劉立蘋 喻長(zhǎng)遠(yuǎn) 許立達(dá)

(北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029)

引 言

自1982年禮來公司推出重組人胰島素以來，生物制藥在市場(chǎng)擴(kuò)展和技術(shù)方面取得了很大進(jìn)展[1]。隨著人們對(duì)治療性蛋白市場(chǎng)需求的不斷增加，對(duì)重組蛋白生產(chǎn)宿主生產(chǎn)能力的要求也越來越高。中國(guó)倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)細(xì)胞作為最常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)宿主，相比于其他細(xì)胞類型具有以下幾個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)：1)能夠在化學(xué)成分清晰的無血清培養(yǎng)基中高密度生長(zhǎng)；2)不易傳播人類病毒；3)能夠?qū)Ρ磉_(dá)的重組蛋白進(jìn)行與人類相似的翻譯后修飾；4)容易產(chǎn)生工程化細(xì)胞克隆，該細(xì)胞克隆可對(duì)目的基因進(jìn)行高效且穩(wěn)定的表達(dá)[2]。雖然具有上述優(yōu)勢(shì)，但是CHO細(xì)胞在生長(zhǎng)能力和蛋白表達(dá)能力方面仍有待提高。

大部分治療性蛋白為分泌型蛋白，如單克隆抗體、干擾素γ、促紅細(xì)胞生成素等[3]。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在分泌途徑中起著至關(guān)重要的作用，因此，不少學(xué)者研究了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白和重組蛋白產(chǎn)生之間的相互關(guān)系。例如，Ku等[3]分別在CHO細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞NS0中過表達(dá)X盒結(jié)合蛋白1的剪切形式(spliced form of X-box binding protein 1, XBP1s)，研究該蛋白對(duì)這2種細(xì)胞分泌單克隆抗體、干擾素γ和促紅細(xì)胞生成素的影響，結(jié)果表明，當(dāng)合成重組蛋白的量超過了宿主細(xì)胞的分泌能力時(shí)，XBP1s能夠顯著提高重組蛋白的產(chǎn)量。除了XBP1s外，免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)(immunoglobulin heavy chain binding protein, BiP)、轉(zhuǎn)錄激活因子6(activating transcription factor 6, ATF6)[4]、真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α, eIF2α)[5]、轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcription factor 4, ATF4)[6]、生長(zhǎng)停滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白34(growth arrest and DNA damage inducible protein 34, GADD34)[7]等也都在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)中發(fā)揮重要作用。除了上述蛋白，其他一些蛋白質(zhì)，如鈣連蛋白(calnexin, CNX)[8]、鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin, CRT)[8]、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase, PDI)[9]、信號(hào)識(shí)別顆粒14(signal recognition particle 14, SRP14)[10]等也都被報(bào)道能夠促進(jìn)細(xì)胞的重組蛋白合成或分泌。

瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)于穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)具有快速高效的優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于候選重組蛋白的初期研發(fā)。ExpiCHO- S細(xì)胞是一株能夠適應(yīng)高密度培養(yǎng)的懸浮細(xì)胞，被廣泛用于重組蛋白的瞬時(shí)表達(dá)。LAG3(lymphocyte activation gene 3)為淋巴細(xì)胞激活基因，是一個(gè)潛在的腫瘤免疫治療靶點(diǎn)。但目前用ExpiCHO- S細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)anti- hLAG3的水平較低，為了提高該抗體的表達(dá)水平，研究了過表達(dá)蛋白合成與分泌相關(guān)蛋白對(duì)ExpiCHO- S細(xì)胞生長(zhǎng)和anti- hLAG3生產(chǎn)的影響，為該細(xì)胞的工程化改造提供依據(jù)，同時(shí)也為其他重組蛋白生產(chǎn)細(xì)胞的工程化改造提供借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

ExpiCHO- S細(xì)胞購于Thermo Fisher Scientific公司；LAG3- Relatlimab- IgG4由本實(shí)驗(yàn)室合成；pCAG- Hygro載體、pCAG- Hygro- IRES2- EGFP載體、大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；ExpiCHO- S細(xì)胞培養(yǎng)及表達(dá)所用培養(yǎng)基為ExpiCHO Expression Medium，絡(luò)合培養(yǎng)基為Gibco OptiPRO SFM，細(xì)胞轉(zhuǎn)染所用試劑為ExpiFectamine CHO試劑，均購于Thermo Fisher Scientific公司；臺(tái)盼藍(lán)購于美國(guó)Amresco公司。

