馬文靜，徐浩銓，白冰心，吳夢婷，張亞樓

（1.新疆醫(yī)科大學(xué) 中心實驗室，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011）

MicroRNA（miRNA）是一種小的非編碼內(nèi)源性RNA 分子（19 ～25 nt），通過靶向mRNA 來控制轉(zhuǎn)錄后基因的表達水平[1-2]。據(jù)推測＞60%的人類基因編碼蛋白質(zhì)在非編碼的3'UTR 中具有miRNA 結(jié)合位點區(qū)域，miRNA 通過與靶基因的3'UTR 部分序列互補結(jié)合后，抑制該基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯，從而實現(xiàn)對靶基因的調(diào)控[3]。

miRNA 在調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖、分化及凋亡過程中發(fā)揮了重要作用。在成骨細胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展的過程中，涉及轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）、Wnt 等多種轉(zhuǎn)錄途徑，且上述轉(zhuǎn)錄途徑受miRNA 嚴格調(diào)控。TGF-β2是TGF-β 超家族的成員之一，前期研究發(fā)現(xiàn)用氟化鈉處理Saos-2 細胞48 h 后miR-212-3p 的表達上調(diào)[4]，并且通過生物信息學(xué)軟件Targetscan（http：//www.targetscan.org/mamm_31/）預(yù)測發(fā)現(xiàn)TGF-β2基因是miR-212-3p 的潛在靶基因，且其3'UTR 與miR-212-3p 存在互補結(jié)合位點。但是目前尚未有TGF-β2與miR-212-3p 靶向關(guān)系的研究。因此本研究采用PCR擴增TGF-β23'UTR，并將其克隆至熒光素酶報告載體（pYr-MirTarget）上，構(gòu)建TGF-β23'UTR 雙熒光素酶報告重組載體，通過轉(zhuǎn)染Saos-2 細胞，采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)、qRT-PCR 以及Western blotting 驗證miR-212-3p 與TGF-β2的靶向關(guān)系，為進一步研究成骨細胞凋亡過程中miR-212-3p 調(diào)控作用的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

人成骨肉瘤細胞株Saos-2 由中國科學(xué)院上海細胞庫提供，人TGF-β2克隆質(zhì)粒由日本TaKaRa 公司提供。

1.1.1 主要試劑和儀器胎牛血清（FBS）、細胞培養(yǎng)基（DMEM）和轉(zhuǎn)染試劑（Lipofectamine 2000）均購自美國Thermo Fisher 公司，miR-212-3p 核苷類（mimics）、陰性對照無核苷類（NC mimics）和抑制劑（inhibitor）成品購自德國Qiagen 公司，雙熒光素酶檢測試劑盒和蛋白酶抑制劑（PMSF）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，pYr-MirTarget 購自長沙贏潤生物技術(shù)有限公司，蛋白裂解液（RIPA）購自杭州弗德生物科技有限公司，TGF-β2（貨號：8406LF）和GAPDH（貨號：14C10）單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司，薄型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司，BCA 蛋白定量試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，T4 DNA 連接酶（Ligase）、NotⅠ、XhoⅠ、TaKaRa TaqTM及RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR 熒光定量PCR 試劑盒購自日本TaKaRa 公司。細胞培養(yǎng)箱和Nanodrop-2000 核酸定量儀購自美國Thermo Fisher 公司，高速冷凍離心機購自德國Eppendorf 公司，qRT-PCR 儀購自美國Life Technologies 公司。

1.1.2 引物設(shè)計與合成U6（內(nèi)參）和hsa-miR-212的逆轉(zhuǎn)錄引物參照CHEN 等[5]的方法設(shè)計莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物，U6、hsa-miR-212、GAPDH（內(nèi)參）和TGF-β2各設(shè)計1 對qRT-PCR 引物（見表1），引物的設(shè)計和合成由德國凱杰公司完成。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建熒光素酶報告基因載體通過Targetscan軟件獲取miR-212-3p與TGF-β2基因3'UTR 潛在的互補結(jié)合位點（3'UTR 全長3 257 bp，第746 ～753 位堿基存在miR-212-3p 的潛在結(jié)合位點），設(shè)計成對PCR 擴增引物（靶點上下游各100 bp 左右，共208 bp），在正向和反向引物5’端分別引入NotⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點，構(gòu)建含有miR-212-3p 應(yīng)答序列的TGF-β23'UTR 片段。miR-212-3p 應(yīng)答序列的TGF-β23'UTR 片段的正向引物（XhoⅠ）：5'-GGCGCTCGAGTATATGACCGAGAAAGTCT-3'， 反向引物（NotⅠ）：5'-AATGCGGCCGCTTCAACATTTC ACTGGTTT-3'（下劃線為XhoⅠ和NotⅠ的酶切位點序列，其前面的堿基為保護堿基）。

