李 鈞 童 哲 魏 勇 舒正華 王西迅

(嘉興市武警醫(yī)院骨三科，浙江 嘉興 314000)

miR-125b靶向Smad4調(diào)控非創(chuàng)傷性股骨頭壞死骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化與增殖的相關(guān)性

李 鈞 童 哲 魏 勇 舒正華 王西迅

(嘉興市武警醫(yī)院骨三科，浙江 嘉興 314000)

目的 探討miR-125靶向Smad4調(diào)控對(duì)非創(chuàng)傷性股骨頭壞死骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化與增殖的影響。方法 培養(yǎng)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞系HMSC-bm，將miR-125b 模擬物(mimics)、miR-125b 抑制物(inhibitor)和對(duì)照(miR-NC)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，qRT-PCR和Western印跡檢測(cè)過(guò)表達(dá)對(duì)Smad4表達(dá)的影響，構(gòu)建野生型和突變型的Smad4的3′-UTR熒光素酶報(bào)告載體，分別命名為Wt-Smad4和Mut-Smad4，將構(gòu)建好的質(zhì)粒做三組共轉(zhuǎn)染，即Wt-Smad4與miR-125b mimics、Mut-Smad4和miR-125b mimics以及 miR-NC與miR-125b mimics，檢測(cè)熒光素酶的活性；BMP-2誘導(dǎo)HMSC-bm分化，將miR-125b mimics和si-Smad4轉(zhuǎn)染到分化的細(xì)胞內(nèi)，以不轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為參照，檢測(cè)miR-125b靶向Smad4對(duì)細(xì)胞分化的影響；將miR-125b mimics、miR-125b inhibitor和miR-NC轉(zhuǎn)染到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMSC-bm細(xì)胞系，膽囊收縮素(CCK)8檢測(cè)過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖的影響；將miR-125b mimics與pcDNA3.1-Smad4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染；miR-125b mimics；miR-NC組；miR-NC與pcDNA3.1-Smad4組轉(zhuǎn)染到HMSC-bm細(xì)胞系，檢測(cè)miR-125b靶向Smad4對(duì)細(xì)胞增殖和分化的影響。結(jié)果 轉(zhuǎn)染 miR-125b mimics組Smad4的相對(duì)表達(dá)量顯著低于miR-125b NC組，轉(zhuǎn)染miR-125b inhibitor組Smad4的相對(duì)表達(dá)量顯著高于miR-125b NC組(P<0.01)，Western印跡的檢測(cè)結(jié)果與其一致，熒光素酶結(jié)果顯示，Wt-Smad4與miR-125b mimics組熒光素酶活性顯著低于miR-NC與miR-125b mimics組(P<0.01)，結(jié)果證實(shí)Smad4是miR-125b的靶基因；miR-125b mimics和si-Smad4 組Runx2和Osterix mRNA表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-125b mimics組在24 h、48 h、72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的增殖率顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，miR-125b inhibitor 組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖率顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；miR-125b靶向Smad4對(duì)細(xì)胞增殖分化的影響試驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-125b mimics組細(xì)胞增殖顯著高于miR-NC組(P<0.01)，miR-125b mimics與pcDNA3.1-Smad4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖顯著高于miR-NC(P<0.05)，miR-NC與pcDNA3.1-Smad4組細(xì)胞增殖顯著低于miR-NC組(P<0.05)，miR-125b mimics組和miR-125b mimics+pcDNA3.1-Smad4組細(xì)胞中Runx2和Osterix的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于miR-NC組(P<0.01)；miR-NC+pcDNA3.1-Smad4組細(xì)胞中Runx2和Osterix的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于miR-NC組(P<0.01)。結(jié)論 Smad4是miR-125b的靶基因，上調(diào)miR-125b促進(jìn)細(xì)胞增殖，下調(diào)miR-125b減弱細(xì)胞增殖，miR-125b靶向Smad4調(diào)控HMSC-bm細(xì)胞增殖和分化。

