史艷芬，胡高峰，羅 杰，鐘定榮，續(xù) 薇

（1.中日友好醫(yī)院 病理科，北京 100029；2.北京醫(yī)院 國家老年醫(yī)學中心 國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心中國醫(yī)學科學院老年醫(yī)學研究院，北京 100730；3.吉林大學第一醫(yī)院 檢驗科，長春 130021）

微小RNAs（miRNAs）是一種被廣泛研究的穩(wěn)定性較好的非編碼RNA，研究認為，miRNAs 可作為腫瘤標志物應用于不同疾病的診斷和預后[1，2]，也可參與腫瘤的治療如直接抑制腫瘤或調(diào)控化療耐藥[3]，而miRNAs 調(diào)控靶基因表達是miRNA 發(fā)揮生物學作用的重要方式，雙熒光素酶實驗方法是現(xiàn)今最常用的研究miRNA 和靶基因直接作用關系的實驗，雙熒光素酶實驗在熒光素酶質(zhì)粒選擇、抑制物/類似物（inhibitor/mimc）選擇等細節(jié)方面各有不同[4，5]，尚無文獻報道這些差異是否會影響其結(jié)果判斷。為探索適合的雙熒光素酶實驗方法，本研究從胃癌細胞BGC823 基因組中提取了T-細胞淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移誘導基因（T-lymphom invasion and metastasis gene，TIAM1）的3’非編碼區(qū)（3’-UTR）片段全長，將TIAM1-3’UTR 構(gòu)建在2種不同的熒光素酶基因質(zhì)粒上，通過在線數(shù)據(jù)庫預測及在前期研究的基礎上，選取8 種可能作用于TIAM1-3’UTR 的miRNAs，分別轉(zhuǎn)染其抑制物和類似物進行雙熒光素酶實驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞系： 人胃癌細胞系BGC823 獲贈于吉林大學第一醫(yī)院檢驗科單洪麗博士。質(zhì)粒：熒光素酶質(zhì) 粒psi-CHECK2、pGL-CMV-promoter、Renilla均獲贈于吉林大學第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化研究院艾滋病與病毒研究中心杜娟課題組。

1.2 試劑和儀器

DMEM、RPMI1640 和胰蛋白酶購自美國Hyclone 公司，Opti-MEM、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司，限制性內(nèi)切酶（XbaⅠ、XhoⅠ、NotⅠ、EcoRⅠ） 和T4 DNA 連接酶購自美國New England BioLabs 公司，基因組DNA 提取試劑盒、感受態(tài)大腸桿菌細胞和LipofectamineTM3000 購自美國Invitrogen 公司，KD 聚合酶、質(zhì)粒小提試劑盒和雙熒光素酶實驗試劑盒購自中國北京Transgene 公司，miRNAs 的類似物和抑制物購自中國廣州Ribobio 公司。發(fā)光檢測儀為Promega 公司的Glo-MaxTM 20/20 Luminometer。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

采用含有10%FBS 的RPMI1640，在37℃含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。選取miRNAs通過在線數(shù)據(jù)庫（Targetscan、miRDB、miRWalk、miRNet、MicroT-CDS、miRSystem 和miRNAMap）預測及課題組前期研究基礎[6]，選擇影響TIAM1 mRNA 表達且可能作用于TIAM1-3’UTR 的8 種miRNAs（見表1）。

