曹宇凡，喬洪賓，劉萍萍，楊云霞，石耀軍，李 浩，劉金明，林矯矯，金亞美

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241)

血吸蟲病（Schistosomiasis）是一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲病，威脅亞洲、非洲及拉丁美洲的76個(gè)國(guó)家和地區(qū)，感染人數(shù)達(dá)兩億，是僅次于瘧疾的重要熱帶疾病[1,2]。目前吡喹酮是該病唯一高效的大規(guī)模治療藥物，但已有抗藥性的相關(guān)報(bào)道，并且藥物治療無法控制重復(fù)感染[3]，因此急需開發(fā)研制新的高效的疫苗和治療藥物。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，一些重組蛋白抗原，可以產(chǎn)生高達(dá)50%左右的減蟲率，說明血吸蟲疫苗的研制具有可行性[4,5]。

UDP-葡萄糖表異構(gòu)酶（GALE）在生物體中參與葡萄糖代謝的催化作用，是主要參與催化這一過程的三種酶之一（另兩種為半乳糖激酶，半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶）[6-8]，它催化UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖之間的可逆反應(yīng)。GALE還參與細(xì)胞壁上多種糖化物的合成，如LPS、EPS等[9-11]。在果蠅和錐蟲等模式生物中，GALE蛋白對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響[12,13]；在人體內(nèi)，該蛋白的缺失引起代謝異常，導(dǎo)致半乳糖血癥[14]。曼氏血吸蟲和日本血吸蟲體內(nèi)也存在GALE蛋白[15,16]，本實(shí)驗(yàn)室前期工作中發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲GALE主要存在于蟲體表膜，這可能與血吸蟲通過皮膚轉(zhuǎn)化宿主能量有關(guān)[17]。

206佐劑（montanide ISA 206）是一種新型佐劑，乳化時(shí)不需添加其他乳化劑即可與水相穩(wěn)定結(jié)合，對(duì)硬件設(shè)備要求低，方便操作且對(duì)抗原的機(jī)械破壞小，故此類佐劑應(yīng)是未來佐劑的發(fā)展方向[18]。

本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)就rSjGALE重組蛋白的免疫保護(hù)效果和類型經(jīng)行了評(píng)估，證實(shí)rSjGALE與弗氏佐劑聯(lián)合免疫能夠獲得良好的保護(hù)效果[17]。但由于弗氏佐劑對(duì)宿主有一定的損傷作用，易形成局部結(jié)節(jié)和無菌性膿腫[19]，為尋求更適宜的免疫保護(hù)方案，本研究著重評(píng)估rSjGALE重組蛋白與206佐劑聯(lián)合免疫的保護(hù)效果，為SjGALE的功能和實(shí)際應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料蟲株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由中國(guó)大陸株日本血吸蟲尾蚴由上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；6周齡 BALB/c小鼠（SPF級(jí)）購自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。Agrose購自上海生工生物工程公司；Bacto-yeast extract、bactotryptone購自 OXOID 公司；Ni-NTA His Resin購自QIAGEN公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG 購自鼎國(guó)生物公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgE購自AbD Serotec公司；206佐劑由SEPPIC公司提供。

1.2 rSjGALE重組蛋白的表達(dá)采用實(shí)驗(yàn)室前期凍存表達(dá)菌種。前期構(gòu)建的pET-SjGALE質(zhì)粒，由SjGALE CDS基因全長(zhǎng)序列（GenBank:AY815833，1056 bp）與 pET28b連接，并轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞[17]。

復(fù)蘇凍存菌種，于固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，37 ℃溫箱過夜。挑取數(shù)個(gè)陽性菌落小量表達(dá)，37 ℃培養(yǎng)，當(dāng) OD600達(dá) 0.4～0.6 時(shí)加入終濃度為 1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體蛋白。SDS-PAGE分析，采用表達(dá)量最高的菌株大量表達(dá)，收集可溶性重組蛋白，并使用Ni-NTA His-Bind Resin參照說明書純化。

1.3 小鼠的免疫保護(hù)試驗(yàn)6～8 w 齡雄性 BALB/c 小鼠隨機(jī)分成免疫組和對(duì)照組，每組10只。免疫組皮下注射 rSjGALE（50 μg）與206佐劑混合物，對(duì)照組皮下注射 PBS與206佐劑混合物。佐劑油相與水相的比例為54：46，冰浴超聲乳化，4℃靜置30 min不分層后使用。每隔2 w免疫1次，共免疫3次。第3次免疫后14 d，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚貼片攻擊感染40±2條日本血吸蟲尾蚴，攻蟲38 d后，剖殺小鼠，收集血清，以肝門靜脈灌注法收集蟲體并計(jì)數(shù)，收集肝臟并分別計(jì)算減蟲率和減卵率。重復(fù)試驗(yàn)攻蟲后42 d剖殺。