表1 引物序列

人TGF-β2克隆質(zhì)粒經(jīng)PCR 擴增后，將獲得的PCR 產(chǎn)物與pYr-MirTarget 質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶NotⅠ和XhoⅠ切膠后回收，將回收純化的目的片段TGF-β23'UTR 與回收純化的載體pYr-MirTarget 用T4 連接酶連接過夜（16℃），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細胞，涂布LB/氨芐青霉素平板，37℃溫箱培養(yǎng)過夜，挑取單個菌搖菌37℃過夜，采用菌落PCR 法將鑒定正確的菌液采用通用引物測序，測序結(jié)果比對后將結(jié)果正確的菌液克隆于-80℃超低溫冰箱保存，并大量制備pYr-MirTarget-TGF-β2 3'UTR 質(zhì)粒，提取質(zhì)粒并命名為TGF-β2-Luc。

1.2.2 miR-212-3p 與TGF-β2-Luc 共轉(zhuǎn)染Saos-2細胞37℃水浴復(fù)蘇Saos-2 細胞，加入DMEM 培養(yǎng)基（含10% FBS）后置于37℃、50%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用DMEM 培養(yǎng)基（含10% FBS）制備Saos-2 單細胞懸液，按照2×105個/孔的密度將細胞均勻地接種到細胞培養(yǎng)板（12 孔），置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達1.8×105個/孔時，使用無血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h 后進行轉(zhuǎn)染。使用LipofectamineTM2000 進行轉(zhuǎn)染，對于每個轉(zhuǎn)染樣品均需用100μl 無血清opti-MEM 分別稀釋2μg 質(zhì)粒DNA，然后取4μl LipofectamineTM2000 稀釋至100μl 無血清opti-MEM 中，將LipofectamineTM2000 和上述稀釋液（總體積為200μl）輕輕混勻并在室溫下靜置20 min，每個培養(yǎng)孔加混合液200μl，前后輕輕搖動細胞培養(yǎng)板使混合液與培養(yǎng)板中培養(yǎng)液混勻，最后將細胞放置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h 后吸出混合液換入正常培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后收集細胞。按照以下分組轉(zhuǎn)染細胞：miR-212-3p-mimics+TGF-β23'UTR 共 轉(zhuǎn) 染 組、mimics NC+TGF-β2 3'UTR 共 轉(zhuǎn) 染 組（ 對 照 組）、miR-212-3p-inhibitor+TGF-β23'UTR 共 轉(zhuǎn) 染 組、inhibitor NC+TGF-β23'UTR 共轉(zhuǎn)染組、TGF-β23'UTR 轉(zhuǎn)染組、pYr-MirTarget 空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、正常細胞組，每個轉(zhuǎn)染組重復(fù)3 次。

1.2.3 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測熒光素酶活性收集上述各轉(zhuǎn)染組的Saos-2 細胞，棄去細胞培養(yǎng)液后加入300μl 細胞裂解液，充分裂解細胞后12 000 r/min離心5 min，吸取上清液用于測定其雙熒光素酶活性。按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性，各轉(zhuǎn)染組檢測相對熒光素酶活性3 次，取平均值。對3 次測定的實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計算兩者相對熒光強度的比值，以比值作為相對熒光素酶活性的結(jié)果。

