滕彥玲， 牟曉梅

(1.吉林市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，吉林 吉林 132011；2.北華大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科)

宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性健康的第三大惡性腫瘤。在宮頸癌的發(fā)病機(jī)制中某些特定基因的異常表達(dá)或過(guò)表達(dá)可能是引起腫瘤細(xì)胞增殖的重要原因[1]。H19的表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)[2]，可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖[3]，而二者是否存在相互作用、作用機(jī)制未知。本研究從信號(hào)通路HOXA1為切入點(diǎn)，結(jié)合RNA干擾和miRNA芯片技術(shù)，篩選所有可能受到HOXA1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的miRNA分子，通過(guò)分析并證實(shí)miRNA-10b分子可直接負(fù)反饋調(diào)控HOXA1，研究LncRNA-H19調(diào)控的miRNA-10b家族分子對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡的影響，構(gòu)建一個(gè)相對(duì)完整的LncRNA-H19、miRNA-10b與靶基因HOXA1信號(hào)途徑相互作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而為進(jìn)一步解釋宮頸癌的發(fā)生發(fā)展提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

選取人源性宮頸癌細(xì)胞系HeLa進(jìn)行研究(由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供)。將細(xì)胞加入到含10%牛血清蛋白DMEM-F12 (1∶1)培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后用胰蛋白酶處理、傳代，取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞以1.0×105的密度接種到六孔板上，備用。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染

把H19 cDNA(GeneBank accession no.NR_002196.1)構(gòu)建到pDNA3.1載體(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)的多克隆位點(diǎn)上。特異性的H19 siRNA或其陰性對(duì)照(H19：4390771，life technologies carlsbad，CA)轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中，從而來(lái)敲除H19的表達(dá)。將宮頸癌細(xì)胞按照2×105/孔種植在24孔平板上培養(yǎng)24 h，利用脂質(zhì)體2000(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)將0.5 μg的pDNA-H19或pcDNA-mut-H19轉(zhuǎn)染到兩種宮頸癌細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。

1.3CCK-8檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況

取HeLa的48孔板，以2×105/孔的密度種植在24孔平板上培養(yǎng)24 h，用脂質(zhì)體2000將0.5 μg的pDNA-H19與miRNA-10b類似物miR-10b mimics(購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)一同轉(zhuǎn)染到宮頸癌細(xì)胞中，將其分別作為第一、第二組、第三組共同轉(zhuǎn)染pDNA-H19和miRNA-10 inhibitor(對(duì)照組)，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入 CCK-8 溶液 10 μl/孔，置入培養(yǎng)箱中37℃，5%CO2條件下孵育分別經(jīng)24、48、72小時(shí)取出，用酶標(biāo)儀檢測(cè)一次，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)定為 450 nm。

1.4實(shí)時(shí)定量PCR

分別對(duì)HeLa細(xì)胞做如下處理，miR-10b mimics轉(zhuǎn)染，pDNA-H19和miR-10b mimics共同轉(zhuǎn)染，pcDNA-mut-H19和miR-10b mimics共同轉(zhuǎn)染。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的處理后細(xì)胞接種到 6 孔板中，接種密度為 2×105個(gè)/mL，培養(yǎng)24小時(shí)后，用 TRNzol 試劑提取總 RNA，用 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄。定量PCR所使用H19引物、miR-10b引物化及U6引物(內(nèi)參對(duì)照)均購(gòu)自生命科技公司，其完成引物的合成與測(cè)序。H19上游擴(kuò)增引物：5′-AGCGGGTCTGTTTCTTTACTT-3’,下游擴(kuò)增引物：5′-AGCTGGGTAGCACCATTTC-3′；miRNA-10b 上游引物5′-CGAGGGTCCGAGGTATTCCG-3′ 下游引物5′-CGCCGCCCAGTGTTCAGA-3′，利用生命科技公司(Carlsbad，CA)的Fast Start Universal SYB Green Master(ROX)系統(tǒng)測(cè)定H19和miRNA-10b的表達(dá)水平，采用相對(duì)定量法比較、分析結(jié)果，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.5Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平

將以上三種處理后的細(xì)胞提取總蛋白后，BCA法測(cè)IGF1R蛋白濃度。配制10%分離膠行SDS-PAGS電泳，轉(zhuǎn)膜后依次加入一抗、二抗孵育。以GAPDH為內(nèi)參將膠片掃描，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶光密度值及分子量，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1H19可抑制miRNA-10b的表達(dá)