恒溫震蕩培養(yǎng)箱(ISF1- X型，瑞士Adolf Kuhner公司)，流式細(xì)胞儀(BD LSRFortessa型，美國(guó)BD公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(qRT- PCR)(ABI PRISM 7000型，美國(guó)ABI公司)，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Countstar型，上海睿鈺生物科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

human XBP1s、human ATF6c、CHO ATF4、human E2F1、Bovine eIF2α、CHO GADD34、CHO NFKBIz、human C/EBPα、human BiP、CHO CRT、CHO CNX、CHO PDI、CHO ERP57、human SLY1、human vAMP8、human SRP14、human Munc18c、human SNAP- 23、human CERT和human mTOR共20種蛋白的基因序列由其氨基酸序列(www.uniprot.org/)經(jīng)密碼子優(yōu)化后由北京擎科生物科技有限公司合成，隨后由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建表達(dá)載體，連接載體時(shí)所用的酶切位點(diǎn)為NheⅠ和BamH Ⅰ，引物信息如表1所示。表達(dá)載體構(gòu)建完成后通過基因測(cè)序驗(yàn)證其是否連接正確。

為檢測(cè)上述蛋白的表達(dá)載體在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率，在這些蛋白的基因后連接增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)基因作為報(bào)告基因，之間用IRES2連接，重組表達(dá)質(zhì)粒圖譜見圖1。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒圖譜Fig.1 Recombinant expression plasmid map

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染

于24孔深孔板中每孔接種6×106個(gè)/mL的ExpiCHO- S細(xì)胞2.5 mL。取1.5 mL無菌離心管，加入192 μL Gibco OptiPRO SFM，然后加入2 μg質(zhì)粒DNA，輕柔混勻后加入8 μL ExpiFectamine CHO試劑，再次輕柔混勻，立即加入準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液中。在2 μg質(zhì)粒DNA中，LAG3- Relatlimab- IgG4質(zhì)粒輕重鏈(1∶1，質(zhì)量比)共1.6 μg，蛋白合成與分泌相關(guān)蛋白的質(zhì)粒為0.4 μg。將細(xì)胞置于37 ℃、8% CO2、200 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后18～22 h內(nèi)加入15 μL Enhancer和600 μL Feed。

1.2.3轉(zhuǎn)染效率測(cè)定

取30 μL轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)72 h的細(xì)胞懸液，1 200 r/min離心5 min，棄上清，用無菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，再用50 μL PBS重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP的表達(dá)情況。陰性對(duì)照細(xì)胞為轉(zhuǎn)染了pCAG- Hygro載體和anti- hLAG3輕重鏈的ExpiCHO- S細(xì)胞，以及轉(zhuǎn)染了pCAG- Hygro- IRES2- EGFP載體和anti- hLAG3輕重鏈的ExpiCHO- S細(xì)胞，并分別記為Null和EGFP。各基因的表達(dá)載體在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率采用FlowJo 7.6分析，根據(jù)陰性對(duì)照細(xì)胞畫門，再應(yīng)用到所有處理細(xì)胞上，即可得到各基因的轉(zhuǎn)染效率。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.4qRT-PCR測(cè)定XBP1s轉(zhuǎn)錄水平

從瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的ExpiCHO- S細(xì)胞中提取總RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(GAPDH)作為內(nèi)參進(jìn)行qRT- PCR分析。所用試劑盒為Power SYBR?Green PCR Master Mix Kit(美國(guó)ABI公司)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算XBP1s的mRNA相對(duì)含量。引物序列如表2所示。

表2 qRT- PCR所用引物Table 2 Primers used in qRT- PCR

1.2.5活細(xì)胞密度及細(xì)胞活率檢測(cè)

吸取20 μL細(xì)胞懸液，加入20 μL 1 g/L臺(tái)盼藍(lán)，混勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率。

1.2.6抗體產(chǎn)量及親和力檢測(cè)

