丁平 羅政

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種全身性骨骼疾病,表現(xiàn)為骨量低、骨組織退化、骨結(jié)構(gòu)受損[1]。該病會增加骨折和其他骨相關(guān)疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),導(dǎo)致全球死亡率和醫(yī)療保健成本增加[2]。據(jù)報(bào)道,骨組織中成骨細(xì)胞成骨能力降低是OP形成原因之一[3]。而骨形成涉及成骨細(xì)胞增殖、遷移及分化等過程。因此,探究成骨細(xì)胞增殖、遷移及分化相關(guān)的分子機(jī)制對于OP的治療具有重要的意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一種長度>200個核苷酸的非編碼RNA,研究表明,lncRNAs在多種疾病中異常表達(dá)[4]。X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄本(X chromosome inactivation specific transcript,XIST)是一種lncRNA,已有研究報(bào)道,過表達(dá)XIST能促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[5]。而XIST對人成骨細(xì)胞增殖、遷移及分化的影響筆者所見鮮有報(bào)道。lncRNA通過海綿化miRNA來調(diào)控mRNA表達(dá)是近年來闡述lncRNA作用機(jī)制的常用方法[6]。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),XIST與miR-545-3p存在調(diào)控關(guān)系,miR-545-3p與SMAD5可靶向結(jié)合。而筆者發(fā)現(xiàn)XIST能否通過調(diào)控miR-545-3p/SMAD5軸影響人成骨細(xì)胞增殖、遷移及分化尚不明確。因此,本研究主要探究XIST對人成骨細(xì)胞增殖、遷移及分化的影響以及其作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人成骨細(xì)胞(human osteoblast,hOB)購自武漢原生原代生物公司。

1.2 主要試劑 CCK-8試劑盒(貨號:CK04)購自上海經(jīng)科化學(xué)公司;細(xì)胞核蛋白提取試劑盒(貨號:KTP3002)購自亞科因(武漢)生物公司;兔源一抗SMAD5(貨號:ab40771)、p-SMAD5(貨號:ab92698)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)(貨號:ab229126)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt related transcription factor 2,Runx2)(貨號:ab236639)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)(貨號:ab133612)、GAPDH(貨號:ab8245)、Histone H3(簡稱H3,貨號:ab1791)及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(貨號:ab6721)均購自美國Abcam公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分化誘導(dǎo) 將hOB細(xì)胞置于含有10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中,在37℃、5% CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。每3天更換1次培養(yǎng)基。為誘導(dǎo)hOB細(xì)胞分化,將1×105個細(xì)胞接種在6孔板中,并在含有10 mmol/L β甘油磷酸鈉、50 μmol/L抗壞血酸的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每3天更換1次培養(yǎng)基。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的hOB細(xì)胞分為ctrl組(正常培養(yǎng)的hOB細(xì)胞)、pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1)、pcDNA-XIST組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-XIST)、pcDNA-XIST+miR-NC組(pcDNA3.1-XIST和miR-NC共轉(zhuǎn)染)、pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic組(pcDNA3.1-XIST和 miR-545-3p mimic共轉(zhuǎn)染)。對hOB細(xì)胞先進(jìn)行上述轉(zhuǎn)染24 h,再在分化培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7 d,然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 qRT-PCR檢測XIST、miR-545-3p表達(dá) 使用Trizol試劑提取細(xì)胞中的總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。分別以GAPDH、U6為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt方法計(jì)算XIST、miR-545-3p的表達(dá)量。引物:XIST:正向5’-CATTGCTAGGCATTGGGGATG-3’;反向,5’-CCAGGAAGCATGTATCTTCTGG-3’;GAPDH:正向,5’-CTGGGCTACACTGAGCACC-3’;反向,5’-AATGGTCGTTGAGGGCAATG-3’;miR-545-3p:正向,5’-TGGCTCAGTTCAGCAGGAAC-3’;反向,5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’;U6:正向,5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’;反向,5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.6 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以5×104個/孔接種到96孔板中。分別將細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后,棄去細(xì)胞上清液,且在指定的時間點(diǎn)向每個孔中加入含有10 μl CCK-8溶液的100 μl完全培養(yǎng)基。孵育2 h后,使用酶標(biāo)儀在450 nm處監(jiān)測吸光度。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 細(xì)胞以5×105個/孔接種到6孔板中,使用100 μl移液器吸頭在約達(dá)到100%匯合細(xì)胞單層上進(jìn)行劃痕。用倒置光學(xué)顯微鏡記錄0、48 h的劃痕面積為W0和W48。劃痕愈合率(%)=(1-W48/W0)/×100%。

1.8 Western blot檢測蛋白表達(dá) 利用細(xì)胞核蛋白提取試劑盒提取hOB細(xì)胞核蛋白,RIPA裂解緩沖液提取hOB細(xì)胞總蛋白。檢測hOB細(xì)胞總蛋白中SMAD5、ALP、Runx2、OCN蛋白表達(dá),hOB細(xì)胞核蛋白中p-SMAD5蛋白表達(dá)。具體操作:將蛋白質(zhì)進(jìn)行定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,將膜與一抗SMAD5、ALP、Runx2、OCN、GAPDH、Histone H3在4℃下孵育過夜,再將膜與HRP偶聯(lián)的羊抗兔二抗在室溫下孵育2 h。加入ECL試劑觀察蛋白質(zhì)印跡,Image J軟件評估蛋白的灰度值。

