戴麗荷，褚曉紅，路伏增，黃孫平，徐如海

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江省畜禽遺傳育種工程技術(shù)研究中心，杭州 310021)

靶向豬ATGL基因的miRNA預(yù)測(cè)及鑒定

戴麗荷，褚曉紅，路伏增，黃孫平，徐如海*

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江省畜禽遺傳育種工程技術(shù)研究中心，杭州 310021)

本試驗(yàn)旨在初步篩選出調(diào)控豬脂肪甘油三酯脂肪酶基因(ATGL)的miRNA。利用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)10條靶向ATGL基因的豬miRNAs，然后通過(guò)裝載含豬ATGL基因3′UTR序列來(lái)構(gòu)建pMIR-Luc報(bào)告基因載體，以及通過(guò)裝載含反向miRNA種子區(qū)對(duì)應(yīng)的3′UTR序列來(lái)構(gòu)建3個(gè)突變載體作為陰性對(duì)照，以pRL-TK載體作為內(nèi)參，與候選miRNA模擬物共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，最終利用雙熒光素酶報(bào)告基因法來(lái)檢測(cè)熒光素酶活性。試驗(yàn)成功構(gòu)建了含豬ATGL基因3′UTR序列的重組載體pMIR-ATGL-3′UTR，雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)顯示ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149能下調(diào)293T細(xì)胞中pMIR-ATGL-3′UTR的熒光素酶活性，而點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)證實(shí)了ssc-miR-1343與ssc-miR-7137-3p能通過(guò)與豬ATGL基因3′UTR上預(yù)測(cè)的種子區(qū)結(jié)合下調(diào)熒光素酶活性。結(jié)果表明，sc-miR-1343與ssc-miR-7137-3p通過(guò)靶向結(jié)合3′UTR對(duì)豬ATGL基因有下調(diào)作用。

豬；ATGL基因；miRNA；雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)；3′UTR

脂肪甘油三酯脂肪酶(Adipose triglyceride lipase，ATGL)是2004年由3個(gè)不同的研究小組在人和小鼠中幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種新的脂肪分解酶，官方命名為PNPLA2，又名為TTS-2.2(iPLA2ζ)，desnutrin和PEDF-R等[1-3]。當(dāng)機(jī)體需要能量時(shí)，在脂肪分解酶的作用下，甘油三酯被逐級(jí)分解，最終以甘油和游離脂肪酸的形式進(jìn)入血液，完成脂動(dòng)員過(guò)程[4]。ATGL的作用發(fā)生在脂肪動(dòng)用時(shí)水解甘油三酯的第一步，為激素敏感脂肪酶(Hormone sensitive lipase，HSL)提供甘油二酯底物，是脂肪組織和其他組織中甘油三酯水解的起始步驟的限速酶[5-6]。ATGL與HSL協(xié)調(diào)作用，才能使哺乳動(dòng)物脂肪組織中貯存的甘油三酯發(fā)生脂解。

microRNA(miRNA)是一類約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的單鏈非編碼RNA，它通過(guò)靶向結(jié)合靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)(3′untranslated region，3′UTR)的特定位點(diǎn)從而抑制該轉(zhuǎn)錄本的翻譯，最終調(diào)節(jié)特定的生理功能[7-8]。miRNA是基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)者，是揭示性狀形成分子機(jī)制的一個(gè)新靶點(diǎn)。

ATGL是啟動(dòng)脂肪動(dòng)員的一個(gè)關(guān)鍵脂肪分解酶，其表達(dá)或活性上的輕微變異均有可能影響豬背膘厚和瘦肉率，研究ATGL基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控對(duì)深入研究該基因的表達(dá)調(diào)控尤為重要。而有關(guān)豬ATGL基因相關(guān)的miRNA研究，目前還未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)分析，反向預(yù)測(cè)ATGL基因靶向的豬miRNA，并通過(guò)構(gòu)建含ATGL基因3′UTR的雙熒光素酶報(bào)告載體，利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)和點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)篩選出負(fù)性調(diào)控ATGL基因表達(dá)的miRNA，為ATGL在脂肪代謝中的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與載體

