閻 琛，劉清桂，陳佳佳，孫 宇，楊 桃，朱海英，陳 費(fèi)，王敏君

(第二軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室，上海 200433)

原位肝移植是目前公認(rèn)的治療肝衰竭等終末期肝病最為有效的方法，但是因供體肝臟緊缺，免疫排斥，高額費(fèi)用等缺陷往往限制了其在臨床上的推廣與應(yīng)用。如今，細(xì)胞移植被認(rèn)為是原位肝移植在臨床治療上的替代方案，以其手術(shù)創(chuàng)傷小，低免疫排斥，可塑性高和可重復(fù)性高，成本低等優(yōu)點(diǎn)，為肝衰竭等終末期肝病開辟了嶄新途徑。移植的細(xì)胞再殖肝臟后可緩解肝功能持續(xù)衰竭并可促進(jìn)自身肝細(xì)胞的更替和再生，可為患者獲得原位肝移植提供等待機(jī)會或者可直接代替肝移植而治療肝臟疾病。而細(xì)胞移植治療取得療效的金標(biāo)準(zhǔn)是實(shí)現(xiàn)肝臟再殖。肝臟再殖是移植的外源細(xì)胞及其所增殖的子代細(xì)胞參與損傷肝臟結(jié)構(gòu)的修復(fù)并正常發(fā)揮肝細(xì)胞生理功能。但是研究顯示肝細(xì)胞移植后，其移植細(xì)胞在肝臟的再殖效率往往不足2%[1]，這樣的再殖效率無法滿足整個肝功能發(fā)揮的需求，極大地限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。肝臟再殖的兩大關(guān)鍵因素是供體細(xì)胞有效地植入受體肝臟以及植入宿主肝臟后細(xì)胞的快速增殖。大量研究已經(jīng)表明，當(dāng)賦予供體細(xì)胞比宿主細(xì)胞更強(qiáng)的生長或生存優(yōu)勢時，肝細(xì)胞就可以有效地再殖肝臟并恢復(fù)肝細(xì)胞功能。在動物模型實(shí)驗(yàn)的移植試驗(yàn)中，基于選擇性優(yōu)勢的肝細(xì)胞再殖的傳統(tǒng)性策略主要有兩個：一是抑制受體肝細(xì)胞使其不能通過自身增殖來恢復(fù)肝細(xì)胞功能，二是賦予供體肝細(xì)胞更強(qiáng)的生長或生存優(yōu)勢來促進(jìn)其再殖。然而，近年來也有研究顯示，在非選擇性優(yōu)勢下，細(xì)胞移植后也可以實(shí)現(xiàn)肝臟的再殖[2]。更為重要的是，宿主肝細(xì)胞損傷和外源細(xì)胞的移植會改變肝臟微環(huán)境，引起微環(huán)境中相關(guān)因子如炎癥因子白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)，肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)，成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)和胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)的表達(dá)，是移植細(xì)胞實(shí)現(xiàn)肝臟再殖的另一個重要機(jī)制[3-5]。因此，本文主要揭示動物模型中成功完成肝臟再殖實(shí)現(xiàn)正常肝功能的模型構(gòu)建機(jī)制，為臨床上終末性肝臟疾病細(xì)胞治療策略的推廣和應(yīng)用提供可行的思路。

1 選擇性優(yōu)勢促進(jìn)肝臟再殖

選擇性優(yōu)勢是指相較于宿主肝細(xì)胞，移植細(xì)胞具有更強(qiáng)的生長和生存優(yōu)勢。大量實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)賦予移植細(xì)胞更強(qiáng)的生長或生存優(yōu)勢時，植入細(xì)胞就可以快速增殖并實(shí)現(xiàn)肝臟有效再殖。而選擇性優(yōu)勢實(shí)現(xiàn)肝臟有效再殖需要具備以下2個條件：①相較于內(nèi)源性宿主細(xì)胞，移植肝細(xì)胞必須獲得較強(qiáng)的增殖或生存優(yōu)勢；②急性或慢性肝臟損傷導(dǎo)致內(nèi)源性細(xì)胞的清除或功能喪失為移植細(xì)胞在宿主肝臟的再殖提供足夠的增殖動力和空間。

