楊磊，劉濤，段繼惠，穆紅

(天津市第一中心醫(yī)院，天津300192)

基因組完整性和穩(wěn)定性對于細(xì)胞生存至關(guān)重要，化學(xué)刺激物能破壞DNA分子影響細(xì)胞生存。H2A蛋白家族是核小體組蛋白八聚體的組成成分，而H2AX是該蛋白家族中的一個(gè)變體。雙鏈DNA發(fā)生斷裂后，H2AX會(huì)被磷酸化形成γ-H2AX，作為DNA雙鏈斷裂的標(biāo)志物[1]。利用化學(xué)藥物損傷基因組DNA是殺傷腫瘤細(xì)胞的重要手段，然而細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)能夠清除DNA損傷[2,3]。因此，干擾DNA修復(fù)功能有利于藥物破壞DNA，增強(qiáng)細(xì)胞對藥物毒性的敏感性。報(bào)道稱，miR-138能抑制修復(fù)點(diǎn)形成誘導(dǎo)DNA損傷[4]；miR-338-5p和miR-890可干擾腫瘤細(xì)胞修復(fù)紫外線、電離輻射造成的DNA損傷[5，6]。miRNA能影響細(xì)胞修復(fù)損傷的DNA，那么，利用miRNA干擾DNA修復(fù)，應(yīng)該能增強(qiáng)細(xì)胞對藥物基因組毒性的敏感性。細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制物1A(CDKN1A)屬于Cip/Kip家族成員，其能夠抑制細(xì)胞增殖和DNA復(fù)制。2017年10月～2018年6月，我們觀察了miR-130b 對宮頸癌細(xì)胞修復(fù)TNF-α誘導(dǎo)性基因組DNA雙鏈斷裂作用的影響，并進(jìn)一步分析CDKN1A基因與miR-130b之間的靶向關(guān)系，為miR-130b作為一種潛在治療宮頸癌的生物學(xué)藥劑提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 宮頸癌細(xì)胞Siha購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫，miR-130b mimics、陰性對照核酸NC(中國Genepharma)，核酸引物(中國AuGCT)；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco BRL)；DNA損傷劑TNF-α(美國Sigma)，DNA損傷增強(qiáng)劑AZD2461(美國Merck Inc)；RNA/DNA X-fect transfection轉(zhuǎn)染試劑、PrimeScriptTMⅡReverse Transcriptase、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ熒光定量PCR試劑盒(日本Takara)；CDKN1A抗體、HRP聯(lián)接IgG Fc抗體(美國Proteintech)，GADPH抗體、ECL顯色劑(美國Bosterbio)，γ-H2AX蛋白抗體、Alexa Fluor?488 dye 聯(lián)接抗體(美國Abcam)；mirVana RNA提取試劑盒(美國Ambion)，LightCycle96 熒光定量PCR儀(瑞士Roche)，Alpha Innotech FluroChem FC2凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Alpha Innotech)，EnSpire Mutilabel Reader酶標(biāo)儀(芬蘭PerkinElmer)；Annexin-V 凋亡檢測試劑盒、BD Accuri C6 Plus流式細(xì)胞儀(美國BD Sciences)。

1.2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將Siha細(xì)胞分6組，分別轉(zhuǎn)染CDKN1A基因過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-CDKN1A(CDKN1A組)、pcDNA3.1空載質(zhì)粒(pcDNA3.1組)、miR-130b mimics (miR-130b組)、miR-130b陰性對照核酸(NC組)，共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CDKN1A和miR-130b mimics (CDKN1A+miR-130b組)、pcDNA3.1和miR-130b mimics (pcDNA3.1+miR-130b組)。轉(zhuǎn)染4 h，更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 miR-130b、CDKN1A影響細(xì)胞修復(fù)雙鏈DNA斷裂觀察

1.3.1 細(xì)胞干擾處理 CDKN1A組、pcDNA3.1組細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后，分別用終濃度為100 ng/mL TNF-α或PBS處理細(xì)胞3 h；miR-130b組、NC組細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后，分別用TNF-α、PBS處理細(xì)胞24 h；CDKN1A+miR-130b、pcDNA3.1+miR-130b組細(xì)胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后，用TNF-α處理24 h。

1.3.2 細(xì)胞基因組DNA尾距測定 采用彗星試驗(yàn)。將各組細(xì)胞與低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠混合鋪在載玻片上；固定后，裂解細(xì)胞；電泳分離后，碘化丙啶染色，拍照，測量DNA尾距；尾距越長，說明雙鏈DNA斷裂位點(diǎn)越多。