人胚腎上皮細(xì)胞系HEK 293T細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存；pMIR-REPORTTMLuciferase載體購(gòu)自Ambion；pRL-TK質(zhì)粒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(Dual-luciferase Reporter Assay System)和pGEM-T載體購(gòu)自Promega；凝膠回收及質(zhì)粒抽提試劑盒均購(gòu)自Axygen；Platinum Taq DNA Polymerase 和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen；T4 DNA連接酶、DNA marker、限制性內(nèi)切酶SpeI和Hind III購(gòu)自Fermentas；各種引物、ssc-miRNA mimics及陰性對(duì)照由Invitrogen公司合成。

1.2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與豬ATGL基因3′UTR作用的miRNA

根據(jù)miRBase(http://www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)公布的豬miRNA(Release 21，2014)，結(jié)合MiRanda(http://www.microrna.org/)、RNAhybrid(http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/submission.html)、RNA22(http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html)和MicroInspector(http://bioinfo.uni-plovdiv.bg/microinspector/)等軟件，預(yù)測(cè)在ATGL基因3′UTR存在潛在標(biāo)靶關(guān)系的豬源miRNA，選出可能性最大的10條miRNAs作為候選miRNA進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 報(bào)告基因載體構(gòu)建

根據(jù)NCBI豬ATGL基因序列(EF648448)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序驗(yàn)證后，合成豬ATGL基因3′UTR序列，加上SpeI/Hind III酶切位點(diǎn)，克隆至pMIR-LUC載體中，命名為pMIR-ATGL-3′UTR(野生型，簡(jiǎn)寫為WT)。

靶基因雙熒光素酶突變載體的構(gòu)建主要是通過(guò)PCR的方法替換掉靶基因上的各miRNA結(jié)合位點(diǎn)。以pMIR-ATGL-3′UTR載體為模板，根據(jù)種子區(qū)設(shè)計(jì)突變引物(表1)，分別與ATGL基因3′UTR引物擴(kuò)增得到靶基因3′UTR序列結(jié)合位點(diǎn)上下游片段，以上下游片段混合物作為模板，PCR擴(kuò)增無(wú)結(jié)合位點(diǎn)的靶基因3′UTR突變序列，然后通過(guò)連接pGEM-T載體測(cè)序驗(yàn)證，最后克隆至pMIR-LUC載體上，構(gòu)建ATGL靶位點(diǎn)突變報(bào)告載體pMIR-ATGL-MT1(簡(jiǎn)寫為MT1)、pMIR-ATGL-MT2(MT2)和pMIR-ATGL-MT3(MT3)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與雙熒光素酶檢測(cè)

293T 細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)和傳代。細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染按照l(shuí)ipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染操作說(shuō)明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前1 d接種6 孔板，每孔細(xì)胞量約5×105個(gè)，培養(yǎng)過(guò)夜后對(duì)每孔細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染9組質(zhì)粒，并設(shè)空白對(duì)照，具體試驗(yàn)分組：(1)無(wú)miRNA無(wú)轉(zhuǎn)染試劑的空白對(duì)照；(2)mimic Negative Control、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(3)ssc-miR-769-3p mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(4)ssc-miR-1343 mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(5)ssc-miR-7137-3p mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(6)ssc-miR-671-5p mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(7)ssc-miR-339-5p mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(8)ssc-miR-149 mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(9)ssc-miR-1249 mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(10)ssc-miR-1296-5p mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK。將轉(zhuǎn)染完成后細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液棄去，按照雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶活性，計(jì)算每個(gè)轉(zhuǎn)染3個(gè)平行樣的相對(duì)發(fā)光比率 (Relative light unit，RLU)，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。根據(jù)得到的比值來(lái)比較不同樣品間報(bào)告基因的激活程度。

表1 構(gòu)建含豬ATGL基因3′UTR突變序列的熒光素酶載體所用的突變引物

Table 1 Primers for constructing luciferase reporter gene vectors containing porcineATGLmutational 3′UTR area

引物Primer突變引物序列(5′→3′)Primersequence對(duì)應(yīng)miRNACorrespondingmiRNAMT1?RMT1?FACTGGGGGGCCCGGCCCTCAGCACACCCTGGGCAGGGCCCTGGAGAAGGCTGCTTCTCCAGGGCCCTGCCCAGGGTGTGCTGAGGGCCGGGCCCCCCAGTCssc?miR?769?3pMT2?RMT2?FGTCTCACCCCACCTCACCGGGCGGGGAGATCCCCGCCCGGTGAGGTGGGGTGAGACCCCCCCCCTCCCTssc?miR?7137?3p和ssc?miR?1343MT3?RMT3?FCAGGTGCCGCAGCCCCCGGGGCCGTCGGGGGGAAGGGGAGATGAAGCATCTCCCCTTCCCCCCGACGGCCCCGGGGGCTGCGGCACCTGCssc?miR?671?5p