1.1 宿主肝細(xì)胞先天功能異?；蛟鲋骋种剖羌?xì)胞再殖的先決條件

肝細(xì)胞占肝組織細(xì)胞的比重高達(dá)70%，作為肝臟功能的主要承擔(dān)者，發(fā)揮糖原合成、脂質(zhì)代謝、分泌膽汁等功能。而肝細(xì)胞功能異常或缺失則會引起肝臟器官機(jī)能的異常從而導(dǎo)致肝臟疾病如肝纖維化、肝硬化甚至急性或慢性肝臟衰竭的發(fā)生，因此機(jī)體急需外源細(xì)胞來替代宿主肝細(xì)胞而發(fā)揮正常的肝臟功能，為移植細(xì)胞成功再殖受體肝臟提供了優(yōu)勢。尿激酶纖維蛋白溶酶原活化子(urokinase plasminogen activator，uPA)轉(zhuǎn)基因動物模型和延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fuarylacetoacetatehydrolase，F(xiàn)ah)基因敲除模型是宿主代謝功能異常而促進(jìn)移植細(xì)胞再殖肝臟的經(jīng)典模型。在uPA動物模型中，肝細(xì)胞過表達(dá)uPA會導(dǎo)致肝臟凝血功能障礙從而引發(fā)肝損傷。當(dāng)野生型肝細(xì)胞或肝前體細(xì)胞移植入uPA受體小鼠肝臟后，移植細(xì)胞可在宿主肝臟中增殖并替換功能缺陷的宿主肝臟從而完成對宿主肝臟的再殖，其肝臟重構(gòu)效率可以達(dá)到80%以上[6-7]。延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因敲除模型模擬了臨床上Ⅰ型酪氨酸血癥，由于延胡索酰乙酰乙酸水解酶的缺乏，酪氨酸分解代謝受阻，無法生成延胡索酸、乙酰乙酸和琥珀酸鹽，而使得毒性次級代謝產(chǎn)物的蓄積，引起肝臟嚴(yán)重?fù)p傷。100個正常的移植肝細(xì)胞在受體肝臟中就能重建出整個肝臟5%的細(xì)胞，約2×105個細(xì)胞，并重建肝小葉的結(jié)構(gòu)與功能[8]。FAH小鼠肝臟損傷的模型不僅已成功實(shí)現(xiàn)了成熟肝細(xì)胞的肝臟再殖和肝酶代謝異常的糾正，該模型已經(jīng)成為了檢驗(yàn)移植細(xì)胞是否能夠轉(zhuǎn)化并具備成熟肝細(xì)胞功能的一種標(biāo)準(zhǔn)。目前，非成熟肝細(xì)胞如肝前體細(xì)胞、重編程誘導(dǎo)的肝干細(xì)胞、3D類器官等的肝臟再殖都在FAH小鼠模型上成功實(shí)現(xiàn)[9-10]。Markus Grompe課題組還新發(fā)現(xiàn)小分子抑制劑CEHPOBA可以模擬FAH酶的缺陷功能，同樣引起肝臟功能損傷而為細(xì)胞移植的再殖奠定了基礎(chǔ)[11]。

