張 榮，陳春燕，韋祖樟，袁世山，童光志

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

病毒在侵入宿主、增殖與傳播過程中，其編碼的蛋白質(zhì)是功能發(fā)揮的主要載體。研究病毒蛋白之間、或者病毒蛋白與宿主蛋白之間的相互作用，將有助于對病毒致病機制的了解和疾病防控。蛋白質(zhì)互作研究手段很多，但新發(fā)展起來的的雙分子熒光互補技術（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）[1]，因其操作要求簡單快捷，可以特異且十分靈敏地檢測體內(nèi)微弱或者瞬時反應的蛋白互作[2-4]，能夠在生理條件下直接觀察單個活細胞內(nèi)蛋白的相互作用及作用區(qū)域，已越來越受到研究人員的青睞。BiFC的基本原理是將熒光蛋白分割成兩個失去活性的片段，分別連接目的蛋白，并在細胞內(nèi)融合表達。若兩個目的蛋白存在相互作用而靠攏，兩個熒光片段也會被拉近而重新形成有活性的熒光基團，能在熒光顯微鏡下能直接觀察到激發(fā)的熒光。鑒于BiFC的優(yōu)越性，本試驗旨在構建BiFC技術平臺，為以后深入研究病毒編碼蛋白之間及其與宿主蛋白間的相互作用提供便捷。

1 材料與方法

1.1 細胞 質(zhì)粒與生物試劑非洲綠猴腎細胞系（MARC-145）、含豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）核衣殼蛋白（nucleocapsid，N）的質(zhì)粒pAPRRS由本實驗室保存；含黃色熒光蛋白的質(zhì)粒pEYFP-N1 購自BD-Clontech公司；高保真聚合酶pfuUltraII購自Stratagene公司；限制性核酸內(nèi)切酶購自NEB公司；禽源反轉錄酶AMV購自TaKaRa公司；化學轉染試劑Fugene HD購自Roche公司；QIAprep? Spin Miniprep Kit質(zhì)粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司。

1.2 引物設計根據(jù)黃色熒光蛋白EYFP和突變體Venus序列差異[5]，運用Primer 5.0軟件設計一系列突變引物，用于突變EYFP為Venus。同時，設計引物將Venus從第173和174氨基酸位點間分割蛋白為兩部分:含N端的VN和含C端的VC。另外，設計引物用于擴增PRRSV的N基因和MARC-145細胞里的α-tubulin基因。引物序列見表1。

1.3 細胞RNA提取為了擴增細胞內(nèi)α-tubulin基因，將長滿單層的MARC-145細胞用QIAGEN公司的RNA提取試劑盒提取細胞內(nèi)總RNA，然后參照TaKaRa公司AMV反轉錄酶說明書進行反轉錄獲得cDNA。

表1 用于構建BiFC質(zhì)粒的相關引物Table 1 Primer sequences for the construction of BiFC plamids

1.4 PCR與質(zhì)粒構建以pEYFP-N1為模板，用引物對FV/RM1，F(xiàn)M1/RM2，F(xiàn)M2/RV進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，分別名為S1、S2、S3。再以S1和S2為模板，以引物對FV/RM2擴增，新的PCR融合片段為S12；然后以S12和S3為模板，以FV/RV為引物，將兩個片段PCR融合成全長Venus基因。該片段經(jīng)BglII/NotI酶切后，連入到相應的pEYFP-N1質(zhì)粒里替換EYFP，新的質(zhì)粒命名為Venus。接著，再以該Venus為模板，以FV/RVN和FVC/RV為引物，將該蛋白分割為兩片段，經(jīng)BglII/NotI酶切后，連入到Venus質(zhì)粒里替換全長Venus基因，新的質(zhì)粒分別命名為VN和VC。為了驗證BiFC片段，以pAPRRS質(zhì)粒為模板，以FPRVN/RPRVN為引物擴增PRRSV的N基因，并經(jīng)EcoRI/XhoI酶切，分別連入到VN和VC里，獲得質(zhì)粒N-VN和N-VC；以α-tubulin cDNA為模板，以Ftubulin/Rtubulin為引物擴增了tubulin基因，并經(jīng)BglII/XhoI酶切，分別連入到VN和VC里，獲得質(zhì)粒Tubulin-VN和Tubulin-VC。所有質(zhì)粒都經(jīng)過測序鑒定無誤。

1.5 質(zhì)粒轉染與熒光檢測將構建的質(zhì)粒經(jīng)轉化大腸桿菌擴大培養(yǎng)后，用 QIAprep? Spin Miniprep Kit提取質(zhì)粒，并進行濃度測定。將MARC-145細胞接種于6孔細胞板后，待細胞達到約60%密度時，將質(zhì)粒各取500 ng進行共轉染。具體步驟參照Fugene HD試劑說明書執(zhí)行。待轉染16 h后，棄去部分培養(yǎng)基，然后將細胞置于熒光倒置顯微鏡下觀察熒光并拍照保存。