下劃線和方框部分表示針對(duì)預(yù)測(cè)的不同miRNA的種子區(qū)進(jìn)行堿基互補(bǔ)突變后的堿基序列

Underlines and boxes indicate mutant nucleotides in primers by complementing seed sequences for different miRNA

同樣的方法對(duì)點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)分組：(1)無(wú)miRNA無(wú)轉(zhuǎn)染試劑的空白對(duì)照；(2)mimic Negative Control、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(3)ssc-miR-769-3p mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(4)ssc-miR-769-3p mimic、pMIR-ATGL-MT1和pRL-TK；(5)ssc-miR-1343 mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(6)ssc-miR-1343 mimic、pMIR-ATGL-MT2和pRL-TK；(7)ssc-miR-7137-3p mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(8)ssc-miR-7137-3p mimic、pMIR-ATGL-MT2和pRL-TK；(9)ssc-miR-671-5p mimic、pMIR-ATGL-3′UTR和pRL-TK；(10)ssc-miR-671-5p mimic、pMIR-ATGL-MT3和pRL-TK。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)”表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法采用SAS8.0的t檢驗(yàn)和GLM方差分析，P<0.05有顯著性差異，P<0.01有極顯著差異。為消除試驗(yàn)誤差，每個(gè)表達(dá)載體分別做3次獨(dú)立轉(zhuǎn)染，每次轉(zhuǎn)染做2個(gè)復(fù)孔，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)豬ATGL基因靶向miRNAs

本研究利用生物信息學(xué)反向預(yù)測(cè)了豬ATGL基因靶向的miRNAs。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果按照自由能最小排序，排在前10的有ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-339-5p、ssc-miR-4334-3p、ssc-miR-339、ssc-miR-149、ssc-miR-1249、ssc-miR-1296-5p，均與ATGL基因3′UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)(表2)，但由于ssc-miR-339-5p、ssc-miR-4334-3p和ssc-miR-339在豬ATGL基因3′UTR上的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)相同，所以這3條miRNAs中挑選ssc-miR-339-5p作為代表。因此，選取ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-339-5p、ssc-miR-149、ssc-miR-1249和ssc-miR-1296-5p這8個(gè)miRNAs作為調(diào)控豬ATGL基因的候選miRNA進(jìn)行下一步篩選。

表2 與豬ATGL基因3′UTR有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的可能miRNAs

Table 2 Potential miRNAs targeting 3′UTR of porcineATGLgene

miRNA自由能EnergymiRNA堿基位置miRNA＿starttoend豬ATGL基因3′UTR堿基位置3′UTR＿starttoendmiRNA比對(duì)序列miRNA＿alignssc?miR?769?3p-39．742～2220～413′uuGGUUCUGGGGUCUCUAGGGUcssc?miR?1343-37．982～2176～953′cgCUCUCACGCCCGGGGUCCUcssc?miR?7137?3p-30．222～1979～1003′gggcCCUUGAGGGUCUGGUCGassc?miR?671?5p-30．22～18276～2993′ggaggucGGGGAGGUCCCGAAGGassc?miR?339?5p?-29．612～19201～2253′cacuCGA?G?GAC?CUCCUGUCCCussc?miR?4334?3p?-29．612～19203～2253′cuCGA?G?GAC?CUCCUGUCCssc?miR?339?-29．612～19202～2253′acuCGA?G?GAC?CUCCUGUCCCussc?miR?149-28．732～2177～993′cccUCACUUCUGUGCCUCGGUCussc?miR?1249-27．82～15207～2283′acuucuucCCCCCCUUCCCGCassc?miR?1296?5p-26．522～1312～333′ccucuaccucGGUCCCGGGAUumiRNA比對(duì)模式Alignment基因比對(duì)序列Gene＿alignssc?miR?769?3p|||∶|∶|||∶|∶|∶|||||5′ctCCAGGGCCCT?GGGGTCCCAgssc?miR?1343|||||||||||||∶||∶5′gtGAG?GTG?GGGCCCCGGGGcssc?miR?7137?3p||∶∶|||∶|∶|||||5′aggtGGGGCCCCGGGGCCAGCtssc?miR?671?5p|||∶||||||||||5′tcatctcCCCTTCCCGGGCTGCCcssc?miR?339?5p?||||||||∶||∶|||||5′acttGCTGCACTGAGGGGGCAGGGgssc?miR?4334?3p?||||||||∶||∶|||||5′ttGCTGCACTGAGGGGGCAGGGgssc?miR?339?||||||||∶||∶|||||5′cttGCTGCACTGAGGGGGCAGGGgssc?miR?149∶|||∶∶|||||∶|||||5′tgaGGTGGGGCCCCGGGGCCAGcssc?miR?1249||||||∶|||||5′tgcactgaGGGGGCAGGGGCGtssc?miR?1296?5p||||||||||∶5′ccagccttctCCAGGGCCCTGg

