趙金偉,宮路路,鄭 戈,由廣強(qiáng),姜學(xué)遠(yuǎn)

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 肝膽胰外科，吉林 長(zhǎng)春130041)

目的建立一種可復(fù)制的大鼠ALPPS模型。方法使用SD大鼠建立可復(fù)制的ALPPS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，ALPPS技術(shù)操作包括：肝臟右外側(cè)葉，左外側(cè)葉及左中葉門靜脈支結(jié)扎(70%PVL)，尾狀葉切除(10%肝臟部分切除)和左右中葉間肝實(shí)質(zhì)的80%離斷，將右中葉作為未來殘余肝(FLR)，占全肝體積20%；門靜脈結(jié)扎組，只行相應(yīng)肝葉的門靜脈支結(jié)扎和尾狀葉的切除，不進(jìn)行肝實(shí)質(zhì)離斷；對(duì)照組，僅行肝蒂的解剖分離和尾狀葉的切除。于術(shù)后24小時(shí)，48小時(shí)及96小時(shí)時(shí)相點(diǎn)分析大鼠體重變化和FLR的再生能力；另外一組于ALPPSⅠ期操作后的96小時(shí)完成ALPPSⅡ期手術(shù)，檢驗(yàn)擴(kuò)大的肝臟切除術(shù)的可行性及安全性。結(jié)果5只大鼠于術(shù)后第二天死亡，主要死因是出血和腹水。術(shù)后24小時(shí)和48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)：ALPPS組、PVL組和對(duì)照組間的體重變化差異不具有顯著性，P值均大于0.05。術(shù)后96小時(shí)時(shí)間點(diǎn)：ALPPS組和PVL組的體重變化與對(duì)照組相比，差異具有顯著性，P值均小于0.05，但ALPPS組和PVL組的體重變化相比，差異不具有顯著性，P值大于0.05。術(shù)后24小時(shí)：ALPPS組、PVL組和對(duì)照組間的FLR再生率差異不具有顯著性，P值均大于0.05。術(shù)后48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)：ALPPS組和PVL組的FLR再生率明顯升高，與對(duì)照組相比，差異具有顯著性，P值均小于0.05，但ALPPS組和PVL組的FLR再生率相比，差異不具有顯著性，P值大于0.05。術(shù)后96小時(shí)時(shí)間點(diǎn)：三組FLR再生率相比，差異具有顯著性，P值均小于0.05，且ALPPS組FLR再生率明顯高于PVL組。另外一組6只大鼠行ALPPSⅠ期手術(shù)后4天接受Ⅱ期手術(shù)，全部存活直到術(shù)后7天人為處死。結(jié)論我們成功地建立了大鼠可復(fù)制的ALPPS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停_(dá)到了預(yù)期效果。

大鼠模型；ALPPS；FLR再生率

(ChinJLabDiagn,2018,22:0512)

門靜脈結(jié)扎聯(lián)合肝臟劈離的二步肝切除術(shù)(ALPPS)是近年來肝臟外科的革新性技術(shù)，但其短期內(nèi)快速平穩(wěn)地促進(jìn)未來殘余肝(FLR)再生的機(jī)制尚未明確，較高的圍手術(shù)期并發(fā)癥和死亡率阻礙該技術(shù)的普及推廣，近遠(yuǎn)期的抗腫瘤生物學(xué)效應(yīng)也亟待解決。本文旨在對(duì)比不同的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头椒?，建立能夠模擬臨床實(shí)踐過程的大鼠ALPPS模型并觀察不同時(shí)相點(diǎn)FLR再生的情況。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要器材健康清潔級(jí)SD大鼠76只，周齡7-10周，體重200-280克，購于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)用顯微手術(shù)器械、手術(shù)放大鏡及動(dòng)物用手術(shù)雙極電凝刀購于上海吉米公司。

1.2動(dòng)物分組大鼠隨機(jī)分為三組：ALPPS組、PVL組及對(duì)照組，每組大鼠20只；另外隨機(jī)選10只大鼠用于術(shù)前計(jì)算右中葉與體重的質(zhì)量比，6只大鼠用于ALPPSⅠ期操作后的Ⅱ期擴(kuò)大肝切除術(shù)。

1.3麻醉方法采用動(dòng)物用戊巴比妥鈉，配制成1.5 mg/100 ml溶液，按照1.5 mg/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉。

1.4分組操作及確定解剖時(shí)相點(diǎn)對(duì)照組：開腹后分離右外側(cè)葉、左中葉及左外側(cè)葉的門靜脈支，切除尾狀葉；PVL組：分離右外側(cè)葉、左中葉及左外側(cè)葉的門靜脈支并予以結(jié)扎，切除尾狀葉； ALPPS組：在完成PVL組的操作后，行左右肝中葉肝實(shí)質(zhì)80%的離斷。分別于術(shù)后24 h、48 h和96 h麻醉后處死大鼠，分析FLR再生情況。

