牛思 樊宏偉 倪猛

(南陽市中心醫(yī)院消化內(nèi)科一病區(qū)，河南 南陽 473000)

胰腺癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤〔1〕，具有高發(fā)病率和致死率的特點。據(jù)統(tǒng)計，胰腺癌患者的預(yù)后是所有人類癌癥中最差的，致死率與發(fā)病率的比值約為0.992〔2〕，5年存活率僅為8%〔3〕。據(jù)推測，在歐美等國家胰腺癌將在2030年上升至導(dǎo)致人類死亡率增加的第二大腫瘤〔2〕。胰腺癌在我國發(fā)病率和致死率呈逐年上升趨勢〔4〕。放射是目前有效治療胰腺癌的方法之一，可提高胰腺癌患者的轉(zhuǎn)移率、生存率，然而放療抵抗是導(dǎo)致胰腺癌臨床治療失敗的主要原因〔5〕，如何提高胰腺癌患者的放射敏感性是目前臨床治療的主要瓶頸。微小RNA(miRNA)是一種高度保守型的非編碼小RNA，在細(xì)胞的生長、分化、凋亡、自噬等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用〔6，7〕。miRNA在腫瘤中的異常表達與腫瘤的產(chǎn)生相關(guān)，通過發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-206(miR-206)在胰腺癌中表達量異常，且可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲及淋巴管生成等參與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展〔8〕。但目前關(guān)于miR-206對胰腺癌細(xì)胞放射敏感性的相關(guān)研究較少，本研究旨在探討miR-206對胰腺癌細(xì)胞放療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 胰腺癌細(xì)胞系(AsPC-1、Capan-2、PL45、PANC-1)購自中科院上海細(xì)胞所；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶購自美國HyClone公司；Lipofectamine 2000、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司；青霉素、鏈霉素、甲醇、Trizol試劑購自美國Sigma公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物公司；序列相似性家族83成員(FAM83)A野生型(FAM83A-WT)及FAM83A突變型(FAM83A-MUT)雙熒光素酶報告基因、pcDNA-FAM83A、miR-206 mimics、anti-miR-206及相應(yīng)的陰性對照均購自上海吉瑪生物有限公司；兔抗細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1抗體、鼠抗FAM83A抗體、羊抗二抗購自美國Abcam公司，鼠抗β-catenin抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀購自美國Thermo公司；7500熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)儀購自美國ABI公司。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng)和分組 胰腺癌細(xì)胞系(AsPC-1、Capan-2、PL45、PANC-1)培養(yǎng)于含有10%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，置于相對濕度為95%、CO2濃度為5%的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞密度至70%～80%時加入0.25%胰酶消化處理，1∶4進行傳代。選取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進行培養(yǎng)，隨機分為miR-NC組(轉(zhuǎn)染陰性對照NC質(zhì)粒)、miR-206組(轉(zhuǎn)染miR-206 mimics從而過表達miR-206)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染陰性對照anti-NC質(zhì)粒)、anti-miR-206組(轉(zhuǎn)染anti-miR-206從而敲低miR-206)、miR-206+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-206 mimics和陰性對照pcDNA)、miR-206+FAM83A組(共轉(zhuǎn)染miR-206 mimics和過表達FAM83A質(zhì)粒pcDNA FAM83A)。

1.3qPCR實驗 使用Trizol提取細(xì)胞中總RNA，通過cDNA合成試劑盒將RNA樣本轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算miR-206/FAM83A mRNA的相對表達水平。其中，miR-206的上游引物為5′-CAGATCCGATTGGAATGTAAGG-3′，下游引物為5′-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTC-3′；FAM83A的上游引物為5′-CCCATCTCAGTCACTGGCATT-3′，下游引物為5′-CCGCCAACATCTCCT TGTTC-3′；GAPDH上游引物為5′-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3′，下游引物為5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3′。

1.4細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 選取狀態(tài)良好的PANC-1細(xì)胞，制備細(xì)胞單懸液，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/ml，吸取100 μl細(xì)胞懸液至12孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)基更換為Opti-MEM溶液，準(zhǔn)備A液(miR-206 mimics/anti-miR-206、pcDNA FAM83A與50 μl Opti-MEM溶液混勻)；準(zhǔn)備B液(2 μl Lipofectamine 2000與50 μl Opti-MEM溶液混勻)；A液和B液混勻后加入每孔PANC-1細(xì)胞中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h，培養(yǎng)基更換為DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5細(xì)胞克隆實驗 接種生長狀態(tài)良好PANC-1細(xì)胞至6孔板中，37℃過夜培養(yǎng)，待其貼壁后使用2 Gy強度的X射線進行照射，源靶距100 cm，照射野為10 cm×10 cm，劑量為2 Gy，劑量率為2.59 cGy/h，射野覆蓋全細(xì)胞培養(yǎng)板;加入3 ml培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。待細(xì)胞生長出肉眼可見克隆，終止培養(yǎng)，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，加入甲醇溶液固定20 min，晾干，使用0.1%結(jié)晶紫染色40 min，自來水洗去染色液，晾干，顯微鏡觀察計數(shù)。