1.2.4 qRT-PCR 檢 測hsa-miR-212 和TGF-β2 mRNA當Saos-2 細胞密度達到1.8×105個/孔時，分別轉(zhuǎn)染NC mimics、miR-212-3p mimics 及inhibitor，48 h 后收集細胞，采用日本TaKaRa 公司MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（貨 號：NO9767）提 取總RNA，Nanodrop-2000 紫外分光光度儀檢測RNA 的濃度和質(zhì)量，每組2.0μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，U6 和hsa-miR-212 的逆轉(zhuǎn)錄引物采用莖環(huán)引物，GAPDH 和TGF-β2的引物采用Oligo（dT），逆轉(zhuǎn)錄條件：50℃逆轉(zhuǎn)錄mRNA 為cDNA 15 min，85 ℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5 min，-20℃保存。分別以上述cDNA（稀釋6 倍）為模板，4 個基因的PCR 引物進行qRT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件：50℃熱啟動2 min，95℃預(yù)變性10 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s（采集熒光），共40 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線分析擴增結(jié)果，設(shè)定閾值后確定每一管反應(yīng)的CT 值，各個細胞處理組3 個復(fù)孔，按照2-△△Ct法計算目的基因和內(nèi)參的mRNA相對表達量。

1.2.5 Western blotting檢測TGF-β2蛋白按照1.2.4的方法獲取細胞后加入RIPA 裂解（含PMSF，比例為1∶100），提取各轉(zhuǎn)染組細胞蛋白，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定各組蛋白含量，以20μg/孔蛋白上樣量進行SDS-PAGE 電泳，然后將膠轉(zhuǎn)移至同等大小的PVDF 上，恒壓穩(wěn)流（120 V、250 mA）轉(zhuǎn)膜2 h，室溫封閉孵育2 h，加入一抗后4℃過夜孵育，以GAPGH 為內(nèi)參（TGF-β2和GAPDH 抗體稀釋比例為1∶1 000，1×TBST 洗滌4 次，10 min/次），加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h 后，最后采用ECL 化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達，采集圖像后使用Image J 軟件確定目的蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值，使用TGF-β2/GAPDH 來確定TGF-β2蛋白在各個轉(zhuǎn)染組細胞中的表達情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步的兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建熒光素酶報告基因載體

通過Targetscan軟件預(yù)測miR-212-3p 與TGF-β2基因存在互補結(jié)合位點（見圖1）。將TGF-β2基因3'UTR 基因片段（208 bp）克隆到pYr-MirTarget 報告載體測序后顯示成功構(gòu)建熒光素酶報告基因載體。見圖2。

圖1 miR-212-3p 與TGF-β2 基因互補結(jié)合的靶位點預(yù)測

圖2 TGF-β2 3'UTR 載體構(gòu)建測序序列比對

2.2 miR-212-3p 靶向結(jié)合TGF-β2 3'UTR 抑制熒光素酶活性

將TGF-β2-Luc 重組質(zhì)粒、miR-212-3p mimics、NC mimics 及inhibitor 片段共轉(zhuǎn)染Saos-2 細胞，每個轉(zhuǎn)染組設(shè)置3 組平行實驗組，使用雙螢光素酶報告試劑盒檢測和分析其熒光素酶活性。雙熒光素酶活性檢測結(jié)果表明，各組熒光素酶活性比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較顯示，miR-212-3p-mimics+TGF-β23'UTR 共轉(zhuǎn)染組低于對照組（P＜0.05）；inhibitor NC+TGF-β23'UTR 共轉(zhuǎn)染組和TGF-β23'UTR 轉(zhuǎn)染組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；pYr-MirTarget 空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組高于對照組（P＜0.05）。見表2和圖3。

2.3 miR-212-3p 靶向抑制TGF-β2 基因的表達

qRT-PCR 結(jié)果顯示，以U6 為內(nèi)參，各組hasmiR-212 mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。miR-212-3p-mimics+TGF-β23'UTR 共 轉(zhuǎn)染組最高（P＜0.05），miR-212-3p-inhibitor+TGF-β23'UTR 共轉(zhuǎn)染組最低（P＜0.05）；對照組和inhibitor NC+TGF-β23'UTR 共轉(zhuǎn)染組與正常細胞組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。以GAPDH 為內(nèi)參，各組TGF-β2mRNA 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），miR-212-3p-mimics+TGF-β23'UTR 共 轉(zhuǎn)染組最低（P＜0.05），miR-212-3p-inhibitor+TGF-β2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組最高（P＜0.05）。對照組和inhibitor NC+TGF-β23'UTR 共轉(zhuǎn)染組與正常細胞組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3和圖4。

