馬文靜，徐浩銓，白冰心，吳夢婷，張亞樓

（1.新疆醫(yī)科大學(xué) 中心實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011）

MicroRNA（miRNA）是一種小的非編碼內(nèi)源性RNA 分子（19 ～25 nt），通過靶向mRNA 來控制轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)水平[1-2]。據(jù)推測＞60%的人類基因編碼蛋白質(zhì)在非編碼的3'UTR 中具有miRNA 結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域，miRNA 通過與靶基因的3'UTR 部分序列互補(bǔ)結(jié)合后，抑制該基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的調(diào)控[3]。

miRNA 在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖、分化及凋亡過程中發(fā)揮了重要作用。在成骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展的過程中，涉及轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）、Wnt 等多種轉(zhuǎn)錄途徑，且上述轉(zhuǎn)錄途徑受miRNA 嚴(yán)格調(diào)控。TGF-β2是TGF-β 超家族的成員之一，前期研究發(fā)現(xiàn)用氟化鈉處理Saos-2 細(xì)胞48 h 后miR-212-3p 的表達(dá)上調(diào)[4]，并且通過生物信息學(xué)軟件Targetscan（http：//www.targetscan.org/mamm_31/）預(yù)測發(fā)現(xiàn)TGF-β2基因是miR-212-3p 的潛在靶基因，且其3'UTR 與miR-212-3p 存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。但是目前尚未有TGF-β2與miR-212-3p 靶向關(guān)系的研究。因此本研究采用PCR擴(kuò)增TGF-β23'UTR，并將其克隆至熒光素酶報(bào)告載體（pYr-MirTarget）上，構(gòu)建TGF-β23'UTR 雙熒光素酶報(bào)告重組載體，通過轉(zhuǎn)染Saos-2 細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)、qRT-PCR 以及Western blotting 驗(yàn)證miR-212-3p 與TGF-β2的靶向關(guān)系，為進(jìn)一步研究成骨細(xì)胞凋亡過程中miR-212-3p 調(diào)控作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

人成骨肉瘤細(xì)胞株Saos-2 由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供，人TGF-β2克隆質(zhì)粒由日本TaKaRa 公司提供。

1.1.1 主要試劑和儀器胎牛血清（FBS）、細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）和轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectamine 2000）均購自美國Thermo Fisher 公司，miR-212-3p 核苷類（mimics）、陰性對(duì)照無核苷類（NC mimics）和抑制劑（inhibitor）成品購自德國Qiagen 公司，雙熒光素酶檢測試劑盒和蛋白酶抑制劑（PMSF）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，pYr-MirTarget 購自長沙贏潤生物技術(shù)有限公司，蛋白裂解液（RIPA）購自杭州弗德生物科技有限公司，TGF-β2（貨號(hào)：8406LF）和GAPDH（貨號(hào)：14C10）單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司，薄型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，BCA 蛋白定量試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，T4 DNA 連接酶（Ligase）、NotⅠ、XhoⅠ、TaKaRa TaqTM及RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR 熒光定量PCR 試劑盒購自日本TaKaRa 公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱和Nanodrop-2000 核酸定量儀購自美國Thermo Fisher 公司，高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf 公司，qRT-PCR 儀購自美國Life Technologies 公司。

1.1.2 引物設(shè)計(jì)與合成U6（內(nèi)參）和hsa-miR-212的逆轉(zhuǎn)錄引物參照CHEN 等[5]的方法設(shè)計(jì)莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物，U6、hsa-miR-212、GAPDH（內(nèi)參）和TGF-β2各設(shè)計(jì)1 對(duì)qRT-PCR 引物（見表1），引物的設(shè)計(jì)和合成由德國凱杰公司完成。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體通過Targetscan軟件獲取miR-212-3p與TGF-β2基因3'UTR 潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)（3'UTR 全長3 257 bp，第746 ～753 位堿基存在miR-212-3p 的潛在結(jié)合位點(diǎn)），設(shè)計(jì)成對(duì)PCR 擴(kuò)增引物（靶點(diǎn)上下游各100 bp 左右，共208 bp），在正向和反向引物5’端分別引入NotⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，構(gòu)建含有miR-212-3p 應(yīng)答序列的TGF-β23'UTR 片段。miR-212-3p 應(yīng)答序列的TGF-β23'UTR 片段的正向引物（XhoⅠ）：5'-GGCGCTCGAGTATATGACCGAGAAAGTCT-3'， 反向引物（NotⅠ）：5'-AATGCGGCCGCTTCAACATTTC ACTGGTTT-3'（下劃線為XhoⅠ和NotⅠ的酶切位點(diǎn)序列，其前面的堿基為保護(hù)堿基）。