1.3.3 細(xì)胞中γ-H2AX 蛋白測定 采用流式細(xì)胞術(shù)。乙醇固定細(xì)胞，用PBS、封閉液BSA清洗細(xì)胞；抗γ-H2AX蛋白一抗、染料聯(lián)接二抗標(biāo)記后，上流式細(xì)胞儀測定γ-H2AX蛋白。檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度，確定γ-H2AX蛋白相對表達(dá)量。

1.4 miR-130b影響CDKN1A表達(dá)觀察 取 miR-130b組、NC組細(xì)胞，分別檢測細(xì)胞中的CDKN1A mRNA及蛋白。① CDKN1A mRNA：采用Real-time PCR法。用SCNRT、Oligo(dT)18逆轉(zhuǎn)錄CDKN1A、內(nèi)參β-actin mRNA；用CDKN1A、β-actin上下游引物擴(kuò)增CDKN1A、β-actin cDNA。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性3 min，95 ℃ 10s 、60 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s, 35個(gè)循環(huán)；以2-ΔΔCT法計(jì)算CDKN1A mRNA相對表達(dá)量。CDKN1A mRNA上游引物5′-CCCGTGAGCGATGGAACTT-3′，下游引物5′-CCCGTGGGAAGGTAGAGCTT-3′； β-actin上游引物5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，下游引物5′-TGTCACCTTCACCGTTCCAGT-3′。②CDKN1A蛋白：采用Western blotting法。蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜和封閉后，用抗CDKN1A、GADPH抗體標(biāo)記目的、內(nèi)參蛋白；HRP聯(lián)接二抗標(biāo)記后，顯色；測定目的、內(nèi)參蛋白灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.5 miR-130b與CDKN1A靶定關(guān)系的預(yù)測與驗(yàn)證 登陸Target Scan Human網(wǎng)站，在靶基因標(biāo)識(shí)一欄中輸入“CDKN1A”，點(diǎn)擊提交后預(yù)測CDKN1A mRNA 3′非編碼區(qū)中是否存在與miR-130b種子序列反向互補(bǔ)的序列。將pcDNA3.1/EGFP(空載)、pcDNA3.1/EGFP-CDKN1A-wtUTR(野生型)和pcDNA3.1/EGFP-CDKN1A-mutUTR(突變型) 3種熒光報(bào)告質(zhì)粒分別與miR-130b mimics或NC共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，激發(fā)光照射細(xì)胞后測定細(xì)胞發(fā)出的散射熒光，根據(jù)熒光強(qiáng)度確定報(bào)告基因相對表達(dá)水平。

1.6 miR-130b影響細(xì)胞凋亡觀察 取miR-130b、NC、CDKN1A+miR-130b及pcDNA3.1+miR-130b組細(xì)胞，用含終濃度分別為100 ng/mL TNF-α和2 μmol/L AZD2461的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞48 h。采用磷脂酰絲氨酸免疫標(biāo)記與DNA碘化丙錠(PI)染色雙標(biāo)記法，用抗體FITC-Annexin-V、PI標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 CDKN1A、miR-130b表達(dá)對細(xì)胞DNA雙鏈斷裂修復(fù)的影響 見表1。

2.2 miR-130b對細(xì)胞CDKN1A表達(dá)的影響 見表2。

2.3 miR-130b與CDKN1A靶定關(guān)系的預(yù)測與驗(yàn)證結(jié)果 CDKN1A mRNA 3′非編碼區(qū)中存在與miR-130b種子序列反向互補(bǔ)的序列，是miR-130b潛在的靶定位點(diǎn)。將空載、野生型和突變型分別與miR-130b mimics共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后其熒光相對活性分別為0.97±0.10、0.85±0.03、1.04±0.07，與NC共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后其熒光相對活性分別為1.00±0.07、1.00±0.03、1.00±0.06，僅野生型與miR-130b mimics共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光相對活性低于與NC共轉(zhuǎn)染細(xì)胞(P<0.05)

2.4 miR-130b對細(xì)胞凋亡水平的影響 經(jīng)TNF-α + AZD2461處理后，miR-130b組細(xì)胞凋亡率11.84%±1.19%，高于NC組的8.63%±0.33%(P<0.05)；CDNK1A+miR-130b組細(xì)胞凋亡率18.23%±2.75%，高于pcDNA3.1+miR-130b組的11.07%±0.67%(P<0.05)。

表1 CDKN1A、miR-130b表達(dá)對細(xì)胞DNA尾距、γH2AX蛋白表達(dá)的影響

注：與同組PBS處理細(xì)胞比較，aP<0.05；與pcDNA3.1組比較，bP<0.05；與NC組比較，cP<0.05；與pcDNA3.1+miR-130b組比較，dP<0.05。