uPA小鼠和FAH小鼠模型是最早構(gòu)建、應(yīng)用最廣、最為經(jīng)典的肝臟再殖模型，隨著該領(lǐng)域研究的不斷深入，越來越多的再殖模型逐漸建立。例如，LEC大鼠和Atp7b-/-小鼠也是一種代謝缺陷為前提的細(xì)胞再殖模型，主要模擬臨床上的Wilson病。該模型是由于編碼銅轉(zhuǎn)運(yùn)的ATP7b基因突變，一方面降低血清中銅藍(lán)蛋白含量，另一方面又減少銅從膽汁排泄，使得銅貯留在肝細(xì)胞內(nèi)從而造成肝細(xì)胞凋亡壞死。研究表明將間充質(zhì)干細(xì)胞移植進(jìn)入LEC大鼠模型中，肝功能得到顯著恢復(fù)[12]。PiZ小鼠是模擬臨床上α-1抗胰蛋白酶缺乏癥的動物模型，該模型是由于高表達(dá)人源性的編碼α-1抗胰蛋白酶的突變基因PiZ，使得其編碼的外源性Z-ATT蛋白聚合物沉積在小鼠肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，導(dǎo)致肝細(xì)胞不斷的死亡與再生，為供體肝細(xì)胞的移植提供了選擇性優(yōu)勢。實(shí)驗(yàn)證明將正常的人源性肝細(xì)胞或基因校正過的小鼠肝細(xì)胞移植進(jìn)受體肝臟，血清中的胰蛋白酶水平得到了大幅度降低，肝臟功能明顯恢復(fù)[13]。D-半乳糖胺(D-galactosamine)是一種肝細(xì)胞磷酸尿嘧啶核苷干擾劑，可造成肝彌漫性壞死和炎癥，模擬臨床病毒性肝炎。其損傷機(jī)理是半乳糖胺能競爭性結(jié)合尿苷三磷酸，使得核酸、糖蛋白、脂糖等物質(zhì)合成受抑制，限制了細(xì)胞器及酶的生成和補(bǔ)充，細(xì)胞器受損。而小動物、大動物以及臨床病人的間充質(zhì)干細(xì)胞移植研究都表明體外移植的細(xì)胞可以改善肝功能異常并能夠再殖到宿主肝臟[14]。對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)誘導(dǎo)急性肝功能衰竭模型主要由于肝細(xì)胞代謝APAP產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有氧化毒性，使得生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化而導(dǎo)致肝細(xì)胞變性壞死。進(jìn)行肝細(xì)胞或者干細(xì)胞移植后可以明顯緩解肝功能異常的現(xiàn)象[15]。然而急性肝衰竭模型的再殖研究顯示移植細(xì)胞再殖損傷肝臟的效率非常低，可能跟宿主肝臟沒有多余的空間給移植細(xì)胞增殖相關(guān)。進(jìn)行性的肝臟纖維化是由于肝臟對于慢性損傷不斷地做出修復(fù)反應(yīng)，導(dǎo)致肝再生小結(jié)節(jié)周圍膠原纖維的累積，實(shí)質(zhì)細(xì)胞被瘢痕組織所取代，從而造成肝功能的損傷。將肝細(xì)胞移植進(jìn)入由硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，肝細(xì)胞可以成功再殖宿主肝臟并能夠取代原來纖維化的組織進(jìn)而實(shí)現(xiàn)損傷肝臟的修復(fù)[16]。