用Biacore 8K生物分子相互作用分析系統(tǒng)(美國(guó)GE公司)分析細(xì)胞上清中anti- hLAG3抗體的產(chǎn)量，檢測(cè)芯片為Protein- A，緩沖液為pH 7.4的HBS- EP溶液，再生液為pH 2.0的Glycine溶液。

Anti- hLAG3與hLAG3間的親和力測(cè)定同樣采用Biacore 8K分析系統(tǒng)。使用Protein- A芯片在流速為10 μL/min的條件下，捕獲上清中的anti-hLAG3，并對(duì)anti-hLAG3與25.00、12.50、6.25、3.12、1.56、0.78 nmol/L和0 nmol/L濃度的hLAG3蛋白進(jìn)行動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，流速為30 μL/min，結(jié)合和解離時(shí)間分別為180 s和600 s。使用Biacore 8K Insight Evaluation Software軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的擬合分析，得到結(jié)合常數(shù)Ka和解離常數(shù)Kd。通過式(1)計(jì)算平衡解離常數(shù)KD。

KD=Kd/Ka

(1)

所有數(shù)據(jù)的測(cè)量均不少于3個(gè)平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 過表達(dá)蛋白合成與分泌相關(guān)蛋白對(duì)ExpiCHO- S細(xì)胞的抗體產(chǎn)量和轉(zhuǎn)染效率的影響

哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白合成和分泌能力能夠直接影響重組蛋白的產(chǎn)量。因此，通過過表達(dá)蛋白合成與分泌途徑中的關(guān)鍵蛋白有望提高細(xì)胞的重組蛋白產(chǎn)量。將參與蛋白合成與分泌的20種蛋白的基因與anti- hLAG3的抗體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入ExpiCHO- S細(xì)胞中，檢測(cè)轉(zhuǎn)染后72 h培養(yǎng)物上清中抗體產(chǎn)量的變化。僅轉(zhuǎn)染了pCAG- Hygro- IRES2- EGFP載體和anti- hLAG3輕重鏈的細(xì)胞上清中抗體的產(chǎn)量為24.21 μg/mL。為了更直觀地體現(xiàn)各蛋白對(duì)ExpiCHO- S細(xì)胞生產(chǎn)anti- hLAG3的影響，將轉(zhuǎn)染了各蛋白表達(dá)載體的細(xì)胞上清的抗體產(chǎn)量用相對(duì)產(chǎn)量(Cr)表示(式(2))。

Cr=Cm/24.21×100%

(2)

式中，Cm為實(shí)測(cè)產(chǎn)量(μg/mL)。

如圖2所示，相比于EGFP組，過表達(dá)XBP1s后能夠使細(xì)胞的抗體產(chǎn)量提高30.56%。而過表達(dá)GADD34、NFKBIz、CERT、C/EBPɑ和mTOR后能夠使抗體產(chǎn)量降低到87.18%～71.21%。其他14種蛋白對(duì)ExpiCHO- S細(xì)胞的抗體產(chǎn)量的影響則較小(抗體產(chǎn)量的變化率<10%)。分析這些蛋白的表達(dá)載體在ExpiCHO- S細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率發(fā)現(xiàn)，不同基因在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率差異較大，并且不同基因的轉(zhuǎn)染效率的差異與這些基因?qū)?xì)胞抗體產(chǎn)量影響的差異沒有明顯相關(guān)性。

圖2 過表達(dá)蛋白合成與分泌相關(guān)蛋白對(duì)ExpiCHO- S細(xì)胞的抗體相對(duì)產(chǎn)量和轉(zhuǎn)染效率的影響Fig.2 Effect of overexpression of proteins related to protein biosynthesis and secretion on relative antibody production and transfection efficiency of ExpiCHO- S cells

2.2 過表達(dá)XBP1s、ATF4和BiP對(duì)細(xì)胞活率和活細(xì)胞密度的影響

為了進(jìn)一步研究蛋白合成與分泌相關(guān)蛋白對(duì)ExpiCHO- S細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，選取對(duì)細(xì)胞抗體產(chǎn)量促進(jìn)作用較明顯的3種蛋白，即XBP1s、ATF4和BiP，研究其對(duì)ExpiCHO- S細(xì)胞的細(xì)胞活率和活細(xì)胞密度的影響。

