圖5B所示，在熒光顯微鏡下可以看到感染重組桿狀病毒的細胞出現(xiàn)綠色熒光，而圖5A正常細胞未出現(xiàn)熒光，說明重組IER5蛋白在昆蟲細胞中成功表達。

2.6 重組IER5蛋白SDS-PAGE和Western blot分析

為了鑒定重組蛋白的相對分子質(zhì)量和活性，對重組蛋白進行了SDS-PAGE和Western blot檢測。SDSPAGE結果見圖6，泳道2顯示在48 k處出現(xiàn)特異性條帶，與預期條帶大小一致，而圖6泳道3顯示野生型桿狀病毒感染未出現(xiàn)特性條帶。

Western blot結果見圖7，泳道1顯示在48 k處出現(xiàn)特異性條帶，與SDS-PAGE結果一致，表明在Sf9細胞中表達的IER5重組蛋白能與抗體發(fā)生特異性反應。

圖4 感染病毒后Sf9細胞形態(tài)學變化

圖5 間接免疫熒光檢測IER5重組蛋白的表達

3 討論

IER5為放療敏感基因，其過表達能抑制宮頸癌細胞增殖，促進細胞凋亡，表現(xiàn)出輻射增敏作用[12]。IER5蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子蛋白，主要存在于細胞核中。研究也發(fā)現(xiàn)，在輻射刺激下IER5下調(diào)了CDC25B基因的表達，且CDC25B基因是一種非常重要的細胞周期調(diào)控蛋白，所以IER5基因也與細胞周期密切相關[4，6-7]；日本的科學家也發(fā)現(xiàn)IER5基因的表達受熱休克因子1(heat shock factor 1，HSF1)調(diào)控的同時，也影響HSF1的去磷酸化，起到正調(diào)節(jié)的作用[12-15]。除此之外，該基因被發(fā)現(xiàn)參與DNA的損傷修復[5]。

圖6 SDS-PAGE檢測IER5蛋白表達

圖7 Western blot檢測IER5蛋白表達

桿狀病毒載體表達系統(tǒng)是一個以昆蟲桿狀病毒為外源基因載體，以昆蟲和昆蟲細胞為受體的真核表達系統(tǒng)[16]。本研究利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)表達IER5蛋白。首先我們將IER5基因克隆至轉(zhuǎn)移載體pFastBac1質(zhì)粒中，隨后把攜帶桿狀病毒基因組的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH10Bac，篩選轉(zhuǎn)座后的陽性重組穿梭載體rBacmid-IER5，轉(zhuǎn)染Sf9細胞后獲得攜帶IER5基因的重組桿狀病毒顆粒，重復感染獲得P2代重組桿狀病毒，將P2代病毒感染昆蟲細胞，收獲IER5蛋白。結果表明，IER5蛋白在昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)中獲得成功表達。

本課題組前期嘗試用大腸桿菌原核系統(tǒng)表達IER5蛋白，但未成功表達。我們分析了IER5的基因序列，發(fā)現(xiàn)該基因的密碼子適應指數(shù)(codon adaptation index，CAI)值為0.62，較低，不符合GenScript’s Optimum GeneTM密碼子優(yōu)化軟件所建議的高表達優(yōu)化CAI 0.8～1.0取值范圍[17]，故該基因不適合大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達。隨后我們對IER5基因進行密碼子優(yōu)化，仍然未在大腸桿菌中表達成功。我們又利用生物信息學對IER5蛋白質(zhì)二級結構進行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定區(qū)較長，表示該蛋白不穩(wěn)定。酵母表達系統(tǒng)表達外源蛋白水平高，但其表達的蛋白質(zhì)分泌能力相對較低，且表達的蛋白質(zhì)糖基化修飾具有局限性[18]，所以我們選擇昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)對IER5蛋白進行表達。

本研究采用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)對IER5蛋白進行表達，Western blot鑒定和間接免疫熒光結果顯示，昆蟲細胞中表達的蛋白能夠被IER5特異性抗體識別，證明成功表達了重組IER5蛋白，且與預期大小相符，同時也說明該重組蛋白具有良好的反應原性。

本研究采用SDS-PAGE對重組蛋白進行檢測，跟野生型桿狀病毒感染組相比，出現(xiàn)了特異性條帶，但是跟陽性對照組(BSA)相比，目標條帶較淺，說明重組蛋白的表達量不高。分析原因，IER5蛋白主要存在細胞核中，可能與蛋白沒有胞外表達，以及細胞裂解后部分外源蛋白黏附在細胞碎片上有關[19]。為提高重組蛋白在昆蟲細胞中的表達水平，優(yōu)化后續(xù)試驗的表達條件，進一步探索蛋白質(zhì)的三級結構作準備。