正常生理?xiàng)l件下，成熟的肝細(xì)胞一般處于靜息狀態(tài)(G0期)，更替周期長達(dá)200～300 d，幾乎檢測不到增殖的肝細(xì)胞。但是一旦肝臟遭受到損傷或刺激，這些靜息的肝細(xì)胞可以發(fā)揮強(qiáng)大的增殖能力，快速進(jìn)行代償反應(yīng)，重新進(jìn)入細(xì)胞周期，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖。然而當(dāng)宿主肝細(xì)胞增殖被抑制，為外源肝細(xì)胞在損傷肝臟刺激下的再殖提供增殖優(yōu)勢。倒千里光堿屬于吡咯里西啶生物堿家族，可以特異性被肝臟攝取，其代謝的毒性中間產(chǎn)物可以使DNA烷基化，從而特異性地抑制細(xì)胞周期G2/M期。在倒千里光堿和四氯化碳肝損傷的刺激下，移植細(xì)胞植入受體肝臟后可以快速進(jìn)行增殖并修復(fù)受損的肝功能[17]。與此同時，研究發(fā)現(xiàn)將肝細(xì)胞移植進(jìn)入倒千里光堿預(yù)處理的肝臟還有助于急慢性膽管損傷的再生與修復(fù)[18]。與倒千里光堿屬于同一家族的野百合堿，同樣具有抑制宿主肝細(xì)胞增殖的功能，為供體肝細(xì)胞再殖肝臟創(chuàng)造了條件[19]。然而，研究還發(fā)現(xiàn)生物堿誘導(dǎo)的再殖模型對于移植細(xì)胞發(fā)展成肝細(xì)胞癌有著一定的促進(jìn)作用[3]。此外，受到X射線輻射的肝細(xì)胞會發(fā)生自由基介導(dǎo)的DNA氧化損傷，從而造成增殖能力的受損，并且在給予宿主肝臟缺血再灌注、肝葉切除、甲狀腺素T3、生長因子等增殖刺激后移植細(xì)胞也都能夠有效再殖受體肝臟[20-21]。盡管輻射是一種非侵入性、易行性好、安全性高的肝臟再殖手段，但是輻射誘發(fā)的胃腸綜合征和動脈粥樣硬化是該再殖模型潛在的不良反應(yīng)，因此如何在靶向照射減少并發(fā)癥的同時達(dá)到抑制宿主肝細(xì)胞增殖的效果是目前臨床上有待進(jìn)一步解決的問題。

細(xì)胞衰老主要表現(xiàn)為細(xì)胞永久性增殖阻滯，細(xì)胞生理功能降低，同時伴隨衰老相關(guān)蛋白的異常表達(dá)。研究顯示倒千里光堿、輻照結(jié)合2/3肝切除不僅抑制了宿主肝細(xì)胞的增殖，并且還誘發(fā)宿主肝細(xì)胞的衰老[3，22]，為移植細(xì)胞的再殖創(chuàng)造了前提條件。值得注意的是，考慮到倒千里光堿的促癌效應(yīng)以及輻射作為化療方式，輻照結(jié)合肝切誘導(dǎo)宿主肝細(xì)胞衰老則是更加安全的方式。當(dāng)相同數(shù)量的年輕和衰老肝細(xì)胞同時移植入受體肝臟后，年輕供體肝細(xì)胞具有明顯的增殖優(yōu)勢[23]。相反，年輕供體細(xì)胞移植入年輕和老年受體肝臟后，老年受體中肝細(xì)胞再殖的效率要明顯高于年輕受體[24]。這些都表明了肝細(xì)胞的衰老能夠?yàn)榧?xì)胞的再殖提供競爭性的生長優(yōu)勢，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生衰老是一種全新的基于選擇性優(yōu)勢的移植策略。Mdm2是一種E3泛素蛋白連接酶，主要參與p53蛋白的降解。Mdm2基因的缺失，導(dǎo)致p53蛋白表達(dá)水平增高，抑制了細(xì)胞增殖而誘發(fā)肝細(xì)胞發(fā)生衰老。在Mdm2特異性敲除模型中，肝前體細(xì)胞不僅被活化增殖，而且還分化成有功能的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，替換了衰老的肝細(xì)胞而重構(gòu)肝臟結(jié)構(gòu)完成肝功能的修復(fù)[25]。研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ah基因的缺失也會誘導(dǎo)受體肝細(xì)胞發(fā)生衰老，而且衰老肝細(xì)胞還會進(jìn)一步促進(jìn)肝實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，在增殖能力和空間上都為供體細(xì)胞的再殖提供了有利條件[26]。