miR-125b；Smad4；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞；分化；增殖

非創(chuàng)傷性股骨頭壞死一般采用姑息治療。一般患者在4～5年將出現(xiàn)股骨頭的塌陷，需要進(jìn)行全髖關(guān)節(jié)置換〔1〕。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一種成體干細(xì)胞，具有多項(xiàng)的分化潛能，可分化成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞等〔2〕。研究顯示，激素誘導(dǎo)的MSCs向脂肪細(xì)胞分化，能使股骨頭的壞死加重，當(dāng)發(fā)生股骨頭壞死后，股骨頭、莖、干MSCs增殖和分化能力下降，導(dǎo)致機(jī)體進(jìn)行自身的修復(fù)能力下降〔3〕。MiRNAs是一類含有19～25個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，能與靶基因結(jié)合從而抑制靶mRNA的翻譯和使靶mRNA降解，達(dá)到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的目的〔4〕。研究顯示，miR-125b可參與MSCs成骨的分化，下調(diào)miR-125b后，可促進(jìn)MSCs成骨的分化〔5〕。本研究通過(guò)預(yù)測(cè)miR-125b的靶基因，證實(shí)miR-125b靶向調(diào)控Smad4對(duì)骨髓MSCs分化和增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco，胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Sigma；BMP-2購(gòu)自美國(guó)RD公司；SYBR Green購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；miR-125b mimics、miR-125b inhibitor、miR-NC購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)西盟公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人MSCs(HMSCs)的分離和培養(yǎng) 從非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者取骨髓2 ml，DMEM培養(yǎng)液等倍稀釋，500 r/min離心10 min，吸掉上清和上層脂肪，再次等倍稀釋后，加入Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，2 000 r/min離心30 min，收集單個(gè)核細(xì)胞，洗滌2次，加入含有10 ml的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d后換液，棄去未貼壁細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后，用0.25%Trypsin-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMSC-bm細(xì)胞系，加入0.25 %的胰蛋白酶消化細(xì)胞，細(xì)胞呈單個(gè)存在時(shí)，轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入不含有胎牛血清(FBS)的不完全培養(yǎng)液接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí)，將miR-125b mimics、miR-125b inhibitor和miR-NC與不完全培養(yǎng)基混合后加入到HMSC-bm細(xì)胞，滴加到24孔板表面，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。qRT-PCR及Western印跡檢測(cè)Smad4基因表達(dá)。

1.2.3 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 通過(guò)PicTa、TargetScan、The miRBase三大靶基因預(yù)測(cè)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-125b與Smad4的3′-UTR有結(jié)合位點(diǎn)。將含有miR-125b結(jié)合位點(diǎn)的Smad4的3′-UTR片段插入PGL-REPORT載體報(bào)告基因中，構(gòu)建野生型和突變型的Smad4的3′-UTR熒光素酶報(bào)告載體，分別命名為Wt-Smad4和Mut-Smad4。將構(gòu)建好的質(zhì)粒做三組共轉(zhuǎn)染，即Wt-Smad4與miR-125b mimics、Mut-Smad4和miR-125b mimics以及 miR-NC與miR-125b mimics。37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，參照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)雙熒光素酶活性。

1.2.4 miR-125b對(duì)HMSC-bm細(xì)胞系分化的影響 取第三代HMSC-bm細(xì)胞系，觀察到細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用0.25%胰酶消化，接種到3個(gè)12孔板中，加入含有10%FBS 的DMEM培養(yǎng)液，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)3個(gè)12孔板中的細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí)，在15個(gè)孔中加入10%FBS 的DMEM+100 ng/ml BMP-2 配制成成骨誘導(dǎo)液作為實(shí)驗(yàn)組，15個(gè)孔加入含有10%FBS 的DMEM培養(yǎng)液為陰性對(duì)照組。3 d換液1次，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到60%～70%時(shí)，將miR-NC、miR-125b mimics、si-Smad4、 miR-125b mimics與pcDNA3.1-Smad4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，miR-NC與pcDNA3.1-Smad4組細(xì)胞加入含有5 μl脂質(zhì)體和500 μl無(wú)血清培養(yǎng)基中，充分混勻后，室溫靜置40 min，F(xiàn)BS洗滌細(xì)胞后，加入1.5 ml不含有抗生素的無(wú)血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)入6孔板中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，換成完全培養(yǎng)基用于后續(xù)的試驗(yàn)。