1.5外科手術(shù)操作待麻醉生效后，采用絡(luò)合碘消毒手術(shù)區(qū)域，取上腹部正中切口剖腹探查，切斷肝臟鐮狀韌帶，充分顯露肝臟，離斷左外側(cè)葉與尾狀葉間及尾狀葉與胃間的韌帶，鉗夾尾狀葉的肝蒂及靜脈，4-0絲線結(jié)扎并切除尾狀葉。顯露右外側(cè)葉肝蒂并予以分離，將肝動(dòng)脈及膽管與門靜脈分離后，懸吊肝動(dòng)脈及膽管加以保護(hù)，將門靜脈支靠近主干予以結(jié)扎，可見右外側(cè)葉顏色變灰暗，以同樣方法處理左外側(cè)葉肝蒂，但左外側(cè)葉和左中葉的門靜脈支有共干走行，于共干處結(jié)扎可同時(shí)阻斷兩肝葉的門靜脈，此時(shí)可見左外側(cè)葉和左中葉的顏色變化，并在左、右肝中葉間出現(xiàn)明顯的缺血平面，通常位于鐮狀韌帶上或稍偏右側(cè)。至此，完成了選擇性的門靜脈支結(jié)扎和肝臟尾狀葉的切除。先用電刀沿著缺血平面作標(biāo)記，沿著缺血平面離斷左右肝中葉肝實(shí)質(zhì)約80%，直達(dá)腔靜脈旁部，如有活動(dòng)性出血，采用7-0 Prelene線縫合結(jié)扎，或稍偏缺血平面左側(cè)離斷可減少出血，在完成ALPPSⅠ期手術(shù)后的第四天，進(jìn)行Ⅱ期手術(shù)，即切除所有結(jié)扎門靜脈的肝葉。

術(shù)后24 h、48 h及96 h麻醉后處死大鼠，采用針刺心臟抽血，-20℃保存?zhèn)溆?，切取右、左中葉并稱重，每側(cè)每葉分成兩份，一份使用10%甲醛溶液固定，一份置于-70℃冰箱，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6大鼠體重變化及FLR再生率的測(cè)量

1.6.1大鼠體重的測(cè)量 每只大鼠于術(shù)前及處死時(shí)分別在不同時(shí)相點(diǎn)測(cè)量其體重，初始體重(IW)和終末體重(FW)，體重變化率采用如下公式計(jì)算：(FW-IW)/IW×100%。

1.6.2FLR再生率的計(jì)算 W1為正常大鼠的右中葉質(zhì)量的平均值，W2為各時(shí)相點(diǎn)右中葉的質(zhì)量，RR為再生率，采用公式為：RR=(W2-W1)/W1×100%。

2 結(jié)果

2.1手術(shù)操作方法及解剖時(shí)相點(diǎn)的確定實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)比采用如下幾種手術(shù)操作：(1)左右外側(cè)葉、左中葉及尾狀葉的門靜脈支結(jié)扎，保留右中葉門靜脈支并作為FLR。(2)右外側(cè)葉、左中葉及尾狀葉的門靜脈支結(jié)扎，切除左外葉，保留右中葉門靜脈支并作為FLR。(3)左、右外側(cè)葉、左中葉的門靜脈支結(jié)扎，切除尾狀葉，保留右中葉門靜脈支并作為FLR。對(duì)比三種方法，實(shí)驗(yàn)難易程度相當(dāng)，但第三種方法更好模擬臨床實(shí)踐中的FLR部分肝切除和保留大約20%的肝實(shí)質(zhì)作為FLR,最終確定采用第三種手術(shù)操作方法： 左、右外側(cè)葉、左中葉的門靜脈支結(jié)扎，切除尾狀葉，保留右中葉門靜脈支并作為FLR，同時(shí)離斷左右肝中葉間的80%肝實(shí)質(zhì)，直達(dá)腔靜脈旁部。

于術(shù)后1天，2天，3天，4天及5天解剖大鼠，觀察腹腔內(nèi)變化及肝臟再生變化，確定觀察時(shí)相點(diǎn)為1天，2天及4天。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),術(shù)后2天，術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率較高，且大鼠死亡易多發(fā)在此階段，本實(shí)驗(yàn)中，4只ALPPS組大鼠死亡，1只PVL組大鼠死亡。

2.2術(shù)前大鼠右中葉占大鼠體重平均百分比的確定同期大鼠10只，測(cè)量其體重及右肝葉質(zhì)量(W1)，計(jì)算平均百分比為0.899%。

2.3大鼠術(shù)后體重變化分析術(shù)后1、2天，三組間兩兩比較，體重差異無顯著性，P值均大于0.05；術(shù)后第4天，ALPPS組與PVL組間相比，體重差異無顯著性，P值大于0.05，但ALPPS組與對(duì)照組，PVL組與對(duì)照組相對(duì)比，體重差異具有顯著性，P值均小于0.05。見表1。

表1 大鼠術(shù)后體重變化

2.4大鼠術(shù)后不同時(shí)相點(diǎn)FLR再生率分析術(shù)后24小時(shí)，三組間兩兩比較，差異無顯著性，P值均大于0.05；術(shù)后48小時(shí)，ALPPS組與PVL組間差異無顯著性，P值大于0.05，但兩組分別與對(duì)照組相比，差異具有顯著性，P值均小于0.05；術(shù)后96小時(shí)，三組間兩兩比較，差異均具有顯著性，P值均小于0.05。見表2。