1.2 移植細(xì)胞獲得性增殖優(yōu)勢促進(jìn)了肝臟再殖

宿主肝細(xì)胞的代謝和增殖缺陷確實(shí)是移植細(xì)胞再殖受體肝臟的重要機(jī)制之一，但是臨床上許多肝臟疾病中肝細(xì)胞的增殖能力和代謝水平并沒有顯著降低，如葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、家族性高膽固醇血癥、凝血因子VII缺乏癥等。因此，通過對供體肝細(xì)胞基因的編輯，使細(xì)胞擁有比宿主細(xì)胞更強(qiáng)的生長或生存優(yōu)勢，從而實(shí)現(xiàn)肝臟的再殖。P27是一種細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制性因子，通過與cyclin A和cyclin E/Cdk復(fù)合體作用來抑制細(xì)胞進(jìn)入增殖周期。p27Kip1敲除的肝細(xì)胞具有明顯的增殖優(yōu)勢，因此該供體細(xì)胞移植入四氯化碳損傷的受體肝臟后，其再殖肝臟的效率可以達(dá)到12%～15%[27]。Foxm1B是調(diào)控細(xì)胞周期G1/S和G2/M轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵性因子，F(xiàn)oxm1B修飾的肝細(xì)胞變成了一種“超級肝細(xì)胞”，具備很強(qiáng)的增殖能力，進(jìn)行移植后可以明顯提高肝臟的再殖效率[28]。該研究還發(fā)現(xiàn)Foxm1B修飾的肝細(xì)胞具有一定的安全性，將移植的肝細(xì)胞分離培養(yǎng)連續(xù)增殖8個月或在小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)12周后均未發(fā)現(xiàn)癌變現(xiàn)象。Yes相關(guān)蛋白(yes-associated protein，YAP)是Hippo信號通路中最主要的效應(yīng)因子，該通路主要調(diào)控細(xì)胞的增殖和器官的大小。當(dāng)YAP蛋白入核與TEAD轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，就能夠誘導(dǎo)下游促增殖、抗凋亡的基因表達(dá)。將攜帶Yap基因的慢病毒感染供體細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞移植，即使在沒有任何受體肝臟損傷或增殖刺激的情況下，移植細(xì)胞再殖受體肝臟的效率也可以達(dá)到(8.9±2.6)%[29]。此外，通過調(diào)控供體細(xì)胞的倍體數(shù)也能夠促進(jìn)肝臟的再殖效率。轉(zhuǎn)錄因子E2F家族是調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的重要蛋白，E2F7和E2F8的表達(dá)升高會促進(jìn)肝細(xì)胞的多倍化，而抑制其表達(dá)則會促進(jìn)肝細(xì)胞成功分裂成二倍體細(xì)胞。將外源性的多倍體肝細(xì)胞和二倍體肝細(xì)胞混合移植進(jìn)受損的受體肝臟后，二倍體肝細(xì)胞不僅表現(xiàn)出了更強(qiáng)的再殖能力還抑制了多倍體肝細(xì)胞的增殖[30]。盡管賦予供體肝細(xì)胞生長以及生存優(yōu)勢是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ脑僦巢呗?，但是對于任何涉及基因組整合和增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力的療法，癌癥形成風(fēng)險的增加是制約其臨床應(yīng)用的一個重要因素。

