余丹純，聶玉強(qiáng)，黃耀星，孫小娟

廣州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510180

活化白細(xì)胞黏附分子(activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM)也稱CD166，是一種廣泛存在于人體各個組織器官的糖蛋白，是免疫球蛋白超家族的成員之一，已有研究證實，其在胃癌組織中高表達(dá)，且與轉(zhuǎn)移有關(guān)[1-3]。微小RNA(miRNA)是真核生物中一類21～25個核苷酸的非編碼小分子RNA，在進(jìn)化上具有高度保守性，通過與靶基因mRNA 3′端非編碼區(qū)(3′untranslated region，3′UTR)互補(bǔ)而抑制或促進(jìn)靶基因mRNA降解或抑制其翻譯，從而對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)調(diào)控，作為一類潛在的癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用[4-6]。探討研究靶向調(diào)控ALCAM的miRNA，可能為胃癌的治療提供新切入點。本研究運用生物信息學(xué)軟件預(yù)測靶向調(diào)控ALCAM的miRNA，并通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)、SYBR Green熒光定量PCR和Western blotting等實驗技術(shù)檢測驗證其靶向調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑人正常胃黏膜GES-1細(xì)胞株和SGC-7901、MGC-803、BGC-823胃癌細(xì)胞株由ATCC引入，實驗室凍存。質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；DH 5α購自廣州博川生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶Sgf I和Not I購自NEB公司；pEASY-Blunt Cloning Vector購自北京全式生物技術(shù)有限公司；psiCHECK-2及Dual Luciferase Reporter Assay System購自Promega公司；miR-NC、miR-9 mimics、miR-9 inhibitor購自Ambion公司；總RNA和總蛋白提取試劑盒、PCR引物、Lipofectin 2000購自Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒購自TaKaRa公司；鼠抗人ALCAM單克隆抗體購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2生物信息學(xué)預(yù)測調(diào)控ALCAM的miRNA采用MiRanda、TargetScan和Pictar 3個生物信息學(xué)軟件對調(diào)控ALCAM的miRNA進(jìn)行預(yù)測，選擇3種計算方法預(yù)測結(jié)果的交集。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及實驗對象確定將GES-1、SGC-7901、MGC-803和BGC-823細(xì)胞株置于質(zhì)量濃度為100 g/L的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2孵箱中培養(yǎng)，每2～3 d用質(zhì)量濃度為2.5 g/L的胰酶消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。SYBR Green熒光定量PCR檢測各細(xì)胞株ALCAM mRNA的表達(dá)量，確定實驗對象。

1.4總RNA提取及RT-PCR收集細(xì)胞，Trizol試劑盒提取總RNA，在Bio Photometer Plus艾本德核酸蛋白測定儀上測定RNA的濃度和純度，按M-MLV說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA備用。

1.5ALCAM雙熒光素酶報告基因載體及突變載體構(gòu)建運用Primer 5軟件設(shè)計PCR擴(kuò)增引物，ALCAM-3′UTR-F：5′-GCGATCGCCCAATTGAAGCATGAACGTGG-3′，ALCAM-3′UTR-R：5′-GCGGCCGCATCTTTTAGGCATAGACGGGTATG-3′，ALCAM-3′UTR-Mut-F：5′-GGGAAA-ATGGTTTCTTATTTGTTTTGCATGGCTAAGCC-3′，ALCAM-3′UTR-Mut-R：5′-CCCCTTTTAGAAACCATTAAATGTTGACCAAGATTC-3′，擴(kuò)增合成ALCAM 3′UTR和ALCAM-mut 3′UTR片段，片段長度為 1 030 bp，兩端帶有Sgf I和Not I的酶切位點。將ALCAM 3′UTR和ALCAM-mut 3′UTR片段分別鏈接至T載體(pEASY-Blunt Cloning Vector)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH 5α，LB/Kam培養(yǎng)基篩選克隆成功重組子，分別命名為ALCAM-T和ALCAM-mut-T，送華大基因公司進(jìn)行基因測序。經(jīng)測序鑒定后分別提取ALCAM-T/ALCAM-mut-T陽性克隆和psiCHECK-2載體質(zhì)粒，雙酶切質(zhì)粒，將ALCAM 3′UTR/ALCAM-mut 3′UTR鏈接至psiCHECK-2，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH 5α，LB/Kam培養(yǎng)基篩選克隆成功重組子，提取質(zhì)粒，Sgf I和Not I雙酶切鑒定，分別命名為psiCHECK-2-ACALM和psiCHECK-2-ALCAM-mut。