1.2.5 miR-125b對(duì)HMSC-bm細(xì)胞系增殖的影響 取轉(zhuǎn)染后生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的miR-125b mimics、miR-125b inhibitor和miR-NC三組細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升中含有3×105個(gè)細(xì)胞，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入細(xì)胞懸液100 μl，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，加入10 μl膽囊收縮素(CCK)8溶液，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450 nm處測(cè)定并記錄各組的吸光度OD。

1.2.6 miR-125b靶向Smad4對(duì)細(xì)胞增殖的影響 實(shí)驗(yàn)分為四組：一組為miR-125b mimics與pcDNA3.1-Smad4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染；一組為miR-125b mimics；一組為miR-NC；一組miR-NC與pcDNA3.1-Smad4。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HMSC-bm細(xì)胞系，胰酶消化細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，與不含有FBS的不完全培養(yǎng)液接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%時(shí)，將四組細(xì)胞與培養(yǎng)基混合，充分混勻后，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 靶基因預(yù)測(cè) 轉(zhuǎn)染 miR-125b mimics組Smad4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量(0.36±0.09)顯著低于miR-125b NC組(0.98±0.11)，轉(zhuǎn)染miR-125b inhibitor組(3.45±0.23)顯著高于miR-125b NC組(P<0.01)，Western印跡的檢測(cè)結(jié)果與其一致。其中miR-125bNC組Smad4蛋白表達(dá)量為0.657±0.100，miR-125bmimics組為0.221±0.050,miR-125b inhibitor組為1.181±0.090。為了更準(zhǔn)確地證實(shí)Smad4是miR-125b的靶基因，接下來(lái)進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)，通過(guò)三組共轉(zhuǎn)染，即Wt-Smad4與miR-125b mimics、Mut-Smad4和miR-125b mimics以及 miR-NC與miR-125b mimics。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Wt-Smad4與miR-125b mimics組熒光素酶活性(0.45±0.06)顯著低于miR-NC(1.00±0.11)與miR-125b mimics組(0.95±0.09，P<0.01)，Mut-Smad4和miR-125b mimics與miR-NC和miR-125b mimics之間差異不顯著(P>0.05)。這些結(jié)果證實(shí)Smad4是miR-125b的靶基因。見圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Smad4的蛋白表達(dá)量

2.2 miR-125b對(duì)HMSC-bm細(xì)胞分化的影響 將miR-125b mimics和si-Smad4轉(zhuǎn)染到HMSC-bm細(xì)胞，誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化后7 d收集樣品。qRT-PCR檢測(cè)Runx2和Osterix mRNA表達(dá)量，miR-125b mimics、si-Smad4 Runx2 mRNA表達(dá)量(0.38±0.06，0.50±0.07)和Osterix mRNA表達(dá)量(0.49±0.05，0.60±0.06)顯著低于對(duì)照組(1.00±0.04,1.00±0.05,P<0.01)，說(shuō)明 miR-125b能靶向調(diào)節(jié)Smad4調(diào)控HMSC-bm細(xì)胞分化。

2.3 miR-125b對(duì)細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染后24、48、72 h，miR-125b mimics組在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的增殖率顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，miR-125b inhibitor 組顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，說(shuō)明miR-125b能對(duì)細(xì)胞的增殖有調(diào)控作用。見圖2。

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01圖2 miR-125b對(duì)細(xì)胞增殖的影響