表2 大鼠術(shù)后不同時(shí)相點(diǎn)FLR再生率

3 討論

肝臟切除術(shù)是目前可能治愈原發(fā)性或繼發(fā)性肝臟腫瘤的唯一手段，但大量有功能的肝臟組織的喪失會(huì)導(dǎo)致術(shù)后危及生命的肝衰竭[1]。ALPPS手術(shù)作為一種創(chuàng)新性技術(shù)，與以往的技術(shù)相比，可在短期內(nèi)平穩(wěn)的促進(jìn)FLR再生，附加的原位肝臟劈離，較單一的門靜脈栓塞(PVO)或門靜脈結(jié)扎(PVL)增殖加速5-10倍，使得二步手術(shù)等待時(shí)間大大縮短[2]。但由于該技術(shù)具有較高的并發(fā)癥和死亡率[3]，其對(duì)腫瘤生物學(xué)行為的影響尚不清楚，為解決臨床上出現(xiàn)的諸多爭(zhēng)議，建立能夠模擬臨床實(shí)踐的動(dòng)物模型是十分必要。2014年，Schlegel等[4]首次報(bào)道，其后陸續(xù)的幾篇相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道也多以嚙齒類動(dòng)物為模型，但方法不盡相同[4-7]。我們?cè)谖墨I(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，前期實(shí)驗(yàn)對(duì)各種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并加以對(duì)比，根據(jù)模型制作的難易程度和臨床實(shí)踐的模擬性，我們采用SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用70%的PVL(左外側(cè)葉、右外側(cè)葉和左中葉的門靜脈支結(jié)扎)和10%肝臟部分切除術(shù)(尾狀葉切除)和左右肝中葉的肝實(shí)質(zhì)80%的離斷，并以右中葉(20%)作為FLR,以此建立大鼠ALPPS模型。實(shí)驗(yàn)中，6只大鼠死于術(shù)中及術(shù)后出血，4只死于術(shù)后感染，為此我們改進(jìn)了實(shí)驗(yàn)方法：(1)在分離解剖左外側(cè)葉肝蒂時(shí)，部分肝蒂包裹于肝臟實(shí)質(zhì)內(nèi)，加之血管纖細(xì)，分離中造成血管破裂和肝實(shí)質(zhì)出血，我們采用在手術(shù)放大鏡下細(xì)致操作，同時(shí)分離動(dòng)脈和膽管后加以懸吊后再分離門靜脈支，可減少術(shù)中出血，另一常見出血原因是在肝實(shí)質(zhì)離斷時(shí)肝靜脈破裂出血，沿缺血平面的稍偏左側(cè)離斷可減少對(duì)肝靜脈的損傷。(2)為防止術(shù)后感染的發(fā)生，在關(guān)腹前，向腹腔內(nèi)滴注慶大霉素2 mg/kg。通過前期的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)及方法的改進(jìn)，在批量模型制備中的成功率達(dá)92%(55/60)。在建立解剖觀察時(shí)相點(diǎn)時(shí)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[8]，大鼠肝臟增殖始于術(shù)后第二天，并在術(shù)后第四天達(dá)到增殖高峰，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，術(shù)后24小時(shí)，ALPPS組、PVL組及對(duì)照組間的FLR再生率無顯著性差異，P值均大于0.05；在術(shù)后48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，ALPPS組、PVL組及對(duì)照組間的FLR再生率分別為(125.84±22.33)%、(97.20±19.92)%、(9.51±10.43)%，ALPPS組、PVL組FLR增生率明顯高于對(duì)照組，但ALPPS組、PVL組FLR增生率無明顯差異，而在術(shù)后96小時(shí)，ALPPS組、PVL組及對(duì)照組間的FLR再生率分別為(260.11±30.40)%、(198.65±41.30)%、(24.96±18.33)%，三組間兩兩比較，差異均具有顯著性，P值均小于0.05，且ALPPS組再生率明顯高于PVL組及對(duì)照組，上述實(shí)驗(yàn)說明，ALPPS操作可明顯促進(jìn)肝臟再生，這與文獻(xiàn)報(bào)道相似[6]。另外，我們對(duì)6只行ALPPSⅠ期手術(shù)的大鼠在術(shù)后4天行二期的擴(kuò)大肝切除，直至術(shù)后1周人為處死，驗(yàn)證了Ⅱ期手術(shù)的可行性及安全性。本實(shí)驗(yàn)的目的是為建立更好模擬臨床實(shí)踐的動(dòng)物模型方法的建立和觀察不同時(shí)相點(diǎn)FLR增殖比率，并沒有進(jìn)行肝臟增生機(jī)制的探討，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，ALPPS組較高的死亡率發(fā)生，為20%(4/20)，這與臨床報(bào)道的類似，如何解決較高的死亡率及并發(fā)癥仍是亟待解決的難題。

通過上述實(shí)驗(yàn)，我們成功地建立大鼠ALPPS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑸楹罄m(xù)的進(jìn)一步研究和探索奠定了良好的動(dòng)物模型基礎(chǔ)。

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