表1 引物序列

人TGF-β2克隆質(zhì)粒經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，將獲得的PCR 產(chǎn)物與pYr-MirTarget 質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶NotⅠ和XhoⅠ切膠后回收，將回收純化的目的片段TGF-β23'UTR 與回收純化的載體pYr-MirTarget 用T4 連接酶連接過夜（16℃），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB/氨芐青霉素平板，37℃溫箱培養(yǎng)過夜，挑取單個(gè)菌搖菌37℃過夜，采用菌落PCR 法將鑒定正確的菌液采用通用引物測序，測序結(jié)果比對(duì)后將結(jié)果正確的菌液克隆于-80℃超低溫冰箱保存，并大量制備pYr-MirTarget-TGF-β2 3'UTR 質(zhì)粒，提取質(zhì)粒并命名為TGF-β2-Luc。

1.2.2 miR-212-3p 與TGF-β2-Luc 共轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞37℃水浴復(fù)蘇Saos-2 細(xì)胞，加入DMEM 培養(yǎng)基（含10% FBS）后置于37℃、50%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用DMEM 培養(yǎng)基（含10% FBS）制備Saos-2 單細(xì)胞懸液，按照2×105個(gè)/孔的密度將細(xì)胞均勻地接種到細(xì)胞培養(yǎng)板（12 孔），置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)1.8×105個(gè)/孔時(shí)，使用無血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h 后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用LipofectamineTM2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染，對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品均需用100μl 無血清opti-MEM 分別稀釋2μg 質(zhì)粒DNA，然后取4μl LipofectamineTM2000 稀釋至100μl 無血清opti-MEM 中，將LipofectamineTM2000 和上述稀釋液（總體積為200μl）輕輕混勻并在室溫下靜置20 min，每個(gè)培養(yǎng)孔加混合液200μl，前后輕輕搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)板使混合液與培養(yǎng)板中培養(yǎng)液混勻，最后將細(xì)胞放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h 后吸出混合液換入正常培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞。按照以下分組轉(zhuǎn)染細(xì)胞：miR-212-3p-mimics+TGF-β23'UTR 共 轉(zhuǎn) 染 組、mimics NC+TGF-β2 3'UTR 共 轉(zhuǎn) 染 組（ 對(duì) 照 組）、miR-212-3p-inhibitor+TGF-β23'UTR 共 轉(zhuǎn) 染 組、inhibitor NC+TGF-β23'UTR 共轉(zhuǎn)染組、TGF-β23'UTR 轉(zhuǎn)染組、pYr-MirTarget 空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、正常細(xì)胞組，每個(gè)轉(zhuǎn)染組重復(fù)3 次。

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測熒光素酶活性收集上述各轉(zhuǎn)染組的Saos-2 細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液后加入300μl 細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞后12 000 r/min離心5 min，吸取上清液用于測定其雙熒光素酶活性。按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性，各轉(zhuǎn)染組檢測相對(duì)熒光素酶活性3 次，取平均值。對(duì)3 次測定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算兩者相對(duì)熒光強(qiáng)度的比值，以比值作為相對(duì)熒光素酶活性的結(jié)果。