1.6流式細(xì)胞術(shù)實驗 收集放療后的各組細(xì)胞，預(yù)冷PBS沖洗3次，取大約5×105個細(xì)胞用于凋亡檢測，加入500 μl結(jié)合緩沖液、5 μl 膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)、5 μl 碘化丙啶(PI)混勻，室溫條件下避光孵育15～20 min，使用流式細(xì)胞儀檢測凋亡情況。

1.7雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?使用Targetscan預(yù)測miR-206和FAM83A靶向結(jié)合位點；設(shè)計并合成野生型FAM83A-WT-3′UTR和突變型XIAP-MUT-3′UTR片段，將其插入熒光報告質(zhì)粒下游；將PANC-1細(xì)胞接種至24孔板中，待細(xì)胞密度約80%，與miR-206mimics、anti-miR-206或NC質(zhì)粒進行共轉(zhuǎn)染，孵育24 h，加入適量細(xì)胞裂解液，振蕩20 min，加入底物，檢測熒光素酶的活性，驗證miR-206和FAM83A的靶向關(guān)系。

1.8Western印跡 取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的PANC-1細(xì)胞系，加入RIAP裂解液，冰上裂解30 min，離心，收集上清，使用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白含量，10%濃度的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后將目的條帶轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%的牛奶溶液封閉2 h，TBST洗膜3次，加入FAM83A(1∶1 000)、β-catenin(1∶200)、CyclinD1(1∶500)、GAPDH一抗(1∶1 000)過夜孵育，TBST清洗3次，加入二抗(1∶2 000)孵育2 h，TBST清洗3次。晾干，加入電化學(xué)(ECL)發(fā)光液于暗室曝光、顯影，Image J軟件檢測目的蛋白灰度值。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-206在胰腺癌細(xì)胞系中的表達量 與人正常胰腺上皮細(xì)胞(HPNE)miR-206水平(1.00±0.05)相比，miR-206在胰腺癌AsPC-1、Capan-2、PL45、PANC-1細(xì)胞系中的表達量〔(0.79±0.06)、(0.70±0.06)、(0.56±0.04)、(0.37±0.03)〕均顯著降低(P<0.05)，其中miR-206在胰腺癌PANC-1細(xì)胞表達量最低，因此選取PANC-1細(xì)胞作為后續(xù)實驗對象。

2.2過表達miR-206對胰腺癌細(xì)胞放療敏感性的影響 miR-206組細(xì)胞中miR-206表達量顯著高于miR-NC組(P<0.05)；miR-206組凋亡率顯著高于miR-NC組(P<0.05)，增加胰腺癌細(xì)胞放療敏感性。見圖1，表1、表2。

圖1 過表達miR-206對PANC-1細(xì)胞存活率、凋亡的影響

表1 過表達miR-206對PANC-1細(xì)胞凋亡的影響

表2 單擊多靶模型的參數(shù)值

2.3miR-206與FAM83A靶向關(guān)系的驗證 經(jīng)在線軟件Targetscan預(yù)測結(jié)果見圖2，miR-206和FAM83A 3′UTR區(qū)域具有較強的結(jié)合能力，推測FAM83A可能是miR-206的靶基因之一。雙熒光素酶報告基因進一步檢測結(jié)果見表3，當(dāng)過表達miR-206時，共轉(zhuǎn)染野生型FAM83A雙熒光素酶報告載體的細(xì)胞相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，但共轉(zhuǎn)染突變型FAM83A雙熒光素酶報告載體的細(xì)胞相對熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)；敲低miR-206表達量時，共轉(zhuǎn)染野生型FAM83A雙熒光素酶報告載體的細(xì)胞相對熒光素酶活性顯著提高(P<0.05)，但共轉(zhuǎn)染突變型FAM83A雙熒光素酶報告載體的細(xì)胞相對熒光素酶活性仍無顯著變化(P>0.05)。

圖2 miR-206和FAM83A靶向關(guān)系的驗證

表3 雙熒光素酶報告實驗

2.4miR-206調(diào)控FAM83A的表達量 與HPNE細(xì)胞相比，F(xiàn)AM83A在胰腺癌多種細(xì)胞系中表達量顯著增加(P<0.05)，見表4、圖3A；miR-206組FAM83A蛋白(0.38±0.04)顯著低于miR-NC組(1.00±0.09，P<0.05)；anti-miR-206組FAM83A蛋白(2.31±0.16)顯著高于anti-miR-NC組(1.01±0.08，P<0.05)。見圖3B。