圖3 過表達(dá)XBP1s、ATF4和BiP對(duì)細(xì)胞活率和活細(xì)胞密度的影響Fig.3 Effects of XBP1s, ATF4 and BiP overexpression on cell viability and viable cell density

如圖3(a)所示，在對(duì)照組(Null和EGFP組)中，轉(zhuǎn)染后24 h細(xì)胞活率有輕微降低，48 h左右時(shí)細(xì)胞活率恢復(fù)，隨后又開始降低，但在穩(wěn)定期后期細(xì)胞活率仍然維持在較高水平(>90%)。與對(duì)照組相比，過表達(dá)XBP1s和BiP對(duì)細(xì)胞活率的影響均較小，細(xì)胞培養(yǎng)至216 h時(shí)細(xì)胞活率仍大于90%；過表達(dá)ATF4在轉(zhuǎn)染后前192 h對(duì)細(xì)胞活率的影響也較小，但當(dāng)繼續(xù)培養(yǎng)到192 h時(shí)，細(xì)胞活率急劇降低至30.8%，比其他組細(xì)胞提前進(jìn)入衰亡期。

同樣考察了過表達(dá)上述蛋白后對(duì)ExpiCHO- S活細(xì)胞密度的影響，如圖3(b)所示，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后前48 h活細(xì)胞密度增長(zhǎng)迅速，隨后細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期，168 h后由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏細(xì)胞逐漸進(jìn)入衰亡期。與對(duì)照組相比，過表達(dá)XBP1s和BiP對(duì)活細(xì)胞密度的影響較小。而過表達(dá)ATF4雖然能夠輕微提高ExpiCHO- S細(xì)胞在指數(shù)期的活細(xì)胞密度(轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞密度由EGFP組的1.20×107個(gè)/mL提高到1.37×107個(gè)/mL)，但可能由于營(yíng)養(yǎng)消耗較快，轉(zhuǎn)染后192 h時(shí)活細(xì)胞密度即急劇降低，比對(duì)照組提前進(jìn)入衰亡期。Gulis等[11]在CHO細(xì)胞中過表達(dá)XBP1s，發(fā)現(xiàn)其在提高IgG產(chǎn)量的同時(shí)，會(huì)降低活細(xì)胞密度。Pybus等[12]在研究過表達(dá)BiP對(duì)4種難表達(dá)單克隆抗體的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)10% BiP在提高抗體表達(dá)量的同時(shí)，會(huì)輕微降低活細(xì)胞密度。而在本研究中，過表達(dá)XBP1s和BiP對(duì)ExpiCHO- S細(xì)胞的活細(xì)胞密度和細(xì)胞活率的影響均較??；過表達(dá)ATF4雖然在細(xì)胞培養(yǎng)前期能夠輕微提高活細(xì)胞密度，但會(huì)使細(xì)胞提前進(jìn)入衰亡期。表明ExpiCHO- S細(xì)胞受蛋白的影響會(huì)隨過表達(dá)蛋白種類的變化而不同。

2.3 過表達(dá)XBP1s、ATF4和BiP對(duì)轉(zhuǎn)染效率和抗體產(chǎn)量的影響

如圖4(a)所示，轉(zhuǎn)染后72 h，XBP1s、ATF4和BiP的表達(dá)載體在ExpiCHO- S細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率分別為26.9%、25.8%和38.2%。在168 h之前，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染效率逐漸降低。分析3種蛋白的過表達(dá)對(duì)抗體產(chǎn)量的影響發(fā)現(xiàn)(圖4(b))，XBP1s能夠明顯提高ExpiCHO- S細(xì)胞的抗體產(chǎn)量，相比于對(duì)照組(EGFP組)，使216 h時(shí)的抗體產(chǎn)量提高了27.4%。而在抗體生產(chǎn)的整個(gè)過程中，過表達(dá)ATF4和BiP對(duì)anti- hLAG3產(chǎn)量的影響均較小。

圖4 過表達(dá)XBP1s、ATF4和BiP對(duì)轉(zhuǎn)染效率和抗體產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of XBP1s, ATF4 and BiP overexpression on transfection efficiency and antibody production