1.2.4 qRT-PCR 檢 測hsa-miR-212 和TGF-β2 mRNA當(dāng)Saos-2 細(xì)胞密度達(dá)到1.8×105個(gè)/孔時(shí)，分別轉(zhuǎn)染NC mimics、miR-212-3p mimics 及inhibitor，48 h 后收集細(xì)胞，采用日本TaKaRa 公司MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（貨 號(hào)：NO9767）提 取總RNA，Nanodrop-2000 紫外分光光度儀檢測RNA 的濃度和質(zhì)量，每組2.0μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，U6 和hsa-miR-212 的逆轉(zhuǎn)錄引物采用莖環(huán)引物，GAPDH 和TGF-β2的引物采用Oligo（dT），逆轉(zhuǎn)錄條件：50℃逆轉(zhuǎn)錄mRNA 為cDNA 15 min，85 ℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5 min，-20℃保存。分別以上述cDNA（稀釋6 倍）為模板，4 個(gè)基因的PCR 引物進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：50℃熱啟動(dòng)2 min，95℃預(yù)變性10 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s（采集熒光），共40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線分析擴(kuò)增結(jié)果，設(shè)定閾值后確定每一管反應(yīng)的CT 值，各個(gè)細(xì)胞處理組3 個(gè)復(fù)孔，按照2-△△Ct法計(jì)算目的基因和內(nèi)參的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Western blotting檢測TGF-β2蛋白按照1.2.4的方法獲取細(xì)胞后加入RIPA 裂解（含PMSF，比例為1∶100），提取各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞蛋白，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定各組蛋白含量，以20μg/孔蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，然后將膠轉(zhuǎn)移至同等大小的PVDF 上，恒壓穩(wěn)流（120 V、250 mA）轉(zhuǎn)膜2 h，室溫封閉孵育2 h，加入一抗后4℃過夜孵育，以GAPGH 為內(nèi)參（TGF-β2和GAPDH 抗體稀釋比例為1∶1 000，1×TBST 洗滌4 次，10 min/次），加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h 后，最后采用ECL 化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達(dá)，采集圖像后使用Image J 軟件確定目的蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值，使用TGF-β2/GAPDH 來確定TGF-β2蛋白在各個(gè)轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體

通過Targetscan軟件預(yù)測miR-212-3p 與TGF-β2基因存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)（見圖1）。將TGF-β2基因3'UTR 基因片段（208 bp）克隆到pYr-MirTarget 報(bào)告載體測序后顯示成功構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體。見圖2。

圖1 miR-212-3p 與TGF-β2 基因互補(bǔ)結(jié)合的靶位點(diǎn)預(yù)測

圖2 TGF-β2 3'UTR 載體構(gòu)建測序序列比對(duì)

2.2 miR-212-3p 靶向結(jié)合TGF-β2 3'UTR 抑制熒光素酶活性

將TGF-β2-Luc 重組質(zhì)粒、miR-212-3p mimics、NC mimics 及inhibitor 片段共轉(zhuǎn)染Saos-2 細(xì)胞，每個(gè)轉(zhuǎn)染組設(shè)置3 組平行實(shí)驗(yàn)組，使用雙螢光素酶報(bào)告試劑盒檢測和分析其熒光素酶活性。雙熒光素酶活性檢測結(jié)果表明，各組熒光素酶活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較顯示，miR-212-3p-mimics+TGF-β23'UTR 共轉(zhuǎn)染組低于對(duì)照組（P＜0.05）；inhibitor NC+TGF-β23'UTR 共轉(zhuǎn)染組和TGF-β23'UTR 轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；pYr-MirTarget 空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組高于對(duì)照組（P＜0.05）。見表2和圖3。

2.3 miR-212-3p 靶向抑制TGF-β2 基因的表達(dá)

qRT-PCR 結(jié)果顯示，以U6 為內(nèi)參，各組hasmiR-212 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。miR-212-3p-mimics+TGF-β23'UTR 共 轉(zhuǎn)染組最高（P＜0.05），miR-212-3p-inhibitor+TGF-β23'UTR 共轉(zhuǎn)染組最低（P＜0.05）；對(duì)照組和inhibitor NC+TGF-β23'UTR 共轉(zhuǎn)染組與正常細(xì)胞組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以GAPDH 為內(nèi)參，各組TGF-β2mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），miR-212-3p-mimics+TGF-β23'UTR 共 轉(zhuǎn)染組最低（P＜0.05），miR-212-3p-inhibitor+TGF-β2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組最高（P＜0.05）。對(duì)照組和inhibitor NC+TGF-β23'UTR 共轉(zhuǎn)染組與正常細(xì)胞組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3和圖4。