1.3.2 質(zhì)粒構(gòu)建

使用基因組DNA 提取試劑盒，從BGC823 細胞系中提取基因組DNA。使用KD 聚合酶，采用普通PCR 的方法，將TIAM1-3’UTR 片段全長（1950bp）從基因組DNA 中擴增出來，根據(jù)使用引物不同（見表2），獲得2 種TIAM1-3’UTR 片段，一種兩端含有XhoⅠ和NotⅠ酶切位點，另一種兩端含有XbaⅠ和EcoRⅠ酶切位點，分別酶切后備用。將psi-CHECK2 質(zhì)粒進行XhoⅠ和NotⅠ雙酶切，使用T4 DNA 連接酶，將備用的TIAM1-3’UTR 片段通過酶切位點插入到Renilla 熒光素酶基因下游，構(gòu)建的質(zhì)粒命名為psi-TIAM1-3’UTR。對于pGL-CMV-promoter 質(zhì)粒，首先使用設計的突變引物和KD 聚合酶進行連續(xù)3 個堿基的突變，使Firefly 熒光素酶基因下游出現(xiàn)EcoRⅠ酶切位點，再進行XbaⅠ和EcoRⅠ雙酶切，使用T4 DNA 連接酶，將備用的TIAM1-3’UTR 片段通過酶切位點插入到Firefly 熒光素酶基因下游，構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pGL3-TIAM1-3’UTR。將構(gòu)建的2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細胞，擴增培養(yǎng)后，挑取單克隆菌落，使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒并送測序。測序確認TIAM1-3’UTR 序列均正確插入，2 種質(zhì)粒構(gòu)建成功，其結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。

表1 應用2 種雙熒光素酶實驗方法檢測胃癌相關miRNAs 靶向TIAM1 的結(jié)果（改變倍數(shù)，x±s）

表2 從基因組上擴增出TIAM1-3’UTR 所用引物

1.3.3 轉(zhuǎn)染

將等量待轉(zhuǎn)染細胞鋪在24 孔板中，次日細胞貼壁后且密度達80%左右進行轉(zhuǎn)染。將質(zhì)粒、miR-類似物/抑制物和P3000TM 加入到Opti-MEM 后靜置5min，將Lipofectamine 3000 加入另一管Opti-MEM 后靜置5min，將稀釋后的2 種液體混勻后再靜置20min，吸凈待轉(zhuǎn)染細胞的舊培養(yǎng)基并加入上述轉(zhuǎn)染液，置入培養(yǎng)箱中2h 后更換普通培養(yǎng)液，48h 后收集細胞進行實驗。

圖1 pGL3-TIAM1-3’UTR 和psi-TIAM1-3’UTR質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖

圖2 雙熒光素酶實驗時pGL3-TIAM1-3’UTR 和psi-TIAM1-3’UTR 質(zhì)?？沙霈F(xiàn)不同的結(jié)果

1.3.4 雙熒光素酶實驗

轉(zhuǎn)染后48h 收獲細胞，PBS 潤洗2 次后加入裂解液，室溫裂解10min，4℃條件下12000g 離心10min，吸取20滋l 上清置于1.5ml EP 管中，該EP管中已提前加入配好的100滋l 熒光素酶底物試劑，混勻后立即在發(fā)光檢測儀中檢測熒光值，該數(shù)值即反應熒光素酶的活性。再加入100滋l 另一種熒光素酶底物試劑，檢測另一種熒光素酶活性。Firefly 熒光素酶的反應后熒光在波長560nm 處檢測，Renilla 熒光素酶的反應后熒光在波長470nm 處檢測。由于miRNA 經(jīng)典作用方式為結(jié)合靶基因3’UTR 位點，影響靶基因的翻譯過程，本研究中將TIAM1-3’UTR 插入到熒光素酶基因下游，因此試劑盒檢測出的相對熒光素酶活性改變將間接反映miRNA 對TIAM1-3’UTR 的作用。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)來源于至少3 次獨立實驗，應用SPSS20.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料用x±s描述，組間比較采用t 檢驗。采用Graphpad 軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 用不同的質(zhì)粒進行雙熒光素酶實驗

BGC-823 細胞系中分別轉(zhuǎn)染pGL3-TIAM1-3’UTR 和psi-TIAM1-3’UTR 質(zhì)粒，觀察miR-抑制物處理后熒光素酶活性變化。miR-10b-抑制物處理后，2 種質(zhì)粒的熒光素酶活性均升高，說明miR-10b-5p 對2 種質(zhì)粒上熒光素酶基因的調(diào)控可能相同；miR-651-抑制物處理后2 種質(zhì)粒的熒光素酶活性變化完全相反，miR-653-抑制物處理后也是如此，表明miR-651-3p 和miR-653-5p 對2 種質(zhì)粒上的熒光素酶基因的調(diào)控有差異 （見圖2）。