XBP1s是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR中肌醇需求酶1(IRE1)/XBP1信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，能夠誘導(dǎo)分子伴侶和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白降解途徑中相關(guān)蛋白的表達(dá)。因此，XBP1s能夠通過協(xié)助未折疊蛋白進(jìn)行折疊并使未折疊蛋白降解而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力[6]。在現(xiàn)有文獻(xiàn)中，XBP1s對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌重組蛋白的影響的爭(zhēng)議較大。例如，Tigges等[13]研究了過表達(dá)人源XBP1s對(duì)CHO- K1細(xì)胞產(chǎn)分泌型堿性磷酸酶(SEAP)和分泌型α淀粉酶(SAMY)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XBP1s能夠使SEAP和SAMY的產(chǎn)量分別提高到6倍和4倍，其介導(dǎo)的產(chǎn)量增加與產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄水平無關(guān)，而是通過克服分泌系統(tǒng)的分泌瓶頸實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量的增加。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)XBP1s對(duì)人源細(xì)胞系，包括HEK- 293、HeLa和HT- 1080細(xì)胞的異源蛋白生產(chǎn)無影響，并且其只能增加分泌型蛋白的產(chǎn)量。而Ku等[3]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)鼠源XBP1s對(duì)穩(wěn)定表達(dá)單克隆抗體、干擾素γ和促紅細(xì)胞生成素的CHO細(xì)胞的重組蛋白表達(dá)均沒有顯著影響，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)重組蛋白的產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞分泌上限時(shí)，過表達(dá)XBP1s才能夠通過提高細(xì)胞分泌能力而提高蛋白產(chǎn)量；反之，蛋白產(chǎn)量則主要受轉(zhuǎn)錄及翻譯水平調(diào)控。而在本研究中，XBP1s能夠明顯提高ExpiCHO- S細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)anti- hLAG3的產(chǎn)量，表明XBP1s對(duì)重組蛋白產(chǎn)量的提高可能不受蛋白來源和分泌瓶頸的限制。

ATF4屬于轉(zhuǎn)錄激活因子/環(huán)狀A(yù)MP響應(yīng)元件結(jié)合蛋白(ATF/CREB)家族的堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，具有共有結(jié)合位點(diǎn)cAMP響應(yīng)元件[14]。ATF4由包括缺氧/低氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氨基酸剝奪和氧化應(yīng)激在內(nèi)的應(yīng)激信號(hào)誘導(dǎo)。ATF4可增強(qiáng)UPR靶基因子集，包括GADD34和C/EBP同源蛋白(CHOP)的表達(dá)。ATF4也被UPR翻譯上調(diào)。Ohya等[6]發(fā)現(xiàn)，在CHO細(xì)胞中過表達(dá)ATF4能夠使培養(yǎng)液中抗凝血酶III的產(chǎn)量提高66.7%。而在本研究中，ATF4對(duì)anti- hLAG3產(chǎn)量的影響較小，其原因還有待進(jìn)一步研究。

BiP，也稱為GRP78，是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白，能夠與許多不完全折疊和未組裝的蛋白結(jié)合。對(duì)于許多分泌或膜結(jié)合蛋白，其與BiP的結(jié)合是瞬時(shí)的；而對(duì)于折疊錯(cuò)誤、糖基化不當(dāng)或其他分泌不足的蛋白質(zhì)，其與BiP的結(jié)合可以更穩(wěn)定。Pybus等[12]發(fā)現(xiàn)，在CHO細(xì)胞中過表達(dá)BiP能夠提高難表達(dá)mAb的比生產(chǎn)速率，但同時(shí)也會(huì)降低細(xì)胞生長(zhǎng)速率。 Dorner等[15]則發(fā)現(xiàn)降低內(nèi)源性BiP的表達(dá)量能夠提高異源蛋白的分泌。在本研究中，BiP對(duì)ExpiCHO- S細(xì)胞抗體生產(chǎn)的影響則較小。

2.4 XBP1s共轉(zhuǎn)染比例對(duì)轉(zhuǎn)染效率、XBP1s轉(zhuǎn)錄水平和抗體產(chǎn)量的影響

通過調(diào)整瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過程中XBP1s表達(dá)質(zhì)粒和anti- hLAG3表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染比例，研究不同XBP1s共轉(zhuǎn)染比例(以XBP1s表達(dá)質(zhì)粒占總轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，下同)對(duì)ExpiCHO- S細(xì)胞表達(dá)重組抗體的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 XBP1s共轉(zhuǎn)染比例對(duì)轉(zhuǎn)染效率、XBP1s轉(zhuǎn)錄水平和抗體產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of XBP1s co-transfection ratio on transfection efficiency,XBP1s transcription level and antibody production