表2 各組Saos-2 細(xì)胞熒光素酶活性的比較 （n =3，±s）

表2 各組Saos-2 細(xì)胞熒光素酶活性的比較 （n =3，±s）

組別 熒光素酶活性miR-212-3p-mimics+TGF-β2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組 7.7524±0.2024對(duì)照組 12.5994±0.3728 miR-212-3p-inhibitor+TGF-β2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組 14.8676±0.3569 inhibitor NC+TGF-β2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組 12.3573±0.1305 TGF-β2 3'UTR 轉(zhuǎn)染組 13.0892±0.2979 pYr-MirTarget 空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組 14.7066±0.3697正常細(xì)胞組 1.1264±0.1238 F 值 901.005 P 值 0.000

圖3 各組Saos-2 細(xì)胞熒光素酶活性比較 （±s）

2.4 miR-212-3p 靶向抑制TGF-β2 蛋白的表達(dá)

各組TGF-β2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。miR-212-3p-inhibitor+TGF-β23'UTR 共轉(zhuǎn)染組最高（P＜0.05），miR-212-3p-mimics+TGF-β23'UTR 共轉(zhuǎn)染組最低（P＜0.05）。對(duì)照組和inhibitor NC+TGF-β23'UTR 共轉(zhuǎn)染組與正常細(xì)胞組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4和圖5。

表3 各組has-miR-212 和TGF-β2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 （n =3，±s）

表3 各組has-miR-212 和TGF-β2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 （n =3，±s）

組別 has-miR-212 mRNA TGFβ2 mRNA正常細(xì)胞組 1.007±0.148 1.006±0.142 miR-212-3p-mimics+TGF-β2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組 2.727±0.245 0.550±0.077 miR-212-3p-inhibitor+TGF-β2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組 0.283±0.025 1.398±0.197對(duì)照組 1.022±0.150 1.042±0.147 inhibitor NC+TGFβ2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組 0.906±0.133 1.115±0.158 F 值 101.587 12.533 P 值 0.000 0.001

圖4 各組has-miR-212 和TGF-β2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表4 各組TGFβ2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n =3，±s）

表4 各組TGFβ2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （n =3，±s）

組別 TGF-β2 蛋白正常細(xì)胞組 0.475±0.026 miR-212-3p-mimics+TGF-β2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組 0.217±0.019 miR-212-3p-inhibitor+TGF-β2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組 0.648±0.023對(duì)照組 0.453±0.013 inhibitor NC+TGF-β2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組 0.487±0.026 F 值 147.763 P 值 0.000

圖5 各組TGF-β2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

3 討論

miRNA 是小的內(nèi)源性RNA 分子，單個(gè)miRNA 可作用于≥1 個(gè)靶mRNA，這依賴于miRNA 與靶mRNA堿基互補(bǔ)配對(duì)方式。大多數(shù)靶向的mRNA 通過其3'UTR 與miRNA 相互作用，根據(jù)互補(bǔ)程度，miRNA 可以通過切割磷酸二酯鍵直接破壞mRNA 或部分互補(bǔ)從而抑制其表達(dá)。在哺乳動(dòng)物中，miRNA 和靶向mRNA的3'UTR 不能完全互補(bǔ)，通過翻譯抑制靶向mRNA 的表達(dá)來發(fā)揮作用[6]。miRNA 對(duì)mRNA 翻譯的抑制作用已經(jīng)成為人成骨細(xì)胞的發(fā)育過程，參與成骨信號(hào)通路、成骨細(xì)胞生長、分化以及凋亡的重要調(diào)控因子。