2 非選擇性優(yōu)勢下肝臟實(shí)現(xiàn)再殖的機(jī)制

在家族性高膽固醇血癥、凝血因子VII缺乏癥這類臨床疾病中，肝細(xì)胞本身沒有受到損傷并可以發(fā)揮一定的生理功能，因此在這種條件下移植細(xì)胞就很難完成有效的肝臟再殖。非選擇性優(yōu)勢正是這類情況，它表現(xiàn)為宿主肝細(xì)胞最基本的肝功能是正常的，在此基礎(chǔ)上宿主肝細(xì)胞和供體肝細(xì)胞對于外源性的增殖刺激會做出相同的反應(yīng)。所以在非選擇性優(yōu)勢情況下，即便是給予部分肝切或CCl4的增殖刺激，正常肝細(xì)胞的再殖效率也不會超過1%～2%。在正常分化成熟細(xì)胞無法表現(xiàn)出增殖，生存以及功能上的選擇性優(yōu)勢的情況下，具備增殖能力強(qiáng)、多分化潛能和重構(gòu)組織的能力的干/祖細(xì)胞是目前主要的研究方向。而到目前為止，只有大鼠的胎肝干/祖細(xì)胞植入接近正常肝臟才能夠?qū)崿F(xiàn)有效再殖[2，31-32]。研究顯示僅僅只是在2/3肝切的增殖刺激下，ED14胎肝細(xì)胞在非選擇性優(yōu)勢下的再殖效率就可以到達(dá)23%。但并非所有的胎肝細(xì)胞在非選擇性優(yōu)勢的情況下都能完成有效的再殖，研究表明ED14胎肝前體細(xì)胞的再殖效率很高，但ED16胎肝前體細(xì)胞的再殖效率則很低[2]。因此，ED14胎肝細(xì)胞通常作為非選擇性優(yōu)勢下肝細(xì)胞移植研究的主要細(xì)胞來源。而最近的研究發(fā)現(xiàn)，作為妊娠晚期分化程度更高的ED19胎肝細(xì)胞，它在部分肝切的增殖刺激下再殖效率卻可以達(dá)到35%[31]。相比大鼠，小鼠的胎肝細(xì)胞在非選擇性優(yōu)勢下的再殖率則小于1%[32]。目前，對于胚胎發(fā)育不同時期和不同種屬之間胎肝細(xì)胞再殖效率差異的內(nèi)在機(jī)制目前還尚不明確，而該機(jī)制的闡明對于促進(jìn)非選擇優(yōu)勢下的肝臟再殖有著重要意義。

3 肝臟微環(huán)境可促進(jìn)移植細(xì)胞的再殖

我們發(fā)現(xiàn)，盡管在基于選擇性優(yōu)勢和非選擇性優(yōu)勢的情況下，移植細(xì)胞在受體肝臟中都可以取得較高的再殖效率，但這二者主要聚焦在宿主肝細(xì)胞和移植細(xì)胞本身的特性上。而最近的研究發(fā)現(xiàn)，肝臟微環(huán)境也是移植細(xì)胞完成肝臟再殖的重要潛在機(jī)制，通過調(diào)控宿主肝臟的微環(huán)境將可能成為今后臨床上終末期肝病細(xì)胞治療的新策略。誘導(dǎo)肝臟損傷為外源性細(xì)胞提供增殖刺激作為肝細(xì)胞移植中最普遍使用的手段，它引起的肝臟微環(huán)境改變對于細(xì)胞再殖起到了關(guān)鍵作用。例如，比較70%肝切除術(shù)后第1、2天和第3天可以發(fā)現(xiàn)，術(shù)后前2天，肝臟微環(huán)境主要以炎癥細(xì)胞浸潤和微循環(huán)紊亂為特征；而術(shù)后第3天，肝臟微環(huán)境中的生長因子表達(dá)上調(diào)和血管擴(kuò)張有利于移植肝細(xì)胞的再殖[33]。這與肝切后HGF和FGF的高表達(dá)以及肝星狀細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)密切相關(guān)[5，33]。有研究表明，單純的70%肝切后，肝臟中趨化因子CXC水平僅僅增加了3到5倍，不足以促進(jìn)外源性細(xì)胞的有效再殖。而通過注射外源性的趨化因子CXC后，肝細(xì)胞的再殖效率得到了明顯提升[34]。此外，F(xiàn)ah基因缺失引起的肝細(xì)胞損傷上調(diào)了IGF2的表達(dá)，并通過激活PI3K/AKT和MAPK信號通路促進(jìn)了供體肝細(xì)胞的再殖[4]。