1.6雙熒光素酶報告基因活性檢測將SGC-7901細(xì)胞以1×105ml-1的密度接種于24孔板上(計數(shù)后，按5×104個細(xì)胞/孔接種)，細(xì)胞匯合度為50%～60%時，根據(jù)Lipofectin 2000(Invitrogen公司)說明書，每孔加入20 μmol/L的miRNA 1 μl和0.5 μg質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。實驗分組如下：(1)未轉(zhuǎn)染的空白對照組；(2)共轉(zhuǎn)染miR-NC、psiCHECK-2-ALCAM或psiCHECK-2-ALCAM-mut；(3)共轉(zhuǎn)染miR-9 mimics、psiCHECK-2-ALCAM或psiCHECK-2-ALCAM-mut；(4)共轉(zhuǎn)染miR-9 inhibitor、psiCHECK-2-ALCAM或psiCHECK-2-ALCAM-mut；每組設(shè)4個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染24 h后，每孔用PBS洗2次，加入100 μl的PLB(Passive Lysis Buffer)，室溫輕微振搖15 min，收集細(xì)胞裂解液，將20 μl細(xì)胞裂解液加入發(fā)光板后，用GloMax生物發(fā)光檢測儀讀取背景值2 s，每個樣品加入100 μl LAR Ⅱ 工作液，快速混勻，讀值2 s，讀值完畢后，每樣品再加入100 μl Stop & Glo?Reagent，快速混勻后，放入發(fā)光檢測儀中，讀值2 s。保存數(shù)據(jù)，檢測結(jié)果分析，F(xiàn)：螢火蟲螢光素酶；R：海腎螢光素酶，歸一化值=(R/F)樣品/(R/F)空白對照。

1.7SYBRGreen熒光定量PCR檢測ALCAMmRNA的表達(dá)水平運用Primer 5軟件設(shè)計PCR擴(kuò)增引物，ALCAM-F：5′-TTTTACTTACCAGGACAGC-3′，ALCAM-R：5′-GACATAGTTTCCAGCATC-3′，擴(kuò)增片段為327 bp；內(nèi)參GAPDH-F：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，GAPDH-R：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′，擴(kuò)增片段138 bp?？偡磻?yīng)體系20 μl，PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 32 s，40 循環(huán)，對60～95 ℃升溫整個過程進(jìn)行全程熒光信號收集，繪制融解曲線，每個樣本重復(fù)3次。2-△△Ct法分析樣品中ALCAM基因的相對表達(dá)量。

1.8Westernblotting檢測ALCAM蛋白的表達(dá)水平收集細(xì)胞，用RIPA裂解細(xì)胞樣品并提取總蛋白，BCA法測量蛋白濃度；煮沸變性，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF，洗滌封閉，4 ℃冰箱孵育一抗(鼠抗人1∶1 000 ALCAM單克隆抗體)過夜，TBST洗滌，然后室溫孵育二抗(羊抗鼠1∶10 000)1 h，以GAPDH為內(nèi)參，最后用ECL化學(xué)法進(jìn)行曝光、顯影；采用灰度分析軟件計算ALCAM蛋白相對表達(dá)量，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1預(yù)測miR-9是ALCAM潛在的靶向調(diào)控基因應(yīng)用3個生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(MiRanda、TargetScan和Pictar)預(yù)測靶向調(diào)控ALCAM的miRNA，結(jié)果顯示，miR-9是ALCAM潛在的調(diào)控miRNA，ALCAM 3′UTR含有1個miR-9的結(jié)合位點。

2.2各細(xì)胞株中ALCAM基因mRNA的表達(dá)SGC-7901、MGC-803和BGC-823胃癌細(xì)胞株ALCAM mRNA表達(dá)量分別為1.006±0.132、0.675±0.089和0.768±0.078，明顯高于人正常胃黏膜GES-1細(xì)胞株

(0.004±0.0006)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中SGC-7901細(xì)胞株mRNA表達(dá)水平最高，確定其為實驗細(xì)胞株。

2.3ALCAM3′UTR和ALCAM-mut3′UTR片段擴(kuò)增合成成功將ALCAM-T和ALCAM-mut-T送華大基因公司進(jìn)行基因測序，經(jīng)測序確認(rèn)擴(kuò)增出來的ALCAM基因3′UTR序列是正確的，ALCAM 3′UTR突變后hsa-miR-9-5p結(jié)合部位已經(jīng)突變，如紅色框部位所示(見圖1)。