*.ssc-miR-339-5p、ssc-miR-4334-3p、ssc-miR-339預(yù)測(cè)與豬ATGL基因3′UTR有相同的互補(bǔ)結(jié)合模式，因此選取ssc-miR-339-5p為代表

*.ssc-miR-339-5p，ssc-miR-4334-3p and ssc-miR-339 had the same seed sequences binding to 3′UTR of porcineATGLgene，so ssc-miR-339-5p was chosen randomly for next research

2.2 豬ATGL基因3′UTR雙熒光素酶靶標(biāo)載體與突變載體的構(gòu)建

經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，構(gòu)建含有豬ATGL基因3′UTR序列的pMIR-ATGL-3′UTR載體，利用SpeI和Hind III進(jìn)行雙酶切鑒定得到451 bp的3′UTR片段及6.4 kb的pMIR-report骨架載體。同樣的方法驗(yàn)證構(gòu)建好的ATGL基因3′UTR雙熒光素酶靶標(biāo)突變載體(圖1)。

2.3 miRNA對(duì)豬ATGL基因3′UTR的調(diào)控

重組載體pMIR-ATGL-3′UTR分別與8種ssc-miRNA mimics轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系，同時(shí)設(shè)置無(wú)任何同源關(guān)系的miRNA作為陰性對(duì)照(NC)，36 h后用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)配對(duì)資料t檢驗(yàn)，ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149對(duì)豬ATGL基因3′UTR抑制效果差異顯著，其中ssc-miR-1343+pMIR-ATGL-3′UTR共轉(zhuǎn)染組的相對(duì)熒光素酶活性較NC+pMIR-ATGL-3′UTR共轉(zhuǎn)染組降低了48.8%(P<0.01)，ssc-miR-7137-3p共轉(zhuǎn)染組降低了42.3%(P<0.01)，ssc-miR-671-5p組降低了32.8%(P<0.01)，ssc-miR-769-3p降低了19.4%(P<0.01)，ssc-miR-149組降低了9.4%(P<0.05)；而pMIR-ATGL-3′UTR 分別與ssc-miR-339-5p、ssc-miR-1249和ssc-miR-1296-5p共轉(zhuǎn)染時(shí)，其熒光比率較對(duì)照組沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，說(shuō)明這3種miRNAs對(duì)ATGL基因3′UTR無(wú)抑制作用。從最開(kāi)始預(yù)測(cè)的10種miRNAs中，初步篩選出5種miRNAs(ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149)可通過(guò)ATGL3′UTR靶位點(diǎn)降低pMIR-ATGL-3′UTR的表達(dá)。

M．DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.pMIR-ATGL-3′UTR載體；2.pMIR-ATGL-MT1載體；3.pMIR-ATGL-MT2載體；4.pMIR-ATGL-MT3載體 M.DNA marker；1.pMIR-ATGL-3′UTR vector；2.pMIR-ATGL-MT1 vector；3.pMIR-ATGL-MT2 vector；4.pMIR-ATGL-MT3 vector圖1 雙酶切鑒定pMIR-ATGL-3′UTR驗(yàn)證載體和突變載體Fig.1 Dual digestion of pMIR-ATGL-3′UTR vector and mutation vectors

*表示與mimic NC共轉(zhuǎn)染組比較差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)；所有轉(zhuǎn)染組以海腎熒光素酶報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染內(nèi)參照*.P<0.05；**.P<0.01；Renilla luciferase reporter vector was used as an internal control in all transfections圖2 不同miRNA mimics分別與pMIR-ATGL-3′UTR共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性Fig.2 Relative luciferase activity of pMIR-ATGL-3′UTR reporter cotransfected with various miRNA mimics in 293T celles