除此之外，細(xì)胞衰老引起的肝臟微環(huán)境改變對細(xì)胞再殖也起到了重要作用。對經(jīng)過倒千里光堿和肝切除處理后的年輕和老年受體進(jìn)行肝細(xì)胞移植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)供體肝細(xì)胞在年輕受體肝臟中的再殖效率明顯高于老年受體。這個現(xiàn)象暗示了年輕肝臟微環(huán)境中存在某些促進(jìn)再殖或是衰老肝臟微環(huán)境中存在抑制再殖的因素。通過對肝臟微環(huán)境中細(xì)胞因子表達(dá)水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，老年受體微環(huán)境中生長激素表達(dá)水平很低，而提高老年受體中生長激素水平后，再殖效率可以明顯提高[35]。另一方面，將胎肝細(xì)胞同時移植到年輕和老年受體中可以發(fā)現(xiàn)，胎肝細(xì)胞在老年受體的再殖效率是年輕受體的4到5倍，這是由于在相比年輕受體，老年受體中Activin A的分泌增多，抑制了內(nèi)源性肝細(xì)胞的增殖，而胎肝細(xì)胞能夠抵抗Actvin A所誘導(dǎo)的效應(yīng)，產(chǎn)生了明顯的選擇性優(yōu)勢[24]。細(xì)胞發(fā)生衰老后，不僅自身增殖能力受抑制，同時還會誘導(dǎo)基因表達(dá)異常，促進(jìn)衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associate secreted protein，SASP)。SASP會通過旁分泌的形式調(diào)控其微環(huán)境的其他細(xì)胞甚至是新植入受體肝臟的外源移植細(xì)胞，從而改變細(xì)胞的生物學(xué)特性。例如Serra等[3]發(fā)現(xiàn)宿主衰老肝細(xì)胞不僅為移植細(xì)胞的再殖提供了選擇性優(yōu)勢，而且衰老細(xì)胞分泌的IL-6很可能促進(jìn)了移植細(xì)胞的增殖。研究還發(fā)現(xiàn)，在衰老的肝臟微環(huán)境中，跨膜蛋白酶、絲氨酸蛋白酶以及MMP的高表達(dá)會導(dǎo)致纖維粘連蛋白在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)的降解，有利于移植細(xì)胞的植入，而當(dāng)移植細(xì)胞在受體肝臟中再殖時，蛋白酶的表達(dá)降低而細(xì)胞外基質(zhì)被重塑，對移植細(xì)胞與受體肝細(xì)胞的整合起到了關(guān)鍵作用[26]?？紤]到輻射治療在臨床上的廣泛應(yīng)用以及誘導(dǎo)衰老對于肝細(xì)胞和肝臟微環(huán)境的雙重作用，輻射結(jié)合肝切誘導(dǎo)衰老是目前最新最具臨床應(yīng)用潛力的再殖策略。

