李德強，呂聞耀

(象山縣第二人民醫(yī)院,浙江 寧波315731)

結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，特別在發(fā)達國家發(fā)病率居高不下[1]。我國結(jié)腸癌的發(fā)病率也呈上升趨勢，嚴重影響了人們的健康。最近有文獻報道蛋白酶體抑制劑硼替佐米抑制結(jié)腸癌細胞系HT29細胞增殖[2]。但結(jié)腸癌具有高度適應(yīng)性，在腫瘤內(nèi)相關(guān)的信號機制能激活促存活信號并抑制凋亡信號，最終導(dǎo)致耐藥[3]。因此聯(lián)合應(yīng)用不同靶點的藥物可能會是治療腫瘤的有效手段。

CK2屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶的一種，廣泛參與到多種細胞過程。此外，CK2在多種實體瘤中高表達[4]。大量的研究表明高表達CK2通過多種分子機制和信號級聯(lián)反應(yīng)促使癌癥存活，抑制CK2能促使癌癥對靶向藥物的敏感性[5]。因此，本文想探討CK2抑制劑TBB是否能增強結(jié)腸癌細胞系HT29對硼替佐米的敏感性，從而為臨床治療結(jié)腸癌提供有效的理論支持。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

體外培養(yǎng)的HT29細胞(人結(jié)腸癌細胞)購買自中國科學院細胞庫，培養(yǎng)細胞所用1640培養(yǎng)液和胎牛血清購買自美國Hyclone 公司。硼替佐米(bortezomib)、四溴苯三唑(TBB)、MTT(四甲基偶氮唑藍)均購自美國Sigma公司，western blotting所需抗體Caspase-3以及兔二抗均購買自Santa Cruz公司(美國)。轉(zhuǎn)膜所需的PVDF 膜(0.45 μm)購買自美國 Millipore 公司。

1.2腫瘤細胞培養(yǎng)

用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌HT29細胞，為避免細胞污染，培養(yǎng)液中含有100 U/ml的青霉素和鏈霉素。將細胞培養(yǎng)皿放置在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度調(diào)整為37℃，CO2濃度調(diào)整為5%。每天觀察細胞生長狀態(tài)，1-2天更換培養(yǎng)液一次，細胞長滿培養(yǎng)皿后進行細胞傳代，按照1∶3比例進行傳代，細胞傳代至2-3代處于對數(shù)生長期后進行后續(xù)分組實驗。

1.3細胞增殖率檢測

利用MTT法檢測藥物對細胞增殖率的影響。步驟如下：將處于對數(shù)生長期的HT29細胞按照3000個/孔鋪于96孔板內(nèi)，搖勻，過夜，待細胞完全貼壁后，給予HT29細胞不同濃度藥物(Bortezomib 0 nm,10 nM，20 nM，50 nM)或聯(lián)合CK2抑制劑TBB，每組設(shè)置6個重復(fù)孔，藥物作用完成后，每個孔內(nèi)均加入15 μl MTT(5 mg/mL)工作液，加入后繼續(xù)放入細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3個小時，結(jié)束后利用加樣器完全棄除培養(yǎng)液，棄除溶液后每孔加入180 μl的DMSO(二甲基亞砜)，完全加入后放置于平板振蕩器上混勻振蕩，利用酶標儀檢測吸光度值。

1.4流式細胞儀檢測細胞凋亡率

取對數(shù)生長期的細胞，按照藥物濃度分組作用后，消化收集細胞后，利用預(yù)先冷卻的PBS溶液洗滌細胞3次，洗滌完成后棄除PBS溶液，加入檢測試劑盒內(nèi)的結(jié)合緩沖液500 μl，利用加樣器重懸細胞，將細胞制成單細胞懸液后，每組加入Annexin V-FITC溶液5 μl，混勻后再加入PI溶液5 μl，混勻后室溫孵育 20 min(避光)，最后用流式細胞儀檢測熒光強度。

1.5WesternBlotting檢測各組細胞蛋白質(zhì)表達

為明確各組細胞中凋亡相關(guān)蛋白表達差異，利用免疫印跡(Western Blotting)檢測HT29細胞中cleaved caspase-3的表達水平。細胞分組藥物作用后，消化收集細胞，預(yù)冷PBS洗滌細胞兩次，完全棄除PBS后加入細胞裂解液RIPA150 μl，同時在裂解液內(nèi)加入蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑，冰上孵育5分鐘后，放入冰箱內(nèi)旋轉(zhuǎn)混勻20 min，3 000 rpm/min 離心10 min，盡量取上清，利用BCA方法檢測蛋白濃度后將蛋白濃度稀釋相同，煮沸8 min蛋白變性后放入-20℃冰箱內(nèi)保存用于后續(xù)跑膠。配置10% 濃度分離膠，蛋白完全分離后將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，100V，轉(zhuǎn)膜60 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后放入5%脫脂奶粉中封閉2 h，然后加入稀釋好的Cleaved caspase-3后4℃孵育過夜，第二天加入兔二抗室溫孵育1 h，利用PBST溶液洗膜3次,ECL顯色液對PVDF膜進行顯色拍照。

1.6統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)利用統(tǒng)計分析軟件SPSS13.0版本進行分析。計量數(shù)據(jù)采用M±SD 表示，兩組數(shù)據(jù)采用t檢驗，3組及以上數(shù)據(jù)采用方差分析，利用統(tǒng)計所得數(shù)據(jù)繪制圖表。