近年來，氟中毒對(duì)骨骼危害的研究越來越多，小劑量的氟可以起到預(yù)防作用并刺激骨細(xì)胞的增殖，大劑量則可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起骨質(zhì)疏松或骨質(zhì)硬化從而導(dǎo)致氟骨癥。氟骨癥主要的病理變化是成骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，破壞破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)換過程的平衡，但其具體的分子機(jī)制尚不明確。本課題組前期利用與成骨細(xì)胞凋亡相關(guān)的miRNA PCR 芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)氟化鈉處理人成骨細(xì)胞48 h 后miR-212-3p 表達(dá)上調(diào)[4]。最初的研究發(fā)現(xiàn)miR-212-3p 參與神經(jīng)元的形成、調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、控制藥物成癮和免疫調(diào)節(jié)[7]，除了上述功能外，其在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用，其抑制作用與細(xì)胞周期阻滯、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程和細(xì)胞凋亡相關(guān)[8-11]。例如其通過抑制結(jié)締組織生長因子和轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白A1（FOXA1）在人肝癌細(xì)胞中表達(dá)，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲[12-13]，靶向結(jié)合甲基化CpG 結(jié)合蛋白-2 并下調(diào)其表達(dá)，阻止早期神經(jīng)發(fā)生[14]和參與感染誘導(dǎo)的早產(chǎn)[15]，直接靶向有絲分裂原活化蛋白激酶3 來抑制卵巢癌進(jìn)一步發(fā)展[16]，在膀胱癌中靶向結(jié)合核因子IA 抑制癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。此外，在骨肉瘤患者中已發(fā)現(xiàn)包括miR-212 在內(nèi)的特定miRNA 的失調(diào)，LIU 等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-212 可以直接結(jié)合FOXA1 mRNA 3'UTR序列，并且在MG-63 和Saos-2 骨肉瘤細(xì)胞中負(fù)調(diào)控FOXA1 蛋白的表達(dá)。裴祎等[18]研究證實(shí)miR-212 可以直接作用于鋅指蛋白133，通過抑制其表達(dá)從而抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移。

人們對(duì)成骨細(xì)胞凋亡過程中miR-212-3p 的調(diào)控機(jī)制及其靶基因了解甚少。故本研究前期通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-212-3p 的靶基因時(shí)發(fā)現(xiàn)TGF-β2基因的3'UTR 與其存在潛在的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，并且通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-212-3p 直接靶向TGF-β2并抑制其表達(dá)。TGF-β2是TGF-β 超家族成員之一，TGF-β超家族成員除包含TGF-βs（哺乳動(dòng)物中TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3）以外，還包括激活素、BMP 以及生長和分化因子等40 個(gè)成員[19-21]。TGF-β 是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的，骨是TGF-β 主要的組織來源，被認(rèn)為是用于調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞經(jīng)典的耦合因子之一。可用于成骨細(xì)胞，調(diào)節(jié)其增殖和分化，一方面是因?yàn)槌晒羌?xì)胞自身可以合成分泌TGF-β，另一方面是因?yàn)槌晒羌?xì)胞細(xì)胞膜上有各個(gè)亞型的特異性受體。TGF-β 家族蛋白首先和細(xì)胞膜表面特異性的Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合形成異源復(fù)合物，Ⅱ型受體激活后，使得Ⅰ型受體磷酸化，活化的Ⅰ型受體通過磷酸化的Smad 蛋白和R-Smads 啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，隨后活化的R-Smads 與co-Smad 和Smad4形成復(fù)合物，將信號(hào)從膜外傳遞到細(xì)胞核內(nèi)開啟轉(zhuǎn)錄應(yīng)答。TGF-β2通過與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜上的TGF-β2R Ⅰ和TGF-β2R Ⅱ結(jié)合形成復(fù)合物，激活后的TGF-βR Ⅰ通過Smad 蛋白促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成[22]。成骨細(xì)胞分化早期階段的體外研究表明，TGF-β主要通過促進(jìn)成骨細(xì)胞祖細(xì)胞的遷移并刺激其增殖來增加骨形成[23]，在以后的階段，TGF-β 以Smad3 依賴的方式阻斷成骨細(xì)胞的分化和骨礦化[24-25]。TGF-β阻斷成骨細(xì)胞的凋亡，從而在分化過程中維持成骨細(xì)胞的存活，由此可以推斷TGF-β2參與并調(diào)控成骨細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本研究通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)TGF-β2是miR-212-3p 的靶基因，miR-212-3p 可以與TGF-β23'UTR 靶向結(jié)合發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。此外Western blotting 和qRT-PCR 檢測結(jié)果表明，Saos-2 細(xì)胞外源添加miR-212-3p 后，TGF-β2的mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量都明顯下降，這些結(jié)果提示miR-212-3p 負(fù)向調(diào)控靶基因TGF-β2，這一結(jié)果為后續(xù)研究氟骨癥中miR-212-3p 的作用提供了參考。目前，發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞凋亡過程中miRNA 的數(shù)量逐漸增多，但仍需發(fā)現(xiàn)更多的miRNA 調(diào)控其靶基因中的分子機(jī)制，為成骨細(xì)胞的凋亡及過量氟中毒患者的臨床治療提供更多的方法和參考。