為了進(jìn)一步驗(yàn)證各miRNAs與ATGL3′UTR結(jié)合的靶位點(diǎn)，本試驗(yàn)選取了抑制作用較明顯的ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p和ssc-miR-671-5p，并針對(duì)不同miRNAs對(duì)預(yù)測(cè)種子區(qū)分別進(jìn)行了反義突變(表2)。Ssc-miR-1343與ssc-miR-7137-3p的靶位點(diǎn)結(jié)合序列鄰近，設(shè)計(jì)構(gòu)建同一個(gè)3′UTR突變體命名為pMIR-ATGL-mut2(MT2)，而ssc-miR-769-3p和ssc-miR-671-5p對(duì)應(yīng)的突變體分別命名為pMIR-ATGL-mut1(MT1)和pMIR-ATGL-mut3(MT3)。

不同ssc-miRNA與pMIR-ATGL-3′UTR(WT)或pMIR-ATGL-mut(MT)共轉(zhuǎn)染的雙熒光素酶活性差異比較見(jiàn)圖3和表3。與轉(zhuǎn)染NC的對(duì)照組相比，4種ssc-miRNAs都能顯著或極顯著地下調(diào)pMIR-ATGL-3′UTR的相對(duì)熒光素酶活性，驗(yàn)證了4種miRNA都能靶向結(jié)合于豬ATGL基因3′UTR，并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，但對(duì)預(yù)測(cè)的種子區(qū)分別進(jìn)行突變后的回復(fù)效果卻不一樣。當(dāng)ssc-miR-769-3p與WT共轉(zhuǎn)染時(shí)，其相對(duì)熒光素酶活性比轉(zhuǎn)染NC+WT的對(duì)照組下降了41.6%，差異極顯著(P<0.01)，與MT1共轉(zhuǎn)染時(shí)，又回復(fù)了49.5%(P<0.05)，但與NC組仍存有顯著差異(P<0.01)，說(shuō)明預(yù)測(cè)的種子區(qū)影響到了ssc-769-3p與3′UTR的結(jié)合，并對(duì)ATGL3′UTR產(chǎn)生了一定的下調(diào)效果，但效果并不是很明顯；ssc-miR-1343與WT共轉(zhuǎn)染時(shí)，其相對(duì)熒光素酶活性下降了36.3%(P<0.01)，與MT2共轉(zhuǎn)染時(shí)，又回復(fù)了87.8%(P<0.01)，與NC組差異不顯著(P>0.05)；ssc-miR-7137-3p與WT共轉(zhuǎn)染時(shí)其相對(duì)熒光素酶活性下降了23.3%(P<0.01)，與MT2共轉(zhuǎn)染時(shí)，又回復(fù)了116.4%(P<0.01)，與NC組相當(dāng)(P>0.05)；ssc-miR-671-5p與WT共轉(zhuǎn)染時(shí)，其相對(duì)熒光素酶活性下降36.9%(P<0.01)，而共轉(zhuǎn)染MT3時(shí)，相對(duì)熒光素酶活性卻沒(méi)有回復(fù)，與WT共轉(zhuǎn)染組沒(méi)有差異(P>0.05)，說(shuō)明突變并沒(méi)有影響ssc-miR-671-5p與ATGL3′UTR其他位置的結(jié)合，且結(jié)合位點(diǎn)并非預(yù)測(cè)的種子區(qū)域。結(jié)果說(shuō)明，ssc-miR-1343和ssc-miR-7137-3p能通過(guò)預(yù)測(cè)的“種子區(qū)”靶向結(jié)合于豬ATGL基因3′UTR，并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。

A、B、C.不同大寫字母表示差異極顯著，P<0.01。mimic NC.miRNA模擬物陰性對(duì)照；WT.無(wú)突變的pMIR-ATGL-3′UTR載體；MT.針對(duì)不同miRNA進(jìn)行種子區(qū)突變后的pMIR-ATGL-mut載體，其中與ssc-miR-769-3p對(duì)應(yīng)的是MT1載體，與ssc-miR-1343和ssc-miR-7137-3p對(duì)應(yīng)的是MT2載體，與ssc-miR-671-5p對(duì)應(yīng)的是MT3載體。表3同Different letters denoting significant difference between groups：A，B,C.P<0.01.Mimic NC.miRNA mimic negtive control；WT.pMIR-ATGL-3′UTR vector as a wild type；MT.pMIR-ATGL-mut vectors，in which MT1 has the mutated seed sequence for ssc-miR-769-3p，MT2 has the mutated seed sequence for ssc-miR-1343and ssc-miR-7137-3p，MT3 for ssc-miR-671-5p.The same as table 3圖3 種子區(qū)突變前后4種ssc-miRNAs對(duì)熒光素酶表達(dá)的影響Fig.3 Relative luciferase activity of various reporters in the presence or absence of miRNA seed sequence in 293T cells

