摘要：[目的]研究日本落葉松內源口_葡糖苷酸酶（ GUS）基因及其酶活性，分析GUS作為報告基因的可靠性。[方法]利用pCAMBIA1301載體上的GUS基因序列在日本落葉松參考基因組中進行比對，鑒定并克隆出日本落葉松GUS（LaGUS）基因。在NCBI利用blastp查找其他物種中La GUS的同源序列并構建進化樹。利用已有的轉錄組數(shù)據(jù)和實時熒光定量PCR分析La GUS基因在日本落葉松中的襲這模式。利用組織化學的方法，以X-gluc作為GUS酶反應底物，檢測日本落葉松體細胞胚胎發(fā)生過程中內源GUS的酶活性。[結果]在日本落葉松中鑒定到一個LaGUS基因，CDS長3 435 bp，編碼1144個氨基酸。25種植物中具有與LaGUS基因相似的序列。LaGUS基因的表達量在活動期高于休眠期，在體胚苗中高于在胚性愈傷組織和體細胞胚胎中。組織化學染色表明，日本落葉松胚性愈傷組織、體細胞胚胎和體胚苗在室溫下染色6d對均觀察到藍色，但體胚苗的染色程度高于胚性愈傷維織和體細胞胚胎。[結論]日本落葉松具有內源GUS括性，在基因工程中利用GUS作為報告基因可能存在一定干擾。

關鍵詞：日本落葉松；內源GUS；體細胞胚胎發(fā)生；報告基因

中圖分類號：S722.3 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）06-0086-07

B-葡糖苷酸酶（p-glucuronidase，GUS）是一種水解酶，可將5-溴-4-氯-3-吲哚-B-葡萄糖苷酸（X-Gluc）分解，產(chǎn)生藍色產(chǎn)物，因而被作為報告基因廣泛使用。自1987年GUS基因被克隆后，就被廣泛應用于轉基因研究中。將目的基因或其啟動子與GUS融合后，可以借助組織化學染色法對目的基因的表達進行定位和定量分析。比如，可以通過對整株植物進行染色，了解目的基因在不同器官中的表達式樣，也可以在染色后進行切片，在組織水平上分析目的基因的表達特點。

然而，越來越多的研究者在進行GUS活性檢測時，發(fā)現(xiàn)了假陽性或者檢測出內源GUS活性的情況。1986年，Schulz等在黑麥（Secale cereale L.）葉片發(fā)育初期檢測到很強的GUS活性。Wozniak等發(fā)現(xiàn)甜菜（Beta vulgariL）中具有內源GUS活性。Hu等使用多種方法檢測了52種植物中的內源GUS活性，發(fā)現(xiàn)有些植物的種皮、胚乳，特別是成熟胚中存在GUS活性，這些植物不僅有被子植物，還有裸子植物。Muhitch等發(fā)現(xiàn)在排除了共生細菌的干擾后，在玉米（Zeamays L.）花梗中仍然能夠檢測到GUS活性。此后，施華中等也報道了煙草（Nicotiana tabacum L.）花粉及其他組織中內源GUS活性的存在。上述研究表明，當植物本身具有內源GUS活性，GUS作為報告基因會影響轉基因植物的陽性檢測、瞬時表達效率分析和基因表達模式分析。

基于體細胞胚胎發(fā)生的遺傳轉化技術體系是針葉樹中相對成熟的實驗系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)不僅可開展落葉松（Larix）基因的表達調控和功能驗證等研究，還可以生產(chǎn)轉基因落葉松新種質。目前，作為報告基因，GUS在落葉松遺傳轉化時也經(jīng)常被使用。為了準確、高效地篩選轉基因材料、分析落葉松基因功能和啟動子活性，本研究從日本落葉松（Larix kaempferi（Lamb.）Carr.）基因組中鑒定GUS基因，并分析日本落葉松體細胞胚發(fā)生過程中的內源GUS活性，以此為依據(jù)判斷外源GUS在日本落葉松遺傳轉化中作為報告基因的可靠性，為日本落葉松遺傳轉化研究中報告基因的選擇和利用提供理論依據(jù)。

1研究材料與方法

1.1研究材料

實時熒光定量PCR和組織化學染色實驗中所用的材料來自日本落葉松未成熟種子誘導獲得的胚性愈傷組織C6。未成熟種子于6月中下旬采自遼寧省國有清原滿族自治縣大孤家林場1.5代園。胚性愈傷組織經(jīng)成熟培養(yǎng)獲得體細胞胚胎，體細胞胚胎經(jīng)萌發(fā)培養(yǎng)獲得體胚苗。這些材料均為本實驗室日常培養(yǎng)獲得，培養(yǎng)方法參考已發(fā)表文獻。

1.2研究方法

1.2.1日本落葉松內源GUS基因鑒定與克隆 以pCAMBIA1301載體中GUS基因的蛋白序列為參照，利用blastp在日本落葉松基因組數(shù)據(jù)庫中查找日本落葉松內源GUS序列，E值lt;10-5。將比對獲得的相似度最高的基因視為日本落葉松內源GUS基因，命名為LaGUS。