2.4 共轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖的影響 將miR-125b mimics與pcDNA3.1-Smad4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染；miR-125b mimics；miR-NC組；miR-NC與pcDNA3.1-Smad4組轉(zhuǎn)染到細(xì)胞后72 h，收集細(xì)胞，CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖，圖3顯示，miR-125b mimics組細(xì)胞增殖顯著高于miR-NC組(P<0.01)，miR-125b mimics與pcDNA3.1-Smad4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖顯著高于miR-NC(P<0.05)，miR-NC與pcDNA3.1-Smad4組細(xì)胞增殖顯著低于miR-NC組(P<0.05)。說(shuō)明過(guò)表達(dá)Smad4減弱了miR-125b對(duì)細(xì)胞的增殖。

與miR-NC比較：1)P<0.05，2)P<0.01圖3 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖率

2.5 共轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞分化的影響 將miR-125b mimics與pcDNA3.1-Smad4質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染；miR-125b mimics；miR-NC組；miR-NC與pcDNA3.1-Smad4組轉(zhuǎn)染到細(xì)胞，誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)分化后7 d收集樣品。qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中Runx2和Osterix mRNA表達(dá)量，結(jié)果顯示，miR-125b mimics組(3.92±0.18，3.81±0.23)和miR-125b mimics+pcDNA3.1-Smad4組(2.23±0.14，2.01±0.12)細(xì)胞中Runx2和Osterix的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于miR-NC組(0.99±0.02,0.98±0.03,P<0.01)；miR-NC+pcDNA3.1-Smad4組細(xì)胞中Runx2和Osterix的mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.40±0.07,0.45±0.08)顯著低于miR-NC組(P<0.01)。

3 討 論

目前沒有一種學(xué)說(shuō)能很好地解釋非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的病因和發(fā)病機(jī)制〔6〕。研究者發(fā)現(xiàn)，非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的MSCs數(shù)量降低，增殖能力降低，成骨能力減弱，然而成脂能力增強(qiáng)；非創(chuàng)傷性股骨頭壞死與MSCs有關(guān)〔7〕。miRNA是一種進(jìn)化保守、數(shù)量多的小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起到重要的作用〔8〕。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在干細(xì)胞的分化、增殖等過(guò)程中發(fā)揮作用，對(duì)調(diào)控MSCs成骨成脂分化過(guò)程也有重要作用，miR-125b能抑制MSCs的成骨分化〔9〕。然而，miR-125b是何種機(jī)制調(diào)控MSCs的增殖分化還需要進(jìn)一步探索。

Runx2是成骨細(xì)胞成骨和分化過(guò)程中重要的控制基因，可促進(jìn)成骨細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，當(dāng)Runx2基因缺失，會(huì)引起骨發(fā)育不良或者發(fā)育終止〔10〕。Osterix是在Runx2之后發(fā)現(xiàn)的成骨細(xì)胞分化關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)，缺乏Osterix的小鼠，軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨缺乏，成骨細(xì)胞分化的各種標(biāo)志物的表達(dá)也將下降〔11〕。這說(shuō)明這兩個(gè)基因?qū)撬韪杉?xì)胞的分化起了重要的作用。本研究說(shuō)明 miR-125b能靶向調(diào)節(jié)Smad4調(diào)控HMSC-bm細(xì)胞分化。另外，本研究說(shuō)明轉(zhuǎn)染 miR-125b能對(duì)細(xì)胞的增殖有調(diào)控作用。這也提示在創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者治療時(shí)，可以通過(guò)轉(zhuǎn)染高低表達(dá)的miRNA的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。miR-125b對(duì)骨髓干細(xì)胞增殖有影響，而且本研究說(shuō)明過(guò)表達(dá)Smad4抑制減弱了miR-125b對(duì)細(xì)胞的增殖。

綜上，Smad4是miR-125b的靶基因，上調(diào)miR-125b促進(jìn)細(xì)胞增殖，下調(diào)miR-125b減弱細(xì)胞增殖，miR-125b靶向Smad4影響HMSC-bm的增殖和分化。

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〔2016-10-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

童 哲(1981-)，男，主治醫(yī)師，主要從事創(chuàng)傷、顯微研究。

李 鈞(1969-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事創(chuàng)傷、顯微研究。

R681.8

A

1005-9202(2017)02-0306-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.020