2.4miR-9與ALCAM基因3′UTR的相互作用分組轉(zhuǎn)染后通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，在SGC-7901細(xì)胞中，psiCHECK-2-ALCAM質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染了miR-9 mimics的細(xì)胞組相對熒光素酶活性(3.717±0.0578)較psiCHECK-2-ALCAM質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染了miR-NC、miR-9 inhibtor的細(xì)胞組或空白對照組(5.943±0.051、5.905±0.209、5.988±0.884)明顯降低(P<0.05)。而共轉(zhuǎn)染了psiCHECK-2-ALCAM-mut質(zhì)粒的miR-NC、miR-9 mimics或miR-9 inhibitor的細(xì)胞組相對熒光素酶活性(4.572±0.075、4.683±0.157、4.380±0.108)與空白對照組(4.491±0.016)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明miR-9直接與ALCAM基因3′UTR互補(bǔ)結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用(見圖2)。

圖1 ALCAM-mut-T質(zhì)粒突變部位測序示意圖Fig 1 ALCAM-mut-T sequencing of plasmid mutation sites

注：與miR-9 mimics細(xì)胞組相比，*P<0.05。圖2 miR-9與ALCAM基因3′UTR的相互作用Fig 2 Interaction between miR-9 and ALCAM 3′UTR

2.5miR-9對ALCAM表達(dá)的影響通過SYBR Green熒光定量PCR和Western blotting檢測miR-9對ALCAM表達(dá)水平的影響，結(jié)果顯示，psiCHECK-2-ALCAM質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染miR-9 mimics的細(xì)胞組ALCAM mRNA的表達(dá)水平(0.280±0.07)和蛋白表達(dá)水平(0.335±0.019)較psiCHECK-2-ALCAM質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-9 inhibitor的細(xì)胞組或空白對照組ALCAM mRNA的表達(dá)水平(1.015±0.452、2.232±0.522、1.006±0.132)和蛋白表達(dá)水平(0.507±0.021、0.754±0.113、0.559±0.029)明顯降低(P<0.05)(見圖3～4)。

注：與miR-9 mimics細(xì)胞組相比，*P<0.05。圖3 ALCAM mRNA的相對表達(dá)量Fig 3 Relative expression of ALCAM mRNA

注：與miR-9 mimics細(xì)胞組相比，*P<0.05。圖4 ALCAM蛋白的相對表達(dá)量Fig 4 Relative expression of ALCAM protein

3 討論

多項研究發(fā)現(xiàn)，ALCAM在多種腫瘤細(xì)胞包括乳腺癌、食管癌和結(jié)腸癌中高表達(dá)且與患者的預(yù)后有關(guān)[7-9]。而ISHIGAMI等課題組[1-3]的前期研究則發(fā)現(xiàn)了ALCAM在胃癌組織中高表達(dá)，且與轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究通過SYBR Green熒光定量PCR檢測對比人胃黏膜GES-1細(xì)胞株及SGC-7901、MGC-803和BGC-823等胃癌細(xì)胞株中ALCAM mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)人胃黏膜GES-1細(xì)胞株中ALCAM基因的表達(dá)量極低，而各胃癌細(xì)胞株中ALCAM基因的表達(dá)水平升高，再次證實ALCAM在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，與前期實驗結(jié)果一致。綜上，ALCAM基因與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，進(jìn)一步研究其調(diào)控機(jī)制將有助于胃癌的治療及改善預(yù)后。

發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)腫瘤相關(guān)的miRNA可為腫瘤的治療提供新的切入點。本研究應(yīng)用MiRanda、TargetScan和Pictar 3個生物信息學(xué)軟件對調(diào)控ALCAM表達(dá)的miRNA進(jìn)行預(yù)測，均提示ALCAM 3′UTR有miR-9結(jié)合位點，推測miR-9可能是靶向調(diào)控ALCAM基因的miRNA。熒光素酶報告基因系統(tǒng)是目前常用的miRNA精確靶點驗證方法，其判斷原理是：miRNA與報告基因mRNA下游插入的預(yù)測靶基因3′UTR序列特異性結(jié)合后，將抑制報告基因的表達(dá)，與對照組相比，報告基因熒光素酶活性將明顯降低。本研究分組共轉(zhuǎn)染miRNA和重組質(zhì)粒后經(jīng)雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)miR-9明顯抑制psiCHECK-2-ALCAM質(zhì)粒的熒光素酶活性，而對突變體psiCHECK-2-ALCAM-mut的熒光素酶表達(dá)無明顯影響，說明miR-9直接與ALCAM基因3′UTR互補(bǔ)結(jié)合而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。而進(jìn)一步通過SYBR Green熒光定量PCR及Western blotting檢測miR-9對ALCAM表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)miR-9顯著抑制ALCAM mRNA和蛋白的表達(dá)水平。上述實驗闡明ALCAM基因在胃癌細(xì)胞株中高表達(dá)，miR-9直接負(fù)性調(diào)控SGC-7901胃癌細(xì)胞中ALCAM的表達(dá)，為今后胃癌治療的研究提供新方向，值得我們關(guān)注和深入研究。