表4 FAM83A在胰腺癌細(xì)胞系中的表達

A:1～5:HPNE組,AsPC-1組,Capan-2組,PL45組,PANC-1組;B:1～4:miR-NC組,miR-206組,anti-miR-NC組,anti-miR-206組圖3 miR-206調(diào)控FAM83A的表達量

2.5共轉(zhuǎn)染過表達miR-206和FAM83A對胰腺癌細(xì)胞放療敏感性的影響 與miR-206+pcDNA組相比，共轉(zhuǎn)染過表達miR-206和FAM83A顯著增加FAM83A蛋白的表達量，miR-206+FAM83A組凋亡率顯著低于miR-206+pcDNA組(P<0.05)。降低胰腺癌細(xì)胞放療敏感性。見圖4，表5，表6。

1～2：miR-206+pcDNA組,miR-206+FAM83A組

圖4 共轉(zhuǎn)染過表達miR-206和FAM83A對胰腺癌細(xì)胞放療敏感性的影響

表5 共轉(zhuǎn)染過表達miR-206和FAM83A對胰腺癌的影響

表6 單擊多靶模型的參數(shù)值

2.6共轉(zhuǎn)染過表達miR-206和FAM83A對Wnt/β-catenin通路的影響 與miR-NC組相比，過表達miR-206顯著降低β-catenin蛋白及CyclinD1蛋白的表達量(P<0.05)；與miR-206+pcDNA組相比，共轉(zhuǎn)染過表達miR-206和FAM83A顯著增加β-catenin 以及CyclinD1蛋白的表達量(均P<0.05)。見圖5，表7。

1～4：miR-NC組，miR-206組，miR-206+pcDNA組，miR-206+FAM83A組圖5 共轉(zhuǎn)染過表達miR-206和FAM83A對Wnt/β-catenin通路的影響

表7 共轉(zhuǎn)染過表達miR-206和FAM83A對Wnt/β-catenin通路的影響

3 討 論

miRNAs是一種具有高度特異性、保守性的非編碼RNA，通過與下游蛋白編碼基因結(jié)合，阻礙其翻譯或降解靶mRNA，從而抑制靶蛋白的表達量〔9〕。研究表明，miRNAs在多種腫瘤中表達量異常，并與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為相關(guān)，其中包括放射抵抗〔10〕。miR-206被報道在乳腺癌組織中表達量顯著降低〔11〕，可通過靶向調(diào)控VEGF的表達量阻礙喉癌細(xì)胞侵襲、遷移能力〔12〕，是一種橫紋肌肉瘤的潛在分子標(biāo)志物〔13〕。Keklikoglou等〔8〕發(fā)現(xiàn)，miR-206在胰腺癌中參與細(xì)胞增殖、侵襲及淋巴管生成過程。結(jié)果提示過表達miR-206增加PANC-1細(xì)胞的放療敏感性。在腫瘤中，miR-206對腫瘤細(xì)胞的放療敏感性的相關(guān)研究已有報道，如miR-206可增強膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放療敏感性，其主要通過靶向絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)1從而抑制MAPK信號通路發(fā)揮作用〔14〕。在鼻咽癌中，miR-206通過靶向類胰島素生長因子(IGF)1增強鼻咽癌細(xì)胞的放療敏感性〔15〕。上述研究結(jié)果均表明，miR-206可增強腫瘤細(xì)胞的放療敏感性，與本實驗結(jié)果一致，表明miR-206可作為提高腫瘤放療敏感性的潛在分子靶位點，提高患者的預(yù)后。

FAM83A又叫BJ-TSA-9，位于染色體8q24。據(jù)報道，F(xiàn)AM83A在乳腺癌〔16〕、胰腺癌〔17〕等癌組織中表達量均顯著上調(diào)，而在正常組織中幾乎不表達，表明FAM83A在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。在胰腺癌中，沉默F(xiàn)AM83A基因降低胰腺癌細(xì)胞成球數(shù)，誘導(dǎo)其凋亡，增強胰腺癌細(xì)胞的放療敏感性，表明FAM83A是一種潛在的放療抵抗的靶位點〔18〕。本研究表明miR-206與FAM83A表達量呈負(fù)反饋調(diào)節(jié)；miR-206可通過抑制FAM83A增強胰腺癌放療敏感性。

Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、放療敏感性等調(diào)控過程中具有重要的作用〔19〕。CyclinD1是Wnt/β-catenin信號通路的下游靶蛋白，影響細(xì)胞增殖周期。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中β-catenin積累量增多時，增強細(xì)胞膜的通透性，促進β-catenin進入細(xì)胞核，提高靶基因CyclinD1水平，誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔20〕。本研究結(jié)果表明miR-206靶向抑制FAM83A從而影響Wnt/β-catenin信號通路的活性，增強胰腺癌細(xì)胞的放療敏感性，進一步提示miR-206可作為胰腺癌放射治療的潛在靶點。