表3 不同ssc-miRNA與pMIR-ATGL-3′UTR(WT)或pMIR-ATGL-mut(MT)共轉(zhuǎn)染的熒光素酶活性差異比較

Table 3 Difference comparison of relative luciferase activity in 293T cells cotransfected between different ssc-miRNAs and corresponding reporter vectors

相對(duì)熒光素酶比值RLU均值±標(biāo)準(zhǔn)差Mean±SDP(NC?WT)1P(WT?MT)2P(NC?MT)3ssc?miR?769?3pmimic+WTssc?miR?769?3pmimic+MT116．79±0．4922．71±0．49<0．00010．00020．0001ssc?miR?1343mimic+WTssc?miR?1343mimic+MT218．32±0．5627．47±0．56<0．0001<0．00010．1673ssc?miR?7137?3pmimic+WTssc?miR?7137?3pmimic+MT222．06±0．6329．84±0．630．00030．00010．2606ssc?miR?671?5pmimic+WTssc?miR?671?5pmimic+MT318．13±0．5218．34±0．52<0．00010．7845<0．0001mimicNC28．73±0．49

1、2、3.各組間的差異比較P值1,2,3.Pvalue among various groups

3 討 論

miRNA是基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)者，是揭示性狀形成分子機(jī)制的一個(gè)新靶點(diǎn)。到目前為止，在最新的miRBase版本(Release 21)中已發(fā)現(xiàn)的豬miRNAs有382種，明顯低于已鑒定的人(1 881種)和小鼠(1 193種)的miRNAs數(shù)量，而其中絕大多數(shù)的生物學(xué)功能尚不完全清楚。不斷積累的證據(jù)顯示，miRNA在脂肪代謝中發(fā)揮重要功能，不但調(diào)控動(dòng)物脂肪的分化，還參與脂類代謝[9-11]及與脂類代謝相關(guān)的激素內(nèi)分泌調(diào)節(jié)[12]。在動(dòng)物體內(nèi)敲除miR-14基因，導(dǎo)致甘油三酯和甘油二酯的含量增加，過(guò)量表達(dá)則減少[9]。抑制肥胖小鼠模型中miR-122的表達(dá)除了降低血漿膽固醇水平外，會(huì)明顯促進(jìn)脂肪變性，且脂肪生成基因表達(dá)減少[11]。miR-1792通過(guò)靶位點(diǎn)Rb2/pl30的3′UTR作用，能加快脂肪前體細(xì)胞3T3-L1細(xì)胞分化速度，增加甘油三酯的沉積[13]。對(duì)豬miRNA的研究中，李國(guó)喜[14]對(duì)7和240日齡榮昌豬背部皮下脂肪組織miRNA轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析，共篩選到227種豬保守miRNAs，同時(shí)確定miR-103參與脂類代謝和脂肪細(xì)胞分化，并提出miR-103可能通過(guò)靶作用于維甲酸誘導(dǎo)14基因(RAI14)促進(jìn)豬前體脂肪細(xì)胞分化。在豬脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程中，miR143通過(guò)作用靶點(diǎn)細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶5(ERK5)促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化[15]，也能促進(jìn)甘油三酯的分解，抑制甘油和游離脂肪酸的合成，進(jìn)而促進(jìn)脂滴沉積[16]；miR-27a能抑制脂質(zhì)的合成代謝，促進(jìn)脂質(zhì)的分解代謝，進(jìn)而阻礙豬脂肪細(xì)胞脂滴的沉積[16]；豬miR-181a能通過(guò)靶位點(diǎn)TNFα基因的3′UTR作用，能加速脂滴聚集，增加甘油三酯的沉積，調(diào)控脂肪發(fā)生[17]。這些說(shuō)明miRNA也作為脂肪代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一份子發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。脂肪的發(fā)育程度與豬瘦肉率關(guān)系密切，所以研究miRNA對(duì)脂肪代謝的調(diào)控機(jī)制意義重大。