2 結果

2.1 Venus突變體的構建根據(jù)突變體Venus與EYFP序列比較結果顯示，Venus共存在5個特異的氨基酸位點突變，分別為:F46L、F64L、M153T、V163A、S175G。構建示意圖如圖1所示。在突變PCR過程中，為便于以后插入目的基因，在其N端分別引物了EcoRI，BamHI和XhoI酶切位點。同時，為防止蛋白空間位阻的影響，在插入目的基因與Venus基因間引入了GGGGS的三個重復序列[6,7]（圖1）。該突變體Venus和pEYFP-N1質(zhì)粒經(jīng)轉染細胞16 h后，熒光顯微鏡觀察顯示兩者均發(fā)出綠色熒光，說明突變操作并未影響該蛋白的活性。

圖1 突變體Venus的構建與熒光檢測Fig.1 Construction and fl uorescence detection of the Venus mutant

2.2 VN與VC截斷片段的構建在突變獲得全長Venus基因后，采用PCR將其分割為兩部分:含N端173個氨基酸的VN和余下C端的VC。VN和VC質(zhì)粒均保留了N端的酶切位點及連接序列。兩質(zhì)粒經(jīng)單獨轉染和共轉染后16 h，甚至延長到32 h，在熒光顯微鏡下均未能檢測到熒光產(chǎn)生（圖2），說明Venus在分割為兩段后，失去了激發(fā)產(chǎn)生熒光的能力；同時也說明該兩片段在細胞內(nèi)共表達后，在沒有相互作用的目的蛋白連入時，并不能相互靠攏而形成有活性的熒光基團。

圖2 VN和VC片段的構建與熒光檢測Fig.2 Construction and fl uorescence detection of the VN and VC fragment

2.3 PRRSV N蛋白的插入與驗證PRRSV N蛋白已經(jīng)通過其他方法證明其可以形成同源二聚體，存在有明顯的相互作用[8]。為了進一步驗證VN和VC的可行性，我們將PRRSV N基因克隆到VN和VC上，觀察兩者在共轉染時，是否因為N蛋白的相互作用而產(chǎn)生熒光。如圖3所示，當N-VN和N-VC單獨轉染時，并不能產(chǎn)生熒光；而當兩者共轉染時，產(chǎn)生了明亮的綠色熒光。說明當目的蛋白存在相互作用時，可以將VN和VC片段彼此拉攏而重新形成有活性的熒光基團。

2.4 細胞骨架蛋白α-tubulin的插入與驗證上面我們已經(jīng)證明了VN和VC可以用于檢驗蛋白的相互作用。但為排除假陽性，我們從用于轉染的細胞系MARC-145中擴增出細胞骨架蛋白α-tubulin基因（圖4）。該基因全長1353 bp，451個氨基酸，序列比較發(fā)現(xiàn)與來源于人和倉鼠的基因完全相同。然后，將該基因連入到VN和VC，共轉染PRRSV N蛋白與細胞蛋白α-tubulin，看能否產(chǎn)生熒光。結果顯示:N-VN/Tubulin-VC和N-VC/Tubulin-VN沒有熒光產(chǎn)生，而Tubulin-VN和Tubulin-VC共轉染會產(chǎn)生熒光。該實驗說明該相互作用是特異的，排除了假陽性的發(fā)生，也進一步證明了該VN和VC用于研究蛋白質(zhì)相互作用的可靠性。

圖3 PRRSV N蛋白的插入與熒光檢測Fig.3 Construction of PRRSV N inserts and fl uorescence detection

圖4 Tubulin基因的擴增（A）及Tubulin-VC、Tubulin-VN構建示意圖（B）Fig.4 Amplifi cation of the α-tubulin gene (A) and construction of the α-tubulin inserts for fl uorescence detection (B)

3 討論

本文通過將黃色熒光蛋白EYFP突變?yōu)閂enus，然后于第173位氨基酸位點分割成兩部分，構建了BiFC片段VN和VC；并分別與已證明存在相互作用的PRRSV N基因連接，在共轉染的活細胞內(nèi)觀察到了熒光；同時，連入了細胞骨架蛋白α-tubulin來排除其假陽性。結果顯示該技術用于研究蛋白互作是可行的。

BiFC的互補片段來源可以采用EGFP、EYFP，ECFP等[2]，但因其片段互補產(chǎn)生有活性的熒光基團受溫度、成熟時間、發(fā)光強度等因素制約。目前證實采用EYFP的兩個突變體Citrine和Venus構建的熒光片段可在37℃生理條件下形成穩(wěn)定生色團，尤其Venus形成熒光強度更高[7]。因此，本實驗選用了Venus構建BiFC系統(tǒng)。

在選擇兩片段的分割位點上，亦有不同組合[1,2,7,9]:在第154氨基酸位點分割成兩段；在第173位點分割成兩段；也有研究人員選擇N端173氨基酸和從156氨基酸為起點的C端，這樣兩片段有20多位氨基酸的重疊片段，有利于熒光基團的生成。本實驗在最初選擇分割位點時，采用了后者的有部分重疊策略。但當兩片段共轉染時發(fā)現(xiàn)有很強的熒光背景（結果未顯示）。故我們重新選擇了從第173位點直接分割成兩部分，當兩者共轉染時，產(chǎn)生的熒光背景十分微弱（圖2），說明選擇該分割位點更為可靠。我們在構建該系統(tǒng)時，還在片段的N端引入了四個酶切位點，以方便我們在以后使用時插入目的蛋白。