1.9 茜素紅S染色檢測礦化結(jié)節(jié)形成 將在分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化7 d的各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞用PBS洗滌2次,并在室溫下用95%乙醇固定10 min。隨后,將固定的細(xì)胞在37℃下用1%茜素紅S溶液染色30 min,使用光學(xué)顯微鏡觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。通過使用Image J軟件來評估礦化結(jié)節(jié)形成率。

1.10 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) (1)構(gòu)建XIST野生型質(zhì)粒(XIST-WT)和突變型質(zhì)粒(XIST-MUT),將XIST-WT和XIST-MUT分別與miR-NC或miR-545-3p mimic共轉(zhuǎn)染于hOB細(xì)胞,48 h后,檢測熒光素酶活性。(2)構(gòu)建SMAD5野生型質(zhì)粒(SMAD5-WT)和突變型質(zhì)粒(SMAD5-MUT),將SMAD5-WT和SMAD5-MUT分別與miR-NC或miR-545-3p mimic共轉(zhuǎn)染于hOB細(xì)胞,48 h后,檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 5組hOB細(xì)胞中XIST及miR-545-3p表達(dá)比較 與ctrl組、pcDNA組比較,pcDNA-XIST組hOB細(xì)胞中XIST表達(dá)升高、miR-545-3p表達(dá)降低(P<0.05);與pcDNA-XIST組、pcDNA-XIST+miR-NC組比較,pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic組hOB細(xì)胞中XIST表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),miR-545-3p表達(dá)升高(P<0.05)。見表1。

表1 5組hOB細(xì)胞中XIST、miR-545-3p表達(dá)比較

2.2 5組hOB細(xì)胞增殖能力比較 與ctrl組、pcDNA組比較,pcDNA-XIST組hOB細(xì)胞OD450值(48、72 h)升高(P<0.05);與pcDNA-XIST組、pcDNA-XIST+miR-NC組比較,pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic組hOB細(xì)胞OD450值(48、72 h)降低(P<0.05)。見表2。

表2 5組hOB細(xì)胞OD450值比較

2.3 5組hOB細(xì)胞遷移能力比較 與ctrl組、pcDNA組比較,pcDNA-XIST組hOB細(xì)胞劃痕愈合率升高(P<0.05);與pcDNA-XIST組、pcDNA-XIST+miR-NC組比較,pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic組hOB細(xì)胞劃痕愈合率降低(P<0.05)。見圖1,表3。

圖1 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測hOB細(xì)胞遷移(×100)

表3 5組hOB細(xì)胞劃痕愈合率比較

2.4 5組hOB細(xì)胞中SMAD5及成骨分化標(biāo)志蛋白ALP、Runx2、OCN表達(dá)比較 與ctrl組、pcDNA組比較,pcDNA-XIST組hOB細(xì)胞中SMAD5、ALP、Runx2、OCN蛋白表達(dá)升高,細(xì)胞核中p-SMAD5蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與pcDNA-XIST組、pcDNA-XIST+miR-NC組比較,pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic組hOB細(xì)胞中SMAD5、ALP、Runx2、OCN蛋白表達(dá)降低,細(xì)胞核中p-SMAD5蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見圖2、3,表4。

圖2 Western blot檢測hOB細(xì)胞中SMAD5、ALP、Runx2、OCN蛋白表達(dá);A ctrl組;B pcDNA組;C pcDNA-XIST組;D pcDNA-XIST+miR-NC組;E pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic組

圖3 Western blot檢測hOB細(xì)胞核中p-SMAD5蛋白表達(dá);A ctrl組;B pcDNA組;C pcDNA-XIST組;D pcDNA-XIST+miR-NC組;E pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic組

表4 5組hOB細(xì)胞中SMAD5、ALP、Runx2、OCN蛋白表達(dá)及細(xì)胞核中p-SMAD5蛋白表達(dá)比較

2.5 5組hOB細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成比較 與ctrl組、pcDNA組比較,pcDNA-XIST組hOB細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成增多(P<0.05);與pcDNA-XIST組、pcDNA-XIST+miR-NC組比較,pcDNA-XIST+ miR-545-3p mimic組hOB細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成減少(P<0.05)。見圖4,表5。

圖4 茜素紅S染色檢測hOB細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成(×200)

表5 5組hOB細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成率比較

2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果 分別利用Starbase、TargetScan網(wǎng)站預(yù)測XIST與miR-545-3p、miR-545-3p與SMAD5的結(jié)合位點(diǎn)。與miR-NC和XIST-WT共轉(zhuǎn)染組比較,miR-545-3p mimic和XIST-WT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性降低(P<0.05);與miR-NC和XIST-MUT共轉(zhuǎn)染組比較,miR-545-3p mimic和XIST-MUT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與miR-NC和SMAD5-WT共轉(zhuǎn)染組比較,miR-545-3p mimic和SMAD5-WT共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性降低(P<0.05);與miR-NC和SMAD5-MUT共轉(zhuǎn)染組比較,miR-545-3p mimic和SMAD5-MUT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5、6,表6,7。

