崔云峰,金 月,魏 來(lái),金明光

(1.北京勁松口腔醫(yī)院,北京100020;2.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)醫(yī)院 口腔科;3.長(zhǎng)春市中醫(yī)院 口腔科;4.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院)

近年來(lái)，抗血管生成治療已成為治療腫瘤的新策略，尤其是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor VEGF)與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展，浸潤(rùn)，轉(zhuǎn)移的關(guān)系備受關(guān)注，VEGF水平表達(dá)升高與多種腫瘤不良預(yù)后密切相關(guān)[1]，因此抑制VEGF基因表達(dá)，可阻止腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，研究顯示，VEGF在舌癌組織中呈高表達(dá)狀態(tài)[2]。故本研究應(yīng)用siRNA沉默VEGF基因表達(dá)。旨在為人口腔舌癌基因治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人舌癌細(xì)胞株(Tca8113細(xì)胞)由北京大學(xué)口腔醫(yī)院饋贈(zèng)，實(shí)驗(yàn)所用試劑均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。MTT(噻唑藍(lán))試劑購(gòu)美國(guó)sigma公司。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(日本Takara公司)。

1.2 方法

1.2.1siRNA的制備參照[3]進(jìn)行操作，略加改進(jìn)。

所有siRNA都通過(guò)T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄法進(jìn)行，具體操作參照promega T7 Ribo-MAX Express RNAi syste 試劑盒方案。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)錄參照[4]進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 siRNA轉(zhuǎn)染24 h后Tca8113細(xì)胞增殖變化轉(zhuǎn)染24 h后各組Tca8113細(xì)胞有明顯的改變，與空載體對(duì)照組相比，無(wú)論在細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面還是細(xì)胞增殖數(shù)量均明顯不同見(jiàn)圖1、2。

圖1 脂質(zhì)體對(duì)照組細(xì)胞(100×) 圖2 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(100×)

2.2 Westeen Blot結(jié)果

轉(zhuǎn)染正義鏈siRNA1的Tca8113細(xì)胞蛋白表達(dá)明顯被抑制，與錯(cuò)義鏈siRNA2脂質(zhì)體容載量siRNA3及對(duì)照組相比有明顯差異，見(jiàn)圖3，表明siRNA可有效特異的抑制VEGF蛋白表達(dá)、證明其轉(zhuǎn)染的siRNA是成功的。同時(shí)抑制了Tca8113細(xì)胞的增殖。

1.siRNA1 2.siRNA2 3.siRNA3 4.正常對(duì)照組

2.3 MTT結(jié)果

結(jié)果顯示siRNA 正義組與脂質(zhì)體組及正常對(duì)照組之間相比差異顯著，P<0.01，而脂質(zhì)體組，錯(cuò)義組與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，P>0.05.證明重組的siRNA降低Teag8113細(xì)胞代謝，能夠特異的抑制Tca8113細(xì)胞的增殖。見(jiàn)表1。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

在共轉(zhuǎn)染Tea8113細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果顯示，G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少， G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多，且細(xì)胞凋亡率升高與脂質(zhì)體空載組及正常對(duì)照組相比差異非常顯著。見(jiàn)表2。

表1 siRNA正義組與其他各組對(duì)Teag8113細(xì)胞增殖抑制率

表2 轉(zhuǎn)染siRNA24 h后細(xì)胞周期進(jìn)程及凋亡率

2.5 VEGF含量表達(dá)

siRNA轉(zhuǎn)染Teag8113細(xì)胞上清液中VEGF含量檢測(cè)明顯低于各對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 各組Teag8113細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF含量表達(dá)

3 討論

siRNA干擾是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的特異性調(diào)控基因表達(dá)的分子生物學(xué)技術(shù)，小分子RNA按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，與靶基因特異性結(jié)合并使其降解、沉默、從而抑制基因的表達(dá)。本研究利用siRNA干擾技術(shù)，共轉(zhuǎn)染VEGF siRNA小片段分子，可特異有效的下調(diào)Tca8113細(xì)胞的VEGF基因沉默。從而抑制Tca8113細(xì)胞的增殖[5]。研究結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染siRNA24 h后，Tca8113細(xì)胞增殖數(shù)量明顯減少。與對(duì)照組及空載組、錯(cuò)義組相比差異有顯著意義。細(xì)胞增殖變緩，數(shù)量減少。Western Blot結(jié)果亦印證Tca113細(xì)胞RNA蛋白量減少，細(xì)胞增殖發(fā)生了特異性抑制現(xiàn)象。MTT結(jié)果表明共轉(zhuǎn)染的siRNA正義組與siRNA錯(cuò)義組、脂質(zhì)體空載組、正常對(duì)照組之間差異非常明顯，P<0.01，證明siRNA能夠降低Tca8113細(xì)胞的代謝。此外，本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)共轉(zhuǎn)染的siRNA Tca8113細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡率的改變，結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比，其細(xì)胞周期有明顯的S期，G2/M期阻滯，G0/G1期細(xì)胞增多與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞不能進(jìn)入S期，造成G2/M期細(xì)胞相對(duì)增多，而G2/M期細(xì)胞增多是細(xì)胞凋亡的普遍反應(yīng)。細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡看似相互獨(dú)立的生殖過(guò)程，實(shí)際上是統(tǒng)一在整個(gè)細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)中，并通過(guò)一系列調(diào)控機(jī)制協(xié)調(diào)兩者之間的關(guān)系[6]。即可阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，還可引起細(xì)胞凋亡。

VEGF不僅是新生血管形成的前提條件，同時(shí)也是促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的重要因素，因此抗血管生成已成為目前腫瘤治療的重要方向。尤其在晚期腫瘤治療中VEGF及VEGFR抑制劑已經(jīng)陸續(xù)取得成功。期待未來(lái)能夠開(kāi)展更多的臨床研究。

本研究通過(guò)共轉(zhuǎn)染技術(shù)，從基因水平上觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。為腫瘤的基因治療提供了一條新的思路。