ATGL能催化細(xì)胞內(nèi)甘油三酯降解的起始步驟，是啟動(dòng)脂肪動(dòng)員的一個(gè)關(guān)鍵脂肪分解酶。如果能篩選到參與調(diào)控ATGL基因表達(dá)的miRNA，并分析其調(diào)控機(jī)制，人們就可以明確這些miRNA在脂肪代謝中所扮演的角色，從而無(wú)論是明確ATGL脂解機(jī)理還是在開(kāi)發(fā)潛在的飼料添加劑方面都有重要價(jià)值。S.K.Das博士利用雙熒光素酶活性分析發(fā)現(xiàn)，miR-124a能通過(guò)與小鼠ATGL基因的3′UTR結(jié)合，從而下調(diào)小鼠ATGL基因 mRNA表達(dá)[18]。但由于豬和人的ATGL基因在3′UTR存在較大的差異，對(duì)豬ATGL基因miRNA的研究顯得很有必要。

通過(guò)靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件，獲得可能與豬ATGL基因3′UTR互作的10個(gè)候選miRNAs。但在軟件預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上，仍需要通過(guò)試驗(yàn)的方法來(lái)驗(yàn)證生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的是否準(zhǔn)確。目前最為常用的miRNA靶位點(diǎn)鑒定方法是熒光素酶報(bào)告基因法。利用miRNA mimics及對(duì)照來(lái)驗(yàn)證預(yù)測(cè)的10種miRNAs是否與豬ATGL基因的3′UTR段結(jié)合，發(fā)現(xiàn)5種miRNAs(ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149)的共轉(zhuǎn)染組相對(duì)熒光活性比對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。其中miR1343和miR7137-3p對(duì)ATGL3′UTR報(bào)告基因載體的相對(duì)熒光活性降低顯著，分別達(dá)到了48.8%和42.3%，而miR769-3p則只降低9.4%。有些報(bào)道中，miRNA對(duì)一些靶基因的表達(dá)量能抑制50%甚至更多[19]，這可能和miRNA與靶基因的結(jié)合程度有關(guān)，有些結(jié)合程度較高，有些結(jié)合程度較低[20]。繼續(xù)進(jìn)行靶位點(diǎn)突變?cè)囼?yàn)，進(jìn)一步縮小范圍檢測(cè)這些miRNA對(duì)其結(jié)合位點(diǎn)突變的ATGL基因3′UTR熒光素酶報(bào)告載體活性的影響，發(fā)現(xiàn)miR-1343和miR-7137-3p對(duì)ATGL的抑制作用因?yàn)榉N子區(qū)的突變得以回復(fù)，進(jìn)一步說(shuō)明了這一作用是由于miRNA與ATGL基因3′UTR的作用而產(chǎn)生，且相應(yīng)的種子區(qū)是miR-1343和miR7137-3p與ATGL結(jié)合起關(guān)鍵作用的堿基，因此確定了ssc-miR1343和 ssc-miR-7137-3p與ATGL結(jié)合的靶位點(diǎn)。miR-671-5p對(duì)ATGL的抑制作用沒(méi)有因?yàn)橥蛔兊玫交貜?fù)，說(shuō)明了miRNA-671-5p與ATGL3′UTR存在另外的結(jié)合位點(diǎn)而非預(yù)測(cè)的種子區(qū)。整個(gè)篩選過(guò)程也說(shuō)明了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果存在一定的假陽(yáng)性率，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

關(guān)于ssc-miR-1343和ssc-7137-3p的研究都還較少。G.Li等[21]采用Solexa測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)ssc-miR-1343在7和240日齡榮昌豬背部皮下脂肪組織中表達(dá)；C.Chen等[22]采用相同的Solexa測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)150日齡的大約克和梅山豬背部皮下脂肪組織中表達(dá)ssc-miR-1343，且通過(guò)莖環(huán)qPCR驗(yàn)證了梅山豬中ssc-miR-1343的表達(dá)量比大約克豬高出一倍；最新發(fā)現(xiàn)其在乳汁中也有表達(dá)[23]。這也都說(shuō)明ssc-miR-1343與豬脂肪組織的發(fā)育和脂肪代謝有著某些聯(lián)系，而本研究發(fā)現(xiàn)的ssc-miR-1343與豬ATGL3′UTR的互作模式也許能為這個(gè)聯(lián)系提供一個(gè)答案，ssc-miR-1343可能通過(guò)調(diào)控ATGL的表達(dá)進(jìn)而影響豬脂肪代謝。而對(duì)于ssc-miR-7137-3p的報(bào)道更少，其最早發(fā)現(xiàn)于豬感染胸膜肺炎放線桿菌后的肝組織中[24]，后來(lái)發(fā)現(xiàn)在豬乳汁中也有表達(dá)[23]，但還未見(jiàn)有關(guān)ssc-miR-7137-3p與脂肪代謝關(guān)系的報(bào)道。