表2 各組Saos-2 細胞熒光素酶活性的比較 （n =3，±s）

表2 各組Saos-2 細胞熒光素酶活性的比較 （n =3，±s）

組別 熒光素酶活性miR-212-3p-mimics+TGF-β2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組 7.7524±0.2024對照組 12.5994±0.3728 miR-212-3p-inhibitor+TGF-β2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組 14.8676±0.3569 inhibitor NC+TGF-β2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組 12.3573±0.1305 TGF-β2 3'UTR 轉(zhuǎn)染組 13.0892±0.2979 pYr-MirTarget 空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組 14.7066±0.3697正常細胞組 1.1264±0.1238 F 值 901.005 P 值 0.000

圖3 各組Saos-2 細胞熒光素酶活性比較 （±s）

2.4 miR-212-3p 靶向抑制TGF-β2 蛋白的表達

各組TGF-β2蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。miR-212-3p-inhibitor+TGF-β23'UTR 共轉(zhuǎn)染組最高（P＜0.05），miR-212-3p-mimics+TGF-β23'UTR 共轉(zhuǎn)染組最低（P＜0.05）。對照組和inhibitor NC+TGF-β23'UTR 共轉(zhuǎn)染組與正常細胞組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4和圖5。

表3 各組has-miR-212 和TGF-β2 mRNA 相對表達量比較 （n =3，±s）

表3 各組has-miR-212 和TGF-β2 mRNA 相對表達量比較 （n =3，±s）

組別 has-miR-212 mRNA TGFβ2 mRNA正常細胞組 1.007±0.148 1.006±0.142 miR-212-3p-mimics+TGF-β2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組 2.727±0.245 0.550±0.077 miR-212-3p-inhibitor+TGF-β2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組 0.283±0.025 1.398±0.197對照組 1.022±0.150 1.042±0.147 inhibitor NC+TGFβ2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組 0.906±0.133 1.115±0.158 F 值 101.587 12.533 P 值 0.000 0.001

圖4 各組has-miR-212 和TGF-β2 mRNA 相對表達量比較 （±s）

表4 各組TGFβ2 蛋白相對表達量比較 （n =3，±s）

表4 各組TGFβ2 蛋白相對表達量比較 （n =3，±s）

組別 TGF-β2 蛋白正常細胞組 0.475±0.026 miR-212-3p-mimics+TGF-β2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組 0.217±0.019 miR-212-3p-inhibitor+TGF-β2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組 0.648±0.023對照組 0.453±0.013 inhibitor NC+TGF-β2 3'UTR 共轉(zhuǎn)染組 0.487±0.026 F 值 147.763 P 值 0.000

圖5 各組TGF-β2 蛋白相對表達量比較 （±s）

3 討論

miRNA 是小的內(nèi)源性RNA 分子，單個miRNA 可作用于≥1 個靶mRNA，這依賴于miRNA 與靶mRNA堿基互補配對方式。大多數(shù)靶向的mRNA 通過其3'UTR 與miRNA 相互作用，根據(jù)互補程度，miRNA 可以通過切割磷酸二酯鍵直接破壞mRNA 或部分互補從而抑制其表達。在哺乳動物中，miRNA 和靶向mRNA的3'UTR 不能完全互補，通過翻譯抑制靶向mRNA 的表達來發(fā)揮作用[6]。miRNA 對mRNA 翻譯的抑制作用已經(jīng)成為人成骨細胞的發(fā)育過程，參與成骨信號通路、成骨細胞生長、分化以及凋亡的重要調(diào)控因子。