細(xì)胞有效植入受體肝實(shí)質(zhì)是實(shí)現(xiàn)肝臟再殖的關(guān)鍵一步，而通常供體細(xì)胞移植1～2 d內(nèi)就會由于炎癥反應(yīng)而導(dǎo)致80%～90%的細(xì)胞從肝血竇中被快速清除。細(xì)胞的植入改變了肝臟基因的表達(dá)和血管張力，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞黏附、血栓形成以及組織的損傷與重塑。而造成微環(huán)境巨大改變的根本原因是細(xì)胞移植后肝臟的缺血、內(nèi)皮的損傷以及肝星狀細(xì)胞，kupffer細(xì)胞，中性粒細(xì)胞的活化，因此，通過對這些現(xiàn)象進(jìn)行人為干預(yù)或調(diào)控而提高移植細(xì)胞在受體肝臟的植入效率同樣是移植細(xì)胞成功再殖受體肝臟的關(guān)鍵。研究顯示使用內(nèi)皮素受體拮抗劑體外孵育供體細(xì)胞后再進(jìn)行移植，供體肝細(xì)胞能夠抵抗肝臟中細(xì)胞因子產(chǎn)生的毒性，從而促進(jìn)再殖[36]。細(xì)胞移植后也會導(dǎo)致宿主肝臟發(fā)生缺血，血管收縮因子如內(nèi)皮素-1的招募，從而清除移植細(xì)胞。研究顯示在肝細(xì)胞培養(yǎng)基中加入特異性的內(nèi)皮素-1A受體拮抗劑可使得細(xì)胞移植后肝竇血管擴(kuò)張，并且使得內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥反應(yīng)、細(xì)胞損傷、血管張力等相關(guān)基因的表達(dá)降低，從而促進(jìn)移植細(xì)胞植入受體肝臟并提高了肝臟的再殖。同樣在受體小鼠中注射內(nèi)皮素-1A受體拮抗劑也可以提高肝臟的再殖效率[37]。相類似的，當(dāng)受體小鼠注射腫瘤壞死因α(tumor necrosis factorα，TNFα)拮抗劑后，可以減少因外源細(xì)胞移植引起的細(xì)胞因子的分泌并可抑制中性粒細(xì)胞的活性，從而減少移植細(xì)胞的清除而促進(jìn)肝臟再殖[38]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)沙利度胺具有抗炎癥和促內(nèi)皮損傷的效應(yīng)，能夠阻斷移植引起的炎癥反應(yīng)，如拮抗TNFα以及白介素1，2，6受體，抑制中性粒細(xì)胞和kupffer細(xì)胞活性等，并加劇細(xì)胞移植引起的內(nèi)皮損傷效應(yīng)從而提高肝細(xì)胞的再殖效率[39]。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，通過尾靜脈注射α-1抗胰蛋白酶，能夠抑制肝細(xì)胞植入時血液介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，從而阻斷補(bǔ)體和凝血途徑的激活，減少血栓形成并降低促炎因子的表達(dá)，顯著改善移植后48 h內(nèi)的細(xì)胞植入效率，從而促進(jìn)了肝臟的再殖[40]。通過調(diào)控肝臟微環(huán)境來改善植入效率從而促進(jìn)肝臟再殖，這種方式不直接作用于肝細(xì)胞，肝毒性相對較小，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

4 展望

根據(jù)傳統(tǒng)的細(xì)胞移植動物模型構(gòu)建的策略，選擇性優(yōu)勢是移植細(xì)胞有效再殖肝臟的關(guān)鍵。通過抑制宿主細(xì)胞的增殖或者人為修飾的方式使供體細(xì)胞獲得增殖優(yōu)勢都可以促進(jìn)移植細(xì)胞在損傷肝臟中的再殖。但是這些方式都必須借助特殊的損傷條件，并不能完全與臨床上所面臨的肝臟疾病相匹配。細(xì)胞衰老是老年肝臟普遍存在的現(xiàn)象，而老年肝臟疾病的發(fā)病率又遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于年輕個體，因此如果能夠準(zhǔn)確理解細(xì)胞衰老促進(jìn)移植細(xì)胞再殖肝臟的主要調(diào)控機(jī)制，那將對老年肝臟疾病的細(xì)胞治療帶來新的希望。近年來越來越多的研究表明微環(huán)境對細(xì)胞命運(yùn)的抉擇起著至關(guān)重要的地位。移植細(xì)胞能夠成功進(jìn)入到宿主肝臟并進(jìn)行增殖從而實(shí)現(xiàn)損傷肝臟的再殖都取決于細(xì)胞所處的微環(huán)境并受其周圍細(xì)胞所釋放的信號的調(diào)控。盡管目前大量的研究報道顯示通過調(diào)控微環(huán)境的信號通路可以促進(jìn)移植細(xì)胞植入受體肝臟和促進(jìn)移植細(xì)胞在受體肝臟中的增殖，但是面對種種終末期肝臟疾病，細(xì)胞移植治療的方案仍然還需要進(jìn)一步探索。