由于每個(gè)miRNA可以有多個(gè)靶基因，而幾個(gè)miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個(gè)基因[25]。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)既可以通過(guò)一個(gè)miRNA來(lái)調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)，也可以通過(guò)幾個(gè)miRNAs的組合來(lái)精細(xì)調(diào)控某個(gè)基因的表達(dá)。本研究初步篩選出2種miRNAs對(duì)豬ATGL具有較顯著的調(diào)控作用，但其具體的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍需進(jìn)行更深入的研究，而且還有待于進(jìn)一步檢測(cè)ssc-miRNA-1343和ssc-miR-7137-3p對(duì)豬ATGL蛋白水平的調(diào)控。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了豬ATGL基因3′UTR的熒光素酶驗(yàn)證載體和突變載體，初步篩選出與豬ATGL基因3′UTR 互作的5種miRNAs (ssc-miR-769-3p、ssc-miR-1343、ssc-miR-7137-3p、ssc-miR-671-5p、ssc-miR-149)，并通過(guò)突變?cè)囼?yàn)發(fā)現(xiàn)ssc-miR-1343和ssc-miR-7137-3p能通過(guò)預(yù)測(cè)的“種子區(qū)”靶向結(jié)合于豬ATGL基因3′UTR，并下調(diào)其表達(dá)，為進(jìn)一步發(fā)掘調(diào)控豬ATGL基因表達(dá)的miRNA提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(編輯 郭云雁)

Prediction and Validation of miRNA Targeting PorcineATGLGene

DAI Li-he，CHU Xiao-hong，LU Fu-zeng，HUANG Sun-ping，XU Ru-hai*

(ZhejiangEngineeringResearchCenterforLivestockandPoultryGeneticBreeding，InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China)

To preliminary screen out ssc-miRNAs targeting porcine adipose triglyceride lipase gene (ATGL)，10 ssc-miRNAs targetingATGLwere predicted by bioinformatics analysis．3′UTR of porcineATGLgene was inserted into the pMIR-Luc target reporter vector and transiently co-transfected with candidate miRNA mimics into HEK 293T cells，using pRL-TK vector as an internal control reporter.Three other reporter vectors containing the mutated ssc-miRNAs targeting sites by reversing the seed region of targeting sites were created as negative controls.The dual luciferase reporter assay system was used to evaluate the activity of luciferase．The results showed that pMIR-ATGL-3′UTR recombinant vector was successfully constructed which contained 3′UTR of porcineATGLgene.Dual luciferase reporter assay showed that ssc-miR-769-3p，ssc-miR-1343，ssc-miR-7137-3p，ssc-miR-671-5p and ssc-miR-149 could down-regulate the luciferase activity of pMIR-ATGL-3′UTR vector in 293T cell，while mutant assay verified ssc-miR-1343 and ssc-miR-7137-3p could down-regulate the luciferase activity by targeting the predicted seed region of 3′UTR of porcineATGLgene.These results indicated that ssc-miR-1343 and ssc-miR-7137-3p could down-regulate the expression of porcineATGLgene by targeting its 3′UTR.

pig；ATGLgene；miRNA；dual luciferase reporter system；3′UTR

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.08.002

2014-11-21

國(guó)家自然科學(xué)基金(31201783)；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃課題(2011AA100304-1)；浙江省自然基金(Y3100569)；浙江省育種專項(xiàng)(2012C12906-5)

戴麗荷(1982-)，女，浙江天臺(tái)人，助理研究員，博士，主要從事豬遺傳育種研究，E-mail：dailihe505@126.com

*通信作者：徐如海，E-mail：xuruhai@163.com

S828.2

A

0366-6964(2015)08-1281-09