根據(jù)LaGUS的核酸序列，設計引物（表1），以日本落葉松cDNA為模板擴增其編碼區(qū)（Coding Sequence，CDS）序列。PCR反應體系（50 uL）：25 uL KOD Mix，1.5 uL F引物（10 umol·L-1），1.5 uL R引物（10 umol·L-1），1.0 uL cDNA（200 ng·mL-1）， 21 UL ddH2O。反應程序：94℃預變性2min；按下列循環(huán)參數(shù)進行擴增反應：95℃，5s；60℃，5s；68℃，30 s 30個循環(huán)；68℃，5min；產(chǎn)物于4℃保存。對擴增獲得的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，確認條帶大小一致后，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（TianGen，中國）進行純化回收。將回收后的PCR產(chǎn)物進行TA克隆，轉化至TransT1大腸桿菌感受態(tài)細胞（TianGen，中國），挑取陽性克隆送公司測序。

1.2.2日本落葉松內源GUS基因的序列分析 利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）網(wǎng)站預測LaGUS蛋白的分子量和等電點。利用Euk-mPLoc 2.0在線工具（http：//www.csbio.sjtu，edu.cn/bioinf/euk-multi-2/）預測LaGLIS蛋白的亞細胞定位。

利用NCBI中的blastp功能（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）搜索Laeus基因的同源序列。利用ClustaIX軟件進行序列比對，隨后使用MEGA6.0軟件中的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap值設置為1 000，其他參數(shù)按照系統(tǒng)默認設置。

1.2.3LaGUS基因的表達分析 利用本實驗室已發(fā)表的日本落葉松轉錄組數(shù)據(jù)對Laeus基因的表達模式進行分析，這些轉錄組來自1～50年生處于活動期或休眠期的日本落葉松的莖。將測序獲得的序列比對到落葉松基因組，重新計算基因的表達量。

使用日本落葉松的胚性愈傷組織、體細胞胚胎和體胚苗進行qRT-PCR分析。足量材料混合后提取RNA，提取步驟按照說明書進行（ER101，北京全式金生物技術）。使用超微量分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度及純度。使用反轉錄試劑盒（P10720，北京全式金生物技術）將1 ug檢測合格的RNA反轉錄為cDNA。將反轉錄獲得的cDNA稀釋10倍后作為模板，以LaEF7A1和LaUBC為內參基因進行qRT-PCR檢測，引物序列見表1。qRT-PCR的反應體系為：12.5 uLTB Green Premix Ex TaqTM，2 uL cDNA，F(xiàn)、R引物各0.5 uL，9.5 uL RNase-free水。反應條件：95℃，30 s；95℃，5 s，60℃，30 s，45個循環(huán)；95℃，10 s；65℃，5s；95℃，5s。每個反應3個技術重復?；虻南鄬Ρ磉_量用2-△△C法計算，結果表示為平均值±標準差（Mean±SD）。采用SPSS 22.0進行LSD多重比較法。

1.2.4日本落葉松內源GUS活性檢測 挑取適量胚性愈傷組織、體細胞胚胎和體胚苗于1.5 mL離心管內，使用北京華越洋GUS染色試劑盒（Cat：GT0391）進行染色，按照試劑盒說明書，GUS染色濃縮液使用前用GUS染色緩沖液稀釋50倍后配成GUS染色液后，在室溫下進行染色。觀察到藍色時表明該材料具有GUS酶活性并拍照記錄。每個反應3個技術重復，每個獨立實驗至少有4個生物學重復。

2結果與分析

2.1日本落葉松GUS基因的鑒定、克隆與分析

利用pCAMBIA1301載體中GUS基因的蛋白序列在日本落葉松基因組中進行搜索，序列相似度最高的基因被視為日本落葉松GUS基因，將其命名為LaGUS。根據(jù)該基因的序列，設計特異性引物，以日本落葉松胚性愈傷組織、體細胞胚胎和體胚苗中提取的cDNA為模板進行PCR擴增，在2 000～4 000 bp區(qū)間獲得了單一條帶，與預期大小一致（圖1）。測序結果表明，LaGUS基因的CDS序列長3 435 bp，與參考基因組序列相比，在第2 247個堿基處具有一個G-A同義突變；該序列已上傳至NCBI，登錄號為PP129346.1。該基因編碼1 144個氨基酸的蛋白，其分子量為130.06 kD，理論等電點為5.59，亞細胞定位預測顯示其定位在溶酶體。

利用LaGUS基因的蛋白序列在NCBI中進行搜索，發(fā)現(xiàn)超過60個物種中存在LaGUS基因的同源序列，并且蛋白序列的相似度超過50％，其中很多序列被注釋為B-葡糖苷酸酶。根據(jù)相似度，選擇前25個物種的序列，構建LaGUS同源基因蛋白序列的進化樹。結果表明，日本落葉松與日本柳杉（Cryptomeria japonica（Linn.f.）DDon）和無油樟（Amborella trichopoda Baill.）聚類到一個大的分支，其中，日本落葉松與日本柳杉較近；間型紫萍（Spirodela intermedia（ L.）Schleid.），風梨（Ananas comosus（L.）Merr.）和海棗（phoenix dactylifera L.）聚類到另一分支，這一支與日本落葉松較遠（圖2）。