如圖5(a)所示，隨著轉(zhuǎn)染過程中XBP1s表達(dá)質(zhì)粒比例的增加，其在ExpiCHO- S細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率逐漸增加。并且在同一比例下，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，XBP1s的轉(zhuǎn)染效率降低。具體地，當(dāng)XBP1s的共轉(zhuǎn)染比例由10%提高到60%時(shí)，轉(zhuǎn)染后72 h時(shí)的轉(zhuǎn)染效率由13.85%提高到32.6%。通過qRT- PCR分析不同共轉(zhuǎn)染比例的XBP1s在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)(圖5(b))，當(dāng)XBP1s共轉(zhuǎn)染比例≥20%時(shí)，隨著共轉(zhuǎn)染比例的增加，其在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平也增加，并且相對(duì)于XBP1s共轉(zhuǎn)染比例為0%時(shí)，能夠使XBP1s轉(zhuǎn)錄水平提高到1.5～2.8倍。

測(cè)定不同共轉(zhuǎn)染比例的XBP1s對(duì)抗體產(chǎn)量的影響發(fā)現(xiàn)(圖5(c))，隨著XBP1s轉(zhuǎn)染比例的提高，相對(duì)于相同共轉(zhuǎn)染比例的EGFP，XBP1s對(duì)細(xì)胞抗體生產(chǎn)的促進(jìn)作用也逐漸增強(qiáng)。除10% XBP1s會(huì)輕微降低anti- hLAG3的抗體產(chǎn)量外，20%的XBP1s能夠使anti- hLAG3在168 h時(shí)的抗體產(chǎn)量提高39.6%，當(dāng)XBP1s的共轉(zhuǎn)染比例提高到60%時(shí)，在168 h時(shí)的抗體產(chǎn)量提高到2.1倍，由共轉(zhuǎn)染60%EGFP時(shí)的66.7 μg/mL提高到141.5 μg/mL。上述結(jié)果表明XBP1s在促進(jìn)CHO細(xì)胞重組抗體生產(chǎn)方面有很大潛力。

2.5 過表達(dá)XBP1s對(duì)anti- hLAG3親和力的影響

為進(jìn)一步研究過表達(dá)XBP1s對(duì)anti- hLAG3抗體質(zhì)量的影響，測(cè)定了XBP1s共轉(zhuǎn)染比例為60%時(shí)，anti- hLAG3對(duì)hLAG3的親和力變化。如表3所示，相比于對(duì)照藥Relatlimab，過表達(dá)XBP1s后anti- hLAG3對(duì)hLAG3的KD值變化較小(8.40×10-11vs. 9.99×10-11mol/L)，表明過表達(dá)XBP1s對(duì)anti- hLAG3的親和力基本無影響。

表3 過表達(dá)XBP1s對(duì)anti- hLAG3與hLAG3的親和力的影響Table 3 Effect of XBP1s overexpression on theaffinity of anti- hLAG3 to hLAG3

3 結(jié)論

(1)對(duì)比研究了過表達(dá)20種參與調(diào)控蛋白合成與分泌途徑的蛋白對(duì)ExpiCHO- S細(xì)胞表達(dá)抗體anti- hLAG3產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)XBP1s能夠明顯提高抗體產(chǎn)量。

(2)提高XBP1s的共轉(zhuǎn)染比例能夠增強(qiáng)其對(duì)anti- hLAG3表達(dá)的促進(jìn)作用，當(dāng)XBP1s的共轉(zhuǎn)染比例提高到60%時(shí)，相對(duì)于相同共轉(zhuǎn)染比例的EGFP，168 h時(shí)的抗體產(chǎn)量可以提高到2.1倍。

(3)XBP1s的過表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及抗體的親和力影響均較小。通過構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)XBP1s的細(xì)胞株有望進(jìn)一步提高該蛋白對(duì)抗體產(chǎn)量的促進(jìn)作用。總的來說，XBP1s有望用于提高CHO細(xì)胞的重組蛋白生產(chǎn)力。