圖3 雙熒光素酶實驗時miR-抑制物和miR-類似物可出現(xiàn)相同結(jié)果

2.2 抑制物和類似物同時進行雙熒光素酶實驗

本研究在BGC823 細胞系中轉(zhuǎn)染psi-TIAM1-3’UTR 質(zhì)粒后，分別用miR-抑制物和miR-類似物處理，觀察熒光素酶活性變化。miR-10b-5p 的抑制物和類似物處理組熒光素酶活性分別增高和減弱，表明miR-10b-5p 通過直接作用于TIAM1-3’UTR 序列影響基因表達；而miR-372-3p、miR-373-3p 和miR-653-5p 的抑制物和類似物處理組熒光素酶活性均升高，miR-335-3p的抑制物和類似物處理組熒光素酶活性均減低（見圖3）。

3 討論

3.1 同種miRNA 在2 種熒光素酶質(zhì)粒的結(jié)果

本文以胃癌相關miRNAs 靶向TIAM1-3’UTR 為例，研究了雙熒光素酶實驗適合的實驗條件，結(jié)果顯示，同種miR-抑制物分別作用在pGL3-TIAM1-3UTR 和psi-TIAM1-3’UTR 2 種質(zhì)粒上，可能會產(chǎn)生不同的實驗的結(jié)果（表1 和圖2）。由于pGL3-TIAM1-3’UTR 質(zhì)粒常共轉(zhuǎn)Renilla 質(zhì)粒做內(nèi)參[7]，與psi-TIAM1-3UTR 質(zhì)粒的內(nèi)參基因不同。有研究報道睪丸受體4（TR4，或稱NR2C2）的過表達導致Renilla 的表達降低，說明海腎熒光素酶基因的表達會受到其他物質(zhì)調(diào)控[8]，而miRNA 在復雜的生物體內(nèi)可能會有多個靶基因和調(diào)控通路，所以推測某些miRNA 可能會間接影響Renilla 的表達，出現(xiàn)本實驗中的結(jié)果。而且因為使用pGL3-TIAM1-3UTR 這種質(zhì)粒時，其內(nèi)參基因在共轉(zhuǎn)的另一個質(zhì)粒上，只是理論上認為2 種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率一致，增加了更多的不確定性。因此目前也有研究報道認為這種將2 種熒光素酶合成在同一質(zhì)粒上的方法更為合適[9]。

3.2 同種熒光素酶質(zhì)粒使用抑制物/類似物

對于同種熒光素酶質(zhì)粒，使用抑制物和類似物的雙熒光素酶實驗結(jié)果可能不同。本研究中miR-372-3p、miR-373-3p 和miR-653-5p 在轉(zhuǎn)染抑制物時相對熒光素酶活性增加，表明此3 種miRNAs 能夠靶向作用于TIAM1-3’UTR，但是在轉(zhuǎn)染類似物時的結(jié)果并不支持這一結(jié)論； 類似的miR-335-3p 只在轉(zhuǎn)染類似物時能得出靶向作用于TIAM1-3’UTR 的結(jié)論，轉(zhuǎn)染抑制物時則不支持。上述4 種miRNAs 中，有文獻報道m(xù)iR-653-5p 在乳腺癌中能夠靶向TIAM1[10]，其余miRNAs和TIAM1 的關系均尚無報道，在本實驗的條件下，我們的數(shù)據(jù)不支持其直接靶向作用與TIAM1-3’UTR。因此綜合抑制物和類似物兩方面的結(jié)果來判斷，至少對于雙熒光素酶實驗是很有必要的。

綜上，miR-10b-5p 能夠直接靶向作用于TIAM1-3’UTR，研究中納入的其余miRNAs 均不支持與TIAM1-3’UTR 有直接靶向作用關系。本研究有助于優(yōu)化miRNA 與靶基因關系、miRNA與腫瘤關系的研究。