表2 NC、miR-130b組細(xì)胞中CDNK1A mRNA及蛋白表達(dá)比較

注：與NC組比較，aP<0.05。

3 討論

TNF-α是一種參與不同炎癥反應(yīng)過程的多功能細(xì)胞因子，其能破壞鼠肝細(xì)胞、L929細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞中的基因組DNA[7～9]。小鼠CDKN1A基因敲除實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CDKN1A蛋白具有抑制腫瘤發(fā)生的功能，該基因缺失的小鼠在生長過程中會(huì)出現(xiàn)內(nèi)皮瘤及表皮瘤等一系列疾病[10]。在細(xì)胞基因組DNA發(fā)生損傷時(shí)，CDKN1A蛋白能夠通過抑制細(xì)胞周期蛋白E、細(xì)胞周期蛋白A/細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶2復(fù)合物的活性阻礙細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，給細(xì)胞修復(fù)DNA爭取時(shí)間[11]。CDKN1A蛋白通過與PCNA蛋白的伴隨定位和相互作用，在核苷酸、堿基剪切修復(fù)和雙鏈斷裂修復(fù)中發(fā)揮重要作用[12～14]。本研究結(jié)果顯示，與PBS相比，TNF-α處理會(huì)增加pcDNA3.1組細(xì)胞中DNA尾距、γ-H2AX蛋白水平，但不改變CDKN1A組細(xì)胞中相應(yīng)的參數(shù)。這說明，TNF-α刺激能誘發(fā)DNA雙鏈斷裂，而CDKN1A蛋白能修復(fù)雙鏈DNA的斷裂位點(diǎn)。

miRNA通過種子序列識(shí)別靶基因mRNA后，能降解靶基因mRNA或抑制其翻譯調(diào)控基因表達(dá)[15]。信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，CDKN1A mRNA 3′非編碼區(qū)存在miR-130b的靶定位點(diǎn)，這說明CDKN1A基因是miR-130b潛在的靶基因。與共轉(zhuǎn)染NC相比較，共轉(zhuǎn)染miR-130b的細(xì)胞中pcDNA3.1/EGFP-CDKN1A-wtUTR報(bào)告基因熒光活性降低，說明miR-130b能與CDKN1A mRNA的3′非編碼區(qū)結(jié)合影響靶基因表達(dá)；共轉(zhuǎn)染NC與共轉(zhuǎn)染miR-130b細(xì)胞中pcDNA3.1/EGFP-CDKN1A-mutUTR報(bào)告基因的無差異性表達(dá)，說明miR-130b是通過結(jié)合mRNA上預(yù)測的靶定位點(diǎn)抑制基因表達(dá)的。與NC組相比，miR-130b組細(xì)胞中CDKN1A mRNA及蛋白水平降低。這說明miR-130b能通過結(jié)合CDKN1A mRNA 3′非編碼區(qū)促進(jìn)mRNA降解，進(jìn)而抑制蛋白翻譯的方式抑制CDKN1A基因表達(dá)。與NC組相比，TNF-α刺激升高了miR-130b組細(xì)胞中DNA尾距、γ-H2AX蛋白水平；與pcDNA3.1+miR-130b組細(xì)胞相比，CDKN1A+miR-130b組細(xì)胞中DNA尾距、γ-H2AX蛋白降低了。這說明miR-130b通過抑制CDKN1A基因表達(dá)干擾了CDKN1A對TNF-α誘導(dǎo)性雙鏈DNA斷裂的修復(fù)。

雙鏈DNA斷裂是DNA損傷中最嚴(yán)重的損傷形式，單一斷裂點(diǎn)足以誘發(fā)細(xì)胞死亡。因此，修復(fù)雙鏈DNA斷裂位點(diǎn)對于細(xì)胞生存至關(guān)重要[16]。多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)抑制劑能使細(xì)胞產(chǎn)生大量單鏈斷裂位點(diǎn)，該位點(diǎn)可轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA斷裂點(diǎn)[17]。雙鏈斷裂位點(diǎn)誘發(fā)抑癌基因p53的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。用TNF-α、PARP抑制劑AZD2461處理細(xì)胞后，miR-130b mimics增加細(xì)胞凋亡率而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CDKN1A減輕miR-130b對細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。這些說明利用miR-130b mimics來干擾CDKN1A基因表達(dá)，抑制CDKN1A蛋白對TNF-α誘導(dǎo)性DNA雙鏈斷裂的修復(fù)作用，能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，我們認(rèn)為在TNF-α和AZD2461存在的條件下，miR-130b可以通過抑制CDKN1A基因表達(dá)阻止宮頸癌對TNF-α藥物誘導(dǎo)性DNA雙鏈斷裂的修復(fù)作用，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞對TNF-α殺傷作用的敏感性。因此，miR-130b有望成為一種潛在的治療宮頸癌的生物學(xué)藥劑。