近年來，氟中毒對骨骼危害的研究越來越多，小劑量的氟可以起到預(yù)防作用并刺激骨細胞的增殖，大劑量則可誘導(dǎo)細胞凋亡，引起骨質(zhì)疏松或骨質(zhì)硬化從而導(dǎo)致氟骨癥。氟骨癥主要的病理變化是成骨細胞發(fā)生凋亡，破壞破骨細胞與成骨細胞轉(zhuǎn)換過程的平衡，但其具體的分子機制尚不明確。本課題組前期利用與成骨細胞凋亡相關(guān)的miRNA PCR 芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)氟化鈉處理人成骨細胞48 h 后miR-212-3p 表達上調(diào)[4]。最初的研究發(fā)現(xiàn)miR-212-3p 參與神經(jīng)元的形成、調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律、控制藥物成癮和免疫調(diào)節(jié)[7]，除了上述功能外，其在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用，其抑制作用與細胞周期阻滯、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程和細胞凋亡相關(guān)[8-11]。例如其通過抑制結(jié)締組織生長因子和轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白A1（FOXA1）在人肝癌細胞中表達，從而抑制肝癌細胞的增殖和侵襲[12-13]，靶向結(jié)合甲基化CpG 結(jié)合蛋白-2 并下調(diào)其表達，阻止早期神經(jīng)發(fā)生[14]和參與感染誘導(dǎo)的早產(chǎn)[15]，直接靶向有絲分裂原活化蛋白激酶3 來抑制卵巢癌進一步發(fā)展[16]，在膀胱癌中靶向結(jié)合核因子IA 抑制癌細胞增殖并促進細胞凋亡[9]。此外，在骨肉瘤患者中已發(fā)現(xiàn)包括miR-212 在內(nèi)的特定miRNA 的失調(diào)，LIU 等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-212 可以直接結(jié)合FOXA1 mRNA 3'UTR序列，并且在MG-63 和Saos-2 骨肉瘤細胞中負調(diào)控FOXA1 蛋白的表達。裴祎等[18]研究證實miR-212 可以直接作用于鋅指蛋白133，通過抑制其表達從而抑制骨肉瘤細胞的增殖和遷移。

人們對成骨細胞凋亡過程中miR-212-3p 的調(diào)控機制及其靶基因了解甚少。故本研究前期通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-212-3p 的靶基因時發(fā)現(xiàn)TGF-β2基因的3'UTR 與其存在潛在的互補結(jié)合位點，并且通過實驗證實miR-212-3p 直接靶向TGF-β2并抑制其表達。TGF-β2是TGF-β 超家族成員之一，TGF-β超家族成員除包含TGF-βs（哺乳動物中TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3）以外，還包括激活素、BMP 以及生長和分化因子等40 個成員[19-21]。TGF-β 是由多種細胞產(chǎn)生的，骨是TGF-β 主要的組織來源，被認為是用于調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞經(jīng)典的耦合因子之一?？捎糜诔晒羌毎?，調(diào)節(jié)其增殖和分化，一方面是因為成骨細胞自身可以合成分泌TGF-β，另一方面是因為成骨細胞細胞膜上有各個亞型的特異性受體。TGF-β 家族蛋白首先和細胞膜表面特異性的Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合形成異源復(fù)合物，Ⅱ型受體激活后，使得Ⅰ型受體磷酸化，活化的Ⅰ型受體通過磷酸化的Smad 蛋白和R-Smads 啟動細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，隨后活化的R-Smads 與co-Smad 和Smad4形成復(fù)合物，將信號從膜外傳遞到細胞核內(nèi)開啟轉(zhuǎn)錄應(yīng)答。TGF-β2通過與骨髓間充質(zhì)干細胞膜上的TGF-β2R Ⅰ和TGF-β2R Ⅱ結(jié)合形成復(fù)合物，激活后的TGF-βR Ⅰ通過Smad 蛋白促進成骨細胞的形成[22]。成骨細胞分化早期階段的體外研究表明，TGF-β主要通過促進成骨細胞祖細胞的遷移并刺激其增殖來增加骨形成[23]，在以后的階段，TGF-β 以Smad3 依賴的方式阻斷成骨細胞的分化和骨礦化[24-25]。TGF-β阻斷成骨細胞的凋亡，從而在分化過程中維持成骨細胞的存活，由此可以推斷TGF-β2參與并調(diào)控成骨細胞的凋亡。

綜上所述，本研究通過雙熒光素酶報告實驗證實TGF-β2是miR-212-3p 的靶基因，miR-212-3p 可以與TGF-β23'UTR 靶向結(jié)合發(fā)揮負調(diào)控作用。此外Western blotting 和qRT-PCR 檢測結(jié)果表明，Saos-2 細胞外源添加miR-212-3p 后，TGF-β2的mRNA 和蛋白相對表達量都明顯下降，這些結(jié)果提示miR-212-3p 負向調(diào)控靶基因TGF-β2，這一結(jié)果為后續(xù)研究氟骨癥中miR-212-3p 的作用提供了參考。目前，發(fā)現(xiàn)成骨細胞凋亡過程中miRNA 的數(shù)量逐漸增多，但仍需發(fā)現(xiàn)更多的miRNA 調(diào)控其靶基因中的分子機制，為成骨細胞的凋亡及過量氟中毒患者的臨床治療提供更多的方法和參考。