2.2LaGLIS基因的表達分析

利用前期獲得的日本落葉松轉錄組數(shù)據(jù)，對LaGUS基因的表達模式進行了分析。在1～50年生日本落葉松的莖中，LaGUS基因在活動期的表達水平顯著高于體眠期（圖3A）。在日本落葉松愈傷組織、體細胞胚胎和體胚苗中均檢測到LaGUS基因的表達，但體胚苗中表達水平最高（圖3B）。

2.3日本落葉松體細胞胚胎發(fā)生過程中的內源GUS活性

胚性愈傷組織、體細胞胚胎和體胚苗常用于篩選轉基因材料、分析基因功能和啟動子活性。本研究檢測了日本落葉松上述材料中的內源GUS活性；結果表明，未染色時，胚性愈傷組織和體細胞胚胎分別為白色和黃色，而在染色6d的時侯，這些材料中觀察到了藍色（圖4）；未染色時，體胚苗的子葉和胚軸為綠色，胚根為褐色，而在染色6d、乙醇脫色后，整個體胚苗中都觀察到了藍色，且子葉和胚軸中藍色更深（圖3）。

3討論

隨著測序技術的發(fā)展和應用，大量植物基因被挖掘出來，功能基因的篩選、驗證與應用將是未來的研究重點。體細胞胚胎發(fā)生與遺傳轉化技術是針葉樹新種質創(chuàng)制的重要途徑，具有不可替代的地位。因此，轉基因材料的快速檢測可以提高新種質創(chuàng)制的效率。GUS作為報告基因已被廣泛應用到植物轉基因研究中，然而，由于存在內源GUS活性，使得轉基因材料的檢測結果受到了影響，進而降低了轉基因研究的效率。研究植物內源GUS基因及其活性將有助于增強轉基因材料檢測的可靠性和準確性，進而提高轉基因研究的效率。

本研究克隆了日本落葉松的一個內源GUS基因，比對與進化分析結果表明，其他植物中也存在與LaGUS基因序列相似度較高的序列，在設計引物、進行外源GUS基因表達檢測時，這些序列可以用來作為參考，避免非特異性擴增帶來的干擾。值得注意的是，在這25種植物中，蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）和牛油果（Persea americana Mill.）中也檢測到了內源GUS活性，暗示在其他具有LaGUS同源序列的植物中也可能存在內源GUS活性。LaGUS的亞細胞定位預測結果顯示其定位在溶酶體，進一步表明其可能具有水解酶的功能。表達分析結果表明，LaGUS基因的表達水平在休眠期低、活動期高（圖3），表明LaGUS基因的表達具有季節(jié)性，環(huán)境信號可能調控其表達。

在日本落葉松胚性愈傷組織、體細胞胚胎和體胚螢中均檢測到LaGUS基因的表達和酶活性，且體胚苗中的表達水平和染色程度均高于愈傷組織和體細胞胚胎，表明日本落葉松體胚苗中具有更高的內源GUS活性（圖3、4）。在落葉松遺傳轉化過程中愈傷組織常用來進行陽性檢測。在研究日本落葉松La TCTP啟動子活性的過程中，外源GUS基因表達水平高的愈傷組織被染為藍色，而表達水平低的愈傷組織未被染為藍色；這些結果表明，即使是轉基因陽性材料，其在一定條件下也不能染出藍色。在本研究中，未轉基因的愈傷組織及其進一步培養(yǎng)而產(chǎn)生的體細胞胚胎和體胚苗在染色6d后也能顯現(xiàn)藍色，進一步說明僅根據(jù)GUS染色結果去鑒定轉基因材料是不可靠的。因此，在利用GUS作為報告基因和檢測目標的時候，應考慮植物內源GUS基因及其酶活的影響，盡量避免假陽性或假陰性的干擾。

越來越多報告基因的出現(xiàn)為植物轉基因研究提供了更多選擇。比如最近報道的RUBY，該系統(tǒng)已經(jīng)在擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）、水稻（Oryza sativaL）、玉米、番茄（Solanum/ycopers/con L.）和毛竹（Phyllostachys edulis（Carriare）J.Houz.）等單子葉或多子葉的被子植物轉基因研究中得到了應用，是否可以在多子葉裸子植物的轉基因研究中進行應用仍需要進一步研究。

4結論

本研究分析了日本落葉松的一個內源GUS基因LaGUS，并在日本落葉松體細胞胚胎發(fā)生過程中檢測到了它的表達和內源GUS酶活性，發(fā)現(xiàn)體胚苗中LaGUS的表達水平和內源GUS酶活性均高于胚性愈傷組織和體細胞胚胎。內源GUS酶活性的存在會干擾轉基因材料的檢測，尤其在利用具有內源GUS酶活性的植物開展轉基因研究時，報告基因GUS的利用要特別小心，盡量排除內源GUS基因及其酶活性的干擾，以提高轉基因材料檢測的可靠性和準確性。