BiFC的一個優(yōu)點是高度的靈敏性，但也往往會造成試驗結果的假陽性。為了進一步驗證該技術是可靠實用的，我們克隆了細胞骨架蛋白α-tubulin，并與PRRSV病毒的N蛋白共轉染，發(fā)現(xiàn)當兩個不相關的蛋白在細胞中共表達時沒有熒光產(chǎn)生，這將有利于排除因非特異性結合反應而導致的假陽性；在共轉染過程中，我們控制在六孔板中每個質(zhì)粒的轉染量不超過 500 ng，同時，在轉染后 12～16 h 即觀察熒光；另外，我們還刪除了存在于pEYFP-N1中的Kozak序列，以降低蛋白的表達水平。這些手段將減少因蛋白高量表達而造成的假陽性發(fā)生。為了排除目的蛋白和Venus片段的空間位阻效應而導致假陰性，我們在兩者間引入了一段疏水和親水氨基酸分隔排列的重復序列，以保持兩端蛋白的線性連接，減小了蛋白空間結構的影響。

自BiFC技術建立以來，因其有如常規(guī)的免疫共沉淀等體外方法不可比擬的優(yōu)越特性，已在生物各個領域里得到了廣泛的采用。例如在病毒學中，運用該方法研究編碼蛋白與宿主的相互作用、基因組復制轉錄與病毒顆粒包裝等[10-17]。但BiFC作為有力的實驗工具，也有許多限制。例如熒光片段互補連接后的不可逆性限制了蛋白互作的動態(tài)可逆過程研究。因其高度靈敏性，使用過程中得小心區(qū)分非特異的背景信號，以免造成假陽性。同時，如有不可避免的蛋白空間位阻效應，也可能產(chǎn)生假陰性。故在實際使用過程中，應與其他多種研究蛋白互作方法結合起來驗證。目前，BiFC已發(fā)展了多色熒光互補技術（multicolor fluorescence complementation，MFC），將多種熒光蛋白分割后進行組合，可以用于同時檢測多種蛋白質(zhì)的相互作用[2]?？傊?，BiFC存在諸多限制，但自身還在不斷發(fā)展和完善，相信會在生物學領域得到更廣泛的應用。

[1]Hu C D, Chinenov Y, Kerppola T K.Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation[J].Mol Cell, 2002, 9(4)： 789-798.

[2]Hu C D, Kerppola T K.Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis[J].Nat Biotechnol, 2003, 21(5)： 539-545.

[3]Kerppola T K.Complementary methods for studies of protein interactions in living cells[J].Nat Methods, 2006,3(12)： 969-971.

[4]Shyu Y J, Hu C D.Fluorescence complementation：an emerging tool for biological research[J].Trends Biotechnol, 2008, 26(11)： 622-630.

[5]Nagai T, Ibata K, Park E S,et al.A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications[J].Nat Biotechnol, 2002,20(1)： 87-90.

[6]Shimozono S and Miyawaki A.Engineering FRET Constructs Using CFP and YFP[M].Methods in Cell Biology, 2008, (85)： 381-393.

[7]Shyu Y J, Liu H, Deng X,et al.Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions[J].Biotechniques, 2006, 40(1)： 61-66.

[8]Wootton S K, and Yoo D.Homo-oligomerization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein and the role of disulfide linkages[J].J Virol, 2003, 77(8)： 4546-4557.

[9]Walter M, Chaban C, Schutze K,et al.Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation[J].Plant J, 2004, 40(3)：428-438.

[10]Aparicio F, Sanchez-Navarro J A and Pallas V.In vitro and in vivo mapping of the Prunus necrotic ringspot virus coat protein C-terminal dimerization domain by bimolecular fluorescence complementation[J].J Gen Virol, 2006, 87(Pt 6)： 1745-1750.

[11]Atanasiu D, Whitbeck J C, Cairns T M,et al.Bimolecular complementation reveals that glycoproteins gB and gH/gL of herpes simplex virus interact with each other during cell fusion[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(47)：18718-18723.

[12]Jin J, Sturgeon T, Chen C,et al.Distinct intracellular trafficking of equine infectious anemia virus and human immunodeficiency virus type 1 Gag during viral assembly and budding revealed by bimolecular fluorescence complementation assays[J].J Virol, 2007, 81(20)： 11226-11235.

[13]Kenney S P, Lochmann T L, Schmid C L,et al.Intermolecular interactions between retroviral Gag proteins in the nucleus[J].J Virol, 2008, 82(2)： 683-691.

[14]Hemerka J N, Wang D, Weng Y,et al.Detection and characterization of influenza A virus PA-PB2 interaction through a bimolecular fluorescence complementation assay[J].J Virol, 2009, 83(8)： 3944-3955.

[15]Zamoto-Niikura A, Terasaki K, Ikegami T,et al.Rift valley fever virus L protein forms a biologically active oligomer[J].J Virol, 2009, 83(24)： 12779-12789.