1.4 免疫保護(hù)效果評(píng)估以肝門靜脈灌注法收集蟲體并計(jì)數(shù):

減蟲率=（1 -實(shí)驗(yàn)組蟲體數(shù)目/對(duì)照組蟲體數(shù)目）×100%

蟲卵計(jì)數(shù):剖殺小鼠，取肝臟稱重，置于50 mL離心管內(nèi)加去離子水適量，勻漿機(jī)勻漿后定容至20 mL，取 1 mL 勻漿液和 10% NaOH 等體積混合，37 ℃消化約30 min，消化過程中不時(shí)混勻并少量取樣觀察，待消化完全后，光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)蟲卵，重復(fù)3次取平均值:

減卵率=（1-實(shí)驗(yàn)組卵胚數(shù)目/對(duì)照組卵胚數(shù)目）×100%

蟲卵孵化:取4 mL勻漿液加入燒瓶中，加入去氯水至瓶頸上3～5 cm，液面上塞入薄層棉花（避免氣泡產(chǎn)生），棉花上方再輕輕加入適量去離子水，26～27℃孵化 2 h，將棉花上層 8 mL 液體轉(zhuǎn)移至 15 mL尖底離心管中，加入1～2滴碘酊固定染色毛蚴，4000×g 4℃離心 5 min，吸去大部分上清，剩余液體定容至2 mL，顯微鏡下計(jì)數(shù)毛蚴，重復(fù)3次取平均值:

孵化率 = 毛蚴總數(shù)/卵胚總數(shù)

減孵化率=（1-實(shí)驗(yàn)組孵化率/對(duì)照組孵化率）×100%

1.5 特異性抗體水平檢測(cè)IgG檢測(cè):于小鼠一免、二免、三免后的2 w收集血清，間接ELISA檢測(cè)各個(gè)時(shí)期IgG抗體水平。以純化的重組蛋白SjGALE （10 μg/ mL）包被96孔板，收集血清1：100稀釋后作為一抗，羊抗小鼠IgG（1：5000）為二抗，檢測(cè)抗體水平。IgE檢測(cè):于小鼠一免、二免、三免后的d 10收集血清，利用間接ELISA的方法檢測(cè)各個(gè)時(shí)期IgE抗體效價(jià)。以純化的重組蛋白SjGALE （10μg/mL）包被96孔板，收集血清1：100稀釋后作為一抗，羊抗小鼠IgE（1：1000）為二抗，檢測(cè)抗體水平。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白rSjGALE原核表達(dá)純化及抗原性分析pET-SjGALE質(zhì)粒在大腸桿菌 BL21（DE3）中，加入IPTG終濃度 1 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析顯示重組蛋白為40 kDa（圖1）。裂解液上清經(jīng)純化獲得較純的重組蛋白（圖2）。

圖1 pET-SjGALE在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of cell extracts and fractions from E.coli BL21(DE3)

圖2 純化的pET-SjGALE重組蛋白SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purifi ed recombinant protein pET-SjGALE

2.2 動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)為了考察rSjGALE的免疫保護(hù)效果，對(duì)三免2 w后的小鼠進(jìn)行攻擊感染，在攻蟲后38/42 d剖殺小鼠，利用肝門靜脈灌注的方法沖蟲并收集蟲體，統(tǒng)計(jì)蟲體數(shù)目，同時(shí)收集并處理小鼠肝臟，統(tǒng)計(jì)肝蟲卵數(shù)目，并孵化蟲卵、統(tǒng)計(jì)毛蚴孵出情況。第一次實(shí)驗(yàn)中取得每只雌蟲對(duì)肝臟荷卵貢獻(xiàn)下降13.7%，毛蚴孵化減少49.01%；第二次實(shí)驗(yàn)中肝臟荷卵減少51.5%。其余數(shù)據(jù) p-value 過高，組間差異度不夠，未參考（表1）。

表1 兩次免疫保護(hù)結(jié)果分析Table 1 Protective levels of BALB/c mice immunized with rSjGALE in two experiments

2.3 血清抗體水平IgG抗體水平檢測(cè)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組與佐劑對(duì)照組相比，二免后抗體水平即大幅升高（圖3）。IgE抗體水平檢測(cè)結(jié)果表明，IgE水平在二免后也緩慢升高（圖4）。