2 結(jié)果

2.1蛋白酶體抑制劑硼替佐米對人結(jié)腸癌HT29細胞增殖的影響

MTT檢測硼替佐米對HT29細胞增殖抑制的效果。MTT結(jié)果表明不同劑量的硼替佐米都能抑制HT29細胞的增殖，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。在 50 nM時，硼替佐米的抑制效果最明顯。見表 1。

表1 蛋白酶體抑制劑Bortezomib對結(jié)腸癌HT29細胞生存率的影響

*與Control相比較有統(tǒng)計學差異，P<0.05

2.2硼替佐米誘導(dǎo)了HT29細胞的凋亡

流式細胞儀檢測硼替佐米對HT29細胞凋亡的影響，實驗結(jié)果表明10 nM、20 nM、50 nM都能誘導(dǎo)細胞的凋亡，在50 nM時，細胞凋亡最明顯，見表2。

表2 流式細胞術(shù)檢測Bortezomib對結(jié)腸癌HT29細胞凋亡的影響

*與Control相比較有統(tǒng)計學差異，P<0.05

2.3硼替佐米增加了HT29細胞內(nèi)CleavedCaspase-3的表達

Cleaved Caspase-3 作為凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行分子，在凋亡信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要的作用。實驗結(jié)果表明Control組幾乎不表達Cleaved Caspase-3，不同硼替佐米劑量組能誘導(dǎo)Cleaved Caspase-3 的表達，結(jié)果見圖1。

圖1 Bortezomib對結(jié)腸癌HT29細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

2.4聯(lián)合CK2抑制劑TBB對硼替佐米引起的HT29細胞增殖抑制的影響

實驗分為四組：Control組，硼替佐米組，TBB組及聯(lián)合用藥組。根據(jù)前面實驗結(jié)果，在后面的實驗中，我們選擇硼替佐米的劑量為20 nM。實驗結(jié)果表明與硼替佐米組相比，聯(lián)合用藥組抑制了HT29細胞的增殖。見表3。

表3 聯(lián)合應(yīng)用CK2抑制劑TBB對Bortezomib引起的結(jié)腸癌HT29細胞生存率影響

*與Control相比較有統(tǒng)計學差異，P<0.05；#與Bortezomib組相比較有統(tǒng)計學差異，P<0.05

2.5聯(lián)合TBB對硼替佐米引起的HT29細胞凋亡率升高的影響

流式細胞儀檢測聯(lián)合用藥對HT29細胞凋亡的變化情況，結(jié)果表明聯(lián)合用藥組能明顯增強硼替佐米誘導(dǎo)的HT29細胞的凋亡。見表4。

表4 聯(lián)合應(yīng)用CK2抑制劑TBB對Bortezomib引起的結(jié)腸癌HT29細胞凋亡的影響

*與Control相比較有統(tǒng)計學差異，P<0.05；#與Bortezomib組相比較有統(tǒng)計學差異，P<0.05

2.6聯(lián)合TBB對硼替佐米誘導(dǎo)的HT29細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平的影響

Western blotting檢測不同組細胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3表達。實驗結(jié)果顯示出，與單獨使用硼替佐米作用相比較，聯(lián)合CK2抑制劑TBB可以進一步增加Cleaved Caspase-3的表達水平。見圖2。

圖2 TBB對硼替佐米誘導(dǎo)的HT29細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平的影響

3 討論

硼替佐米是第一代蛋白酶體抑制劑，能抑制26S蛋白酶體亞基的活性。已有研究表明硼替佐米能明顯抑制多發(fā)性骨髓瘤的活性[6]。目前，以硼替佐米為基礎(chǔ)的聯(lián)合療法，結(jié)合傳統(tǒng)的化療藥物和新型制劑，代表著治療多發(fā)性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤的治療標準[7]。本實驗研究表明硼替佐米抑制HT29細胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡并且呈現(xiàn)劑量依賴性。然而，最近有文獻報道盡管硼替佐米能促使抗凋亡分子Mcl1裂解和失活，但它也能維持抑癌基因p53、促凋亡蛋白Bax的活性，促進Noxa和Puma蛋白表達[8]。硼替佐米也能誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這是腫瘤細胞存活的機制之一。促存活的未折疊蛋白反應(yīng)是硼替佐米所誘導(dǎo)的結(jié)果[9]。因此，靶向硼替佐米所誘導(dǎo)的促存活分子是我們研究的目標。

蛋白激酶CK2，也稱為酪蛋白激酶II，是細胞內(nèi)普遍存在的絲氨酸/蘇氨酸激酶。越來越多的實驗表明了CK2是促進腫瘤細胞存活的主要原因之一[4]。CK2通過對Cdc37和Hsp90形成的分子伴侶活性的調(diào)控激活了細胞內(nèi)眾多蛋白酶的活性[10]。CK2調(diào)控著IκBα蛋白周轉(zhuǎn)、p53的功能、AKT的活性和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[11]。Sabrina Manni等人證實了CK2維持多發(fā)性骨髓瘤的生存，而CK2的抑制劑下調(diào)NF-κB和STAT3促存活信號通路，從而增加多發(fā)性骨髓瘤對化療藥物的敏感性[12]。因此本文探討了蛋白酶CK2抑制劑TBB是否能增強硼替佐米對HT29細胞的敏感性。我們的實驗結(jié)果表明TBB增強了硼替佐米的抑制增殖和促進凋亡效應(yīng)，兩者之間具有協(xié)同作用。

綜上所述，硼替佐米抑制了HT29細胞的增殖并促進其凋亡。靶向CK2能增強硼替佐米的殺傷作用。這表明了CK2活性在硼替佐米誘導(dǎo)的HT29細胞凋亡過程中發(fā)揮著促存活的作用。

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