圖5 XIST與miR-545-3p的結(jié)合位點(diǎn)

圖6 miR-545-3p與SMAD5的結(jié)合位點(diǎn)

表6 熒光素酶活性比較

表7 熒光素酶活性比較

3 討論

作為一種慢性骨骼疾病,OP的特點(diǎn)是骨結(jié)構(gòu)受損和骨量低,并且其發(fā)病時可以降低骨強(qiáng)度和增加骨折的易感性[7]。雙膦酸鹽是常見地用于治療OP的藥物,長期使用這些藥物可以降低OP患者骨折的風(fēng)險(xiǎn)[8]。然而,目前的藥物治療方案存在各種限制,包括治療效果緩慢和長期使用時不良事件風(fēng)險(xiǎn)增加等[9]。因此,開發(fā)新的治療策略來調(diào)節(jié)OP患者的骨形成至關(guān)重要。

證據(jù)表明,lncRNA參與骨重構(gòu)以調(diào)節(jié)代謝性骨病,例如OP[10]。XIST是一種涉及X染色體失活的lncRNA[11]。有研究報(bào)道,沉默XIST抑制牙周膜干細(xì)胞的成骨分化[12]。而筆者發(fā)現(xiàn)XIST對人成骨細(xì)胞hOB的影響尚不完全清楚。成骨細(xì)胞的充分遷移對于維持骨的質(zhì)量和數(shù)量都很重要,成骨細(xì)胞遷移障礙可能會降低骨強(qiáng)度,導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[13]。此外,成骨細(xì)胞的增殖與成骨分化對于骨形成至關(guān)重要[14]。ALP、Runx2、OCN是成骨分化的標(biāo)志蛋白,ALP為成骨分化早期的標(biāo)志物,其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增高代表成骨的增加[15];OCN是一種成骨分化晚期的標(biāo)志物,出現(xiàn)在成骨分化和礦化過程中[16];Runx2與成骨細(xì)胞特異性順式作用元件2結(jié)合,作為成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用[4]。成骨分化還包括基質(zhì)的沉積和礦化等過程[17]。本研究結(jié)果顯示,過表達(dá)XIST促進(jìn)hOB細(xì)胞增殖、遷移,ALP、Runx2、OCN蛋白表達(dá)、礦化結(jié)節(jié)形成,提示過表達(dá)XIST可促進(jìn)hOB細(xì)胞增殖、遷移及成骨分化。

研究證實(shí)lncRNA可以作為競爭性內(nèi)源性RNA來下調(diào)miRNA[18]。本研究證實(shí)XIST是miR-545-3p的海綿。miR-545-3p是一種miRNA,已有研究發(fā)現(xiàn)miR-545-3p可阻礙成骨分化[19]。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)[19]是一致的。本研究結(jié)果顯示,過表達(dá)XIST可靶向負(fù)調(diào)控miR-545-3p表達(dá),且上調(diào)miR-545-3p減弱了過表達(dá)XIST對hOB細(xì)胞增殖、遷移及成骨分化的促進(jìn)作用。提示過表達(dá)XIST可能通過下調(diào)miR-545-3p促進(jìn)hOB細(xì)胞增殖、遷移及成骨分化。

此外,本研究表明,SMAD5是miR-545-3p的靶標(biāo)。SMAD5是一種受體調(diào)節(jié)的SMAD蛋白,其是成骨分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在生理?xiàng)l件下,SMAD5主要位于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)SMAD5被磷酸化時,它被導(dǎo)向細(xì)胞核,進(jìn)而調(diào)節(jié)成骨基因的表達(dá),誘導(dǎo)成骨分化[20]。據(jù)報(bào)道,抑制p-SMAD5的核轉(zhuǎn)位可以抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化[21]。本研究表明,過表達(dá)XIST促進(jìn)SMAD5蛋白及核p-SMAD5蛋白表達(dá),上調(diào)miR-545-3p減弱了過表達(dá)XIST對SMAD5蛋白及核p-SMAD5蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用,且miR-545-3p靶向調(diào)控SMAD5表達(dá),提示過表達(dá)XIST可能通過海綿化miR-545-3p并上調(diào)SMAD5促進(jìn)hOB細(xì)胞增殖、遷移及成骨分化。

綜上所述,過表達(dá)XIST可能通過海綿化miR-545-3p并上調(diào)SMAD5促進(jìn)hOB細(xì)胞增殖、遷移及成骨分化。XIST/miR-545-3p/SMAD5軸可能成為治療OP的一種新的靶點(diǎn)。然而本研究尚存在不足之處,僅僅在細(xì)胞水平上驗(yàn)證了XIST/miR-545-3p/SMAD5軸對hOB細(xì)胞增殖、遷移及成骨分化的影響,并未在體內(nèi)水平上進(jìn)行探討,后續(xù)研究將會在體內(nèi)水平上進(jìn)行進(jìn)一步探索。