圖3 rSjGALE蛋白免疫小鼠后特異性抗rSjGALE IgG抗體檢測(cè)Fig.3 Analysis of specifi c anti-rSjGALE IgG induced in mice immunized with rSjGALE

圖4 rSjGALE蛋白免疫小鼠后特異性抗rSjGALE IgE抗體檢測(cè)Fig.4 Analysis of specifi c anti-rSjGALE IgE induced in mice immunized with rSjGALE

3 討論

前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，rSjGALE重組蛋白可以與抗日本血吸蟲全蟲抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的抗原性；以rSjGALE免疫小鼠所得血清也具有良好的反應(yīng)原性。rSjGALE與弗氏佐劑聯(lián)合免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生了較好的免疫保護(hù)效果，尤其是對(duì)雌蟲產(chǎn)卵能力有一定抑制效果；對(duì)抗體水平和細(xì)胞因子的分析表明rSjGALE誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對(duì)寄生蟲病有保護(hù)作用的Th1型免疫反應(yīng)[17]。

根據(jù)UDP-葡萄糖表異構(gòu)酶在其他物種中的研究，我們認(rèn)為SjGALE參與日本血吸蟲生長(zhǎng)代謝過程，為血吸蟲的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量。前期研究表明SjGALE的表達(dá)在感染宿主23 d即開始排卵時(shí)達(dá)高峰[17]，可能與成熟雌蟲排卵時(shí)需要大量能量有關(guān)，這應(yīng)該與在免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)的導(dǎo)致雌蟲產(chǎn)卵能力下降有關(guān)系。

我們分析了rSjGALE與206佐劑聯(lián)合應(yīng)用后在減蟲率、減卵率、雌蟲對(duì)肝臟荷卵率的貢獻(xiàn)降低及減孵化率的情況。此次免疫保護(hù)單位肝臟減卵率達(dá)51.52%，和使用弗氏佐劑相當(dāng)；每條雌蟲對(duì)肝臟荷卵的貢獻(xiàn)率降低13.7%，低于弗氏佐劑試驗(yàn)結(jié)果的66.2%，59.5%[17]；我們還發(fā)現(xiàn)rSjGALE免疫動(dòng)物體內(nèi)肝臟蟲卵的孵化率降低為49.01%，這方面的研究在弗氏佐劑實(shí)驗(yàn)中未涉及?？贵w水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IgG水平自二免后顯著升高，IgE水平也緩慢升高。IgE水平對(duì)寄生蟲病的有保護(hù)性作用[20]，能夠激活巨噬細(xì)胞，誘發(fā)細(xì)胞毒反應(yīng)[21,22]。有實(shí)驗(yàn)證明，血吸蟲感染42 d大鼠的血小板被動(dòng)至正常同系受體，在攻擊感染的當(dāng)日即導(dǎo)致高度的保護(hù)作用；但若血吸蟲感染42 d的大鼠血液經(jīng)IgE固相免疫吸附后，其促進(jìn)正常血小板毒性的能力則消失[23]?，F(xiàn)已證明特異性IgE抗體與抗血吸蟲病再感染能力呈正相關(guān)[24,25]，因此在血吸蟲候選疫苗抗原的研究中，能否刺激機(jī)體產(chǎn)生IgE抗體是一個(gè)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中IgE二免后即與對(duì)照組產(chǎn)生顯著差異，這應(yīng)與rSjGALE提供的免疫保護(hù)有關(guān)。兩次實(shí)驗(yàn)中蟲卵孵化率的差別，可能來源于攻蟲后剖殺天數(shù)的不同。血吸蟲蟲卵產(chǎn)出后還需約10 d左右才能成熟，所以42 d比38 d應(yīng)有更多成熟蟲卵，因此第二次實(shí)驗(yàn)比第一次實(shí)驗(yàn)蟲卵孵化率高。

日本血吸蟲雌蟲日產(chǎn)卵500～3500個(gè)，部分卵沉積在肝臟形成肉芽腫，嚴(yán)重破壞肝組織，是造成宿主病理損害的主要原因，蟲卵排出體外也是造成血吸蟲病傳播的主要根源。因此，減少產(chǎn)卵和降低蟲卵的孵化對(duì)血吸蟲病病理損害的減輕和傳播的阻斷具有重要意義[26]。rSjGALE不僅能夠明顯降低宿主肝臟中蟲卵數(shù)目，且降低蟲卵的孵化能力，可能在抗血吸蟲病傳播中發(fā)揮一定的作用。

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