用RT-PCR檢測(cè)miRNA-10b的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與pcDNA-mut-H19和miRNA-10b共轉(zhuǎn)染組比較，pDNA-H19和miR-10b 共轉(zhuǎn)染組的miR-10b表達(dá)量下降(P<0.05)，與pDNA-H19和miR-10b inhibitor共轉(zhuǎn)染組比較，miR-10b表達(dá)量差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),說(shuō)明H19 抑制miRNA-10b的表達(dá)，見(jiàn)圖1。

向過(guò)表達(dá)H19的HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-10b或miRNA-10 inhibitor共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增長(zhǎng)明顯高于pcDNA-mut-H19和miRNA-10b共轉(zhuǎn)染組(P<0.05)

圖1H19可抑制miRNA-10b的表達(dá)

2.2H19促進(jìn)IGF1R表達(dá)

用Western blot檢測(cè)IGF1R蛋白表達(dá)量顯示，pDNA-H19和miR-10b 共轉(zhuǎn)染組的IGF1R蛋白量增加(P<0.05)，與pDNA-H19和miR-10b inhibitor共轉(zhuǎn)染組比較IGF1R蛋白量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),由此可以說(shuō)明H19促進(jìn)IGF1R表達(dá)，見(jiàn)圖2。

3 討論

MicroRNAs (miRNAs)被作為一類分子標(biāo)記物，在近年來(lái)的腫瘤研究中占有重要地位。長(zhǎng)度為21-23個(gè)核苷酸的miRNA片段，可作為非編碼miRNA通過(guò)與特定的mRNA的3'UTRs區(qū)域結(jié)合使之降解或抑制其翻譯，從而發(fā)揮基因調(diào)節(jié)作用。

pDNA-H19和miR-10b 共轉(zhuǎn)染組的IGF1R蛋白表達(dá)量高于pcDNA-mut-H19和miR-10b 共轉(zhuǎn)染組(P<0.05),與pDNA-H19和miR-10b inhibitor共轉(zhuǎn)染組比較IGF1R蛋白量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)

圖2H19促進(jìn)IGF1R表達(dá)

miRNAs可參與細(xì)胞的多種生理和病理過(guò)程，在細(xì)胞增殖、凋亡、遷移，糖和脂質(zhì)代謝，免疫應(yīng)答中均可發(fā)揮重要作用[4]。有研究報(bào)道，miRNA-10b在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)量明顯降低，借助基因工程在宮頸癌細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)miRNA-10b能夠抑制腫瘤增殖、侵襲和遷移，且通過(guò)調(diào)節(jié)IGF1R可發(fā)揮抑制miRNA-10b表達(dá)的作用[5]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類在基因表達(dá)的各個(gè)層次環(huán)節(jié)發(fā)揮基因調(diào)節(jié)功能的RNA分子，由200 個(gè)核苷酸組成，其作用主要從表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等方面實(shí)現(xiàn)。其中 lnc RNA-H19 是目前長(zhǎng)鏈非編碼RNA中唯一由印跡基因編碼，其基因表達(dá)水平隨著胚胎發(fā)育而降低。多項(xiàng)研究顯示H19在宮頸癌組織中有印記缺失現(xiàn)象(Loss of Imprinting，LOI)，提示 H19 LOI 和宮頸癌的發(fā)生有著高度相關(guān)性[6]。

近年來(lái)，眾多研究者對(duì)腫瘤的研究重點(diǎn)放在長(zhǎng)鏈非編碼 RNA上。 H19 是一類早期發(fā)現(xiàn)由印記基因編碼的在胚胎期高度表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼 RNA，其表達(dá)水平隨著個(gè)體發(fā)育成熟而逐步降低?？茖W(xué)家通過(guò)研究闡明，啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化是 H19 在成熟機(jī)體低表達(dá)的重要原因[7]。雖然H19與腫瘤的關(guān)系還不能明確，但在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中其具有促癌或抑癌的作用。有研究顯示，H19可在胃癌組織中高表達(dá)，并通過(guò)與p53 作用促進(jìn)細(xì)胞增殖[8]。但也有研究報(bào)道 H19 和 miR-675 間存在共同作用通路，在前列腺癌的發(fā)展過(guò)程中通過(guò)抑制 TGFBI 的翻譯可抑制前列腺癌的遷移[9]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌癌細(xì)胞中 H19過(guò)表達(dá)時(shí)，miRNA-10b的表達(dá)水平降低，同時(shí)可引起腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快。說(shuō)明miRNA-10b能夠抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，是與宮頸癌密切相關(guān)的分子。 H19 抑制 miRNA-10b表達(dá)的這一現(xiàn)象將為此類研究提供線索，為通過(guò)調(diào)節(jié)H19基因序列來(lái)治療宮頸癌提供依據(jù)。

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