李立恒 王蕊 王芹 張智軼 安峰 張璇 王曉明 張凡

河北北方學院附屬第一醫(yī)院1口腔科，2病理科（河北張家口 075000）

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，且癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移是OSCC 患者死亡的主要原因［1-2］。因此，闡明OSCC 的潛在分子機制有助于為OSCC 患者確定新的治療策略。近年來研究發(fā)現(xiàn)［3-4］，MicroRNA（miRNA）在包括OSCC 在內(nèi)的人類癌癥中異常表達，且在腫瘤的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移中起著至關重要的作用。有研究顯示［5］，位于染色體19q13.41 上的miR-498 在三陰性乳腺癌細胞中高表達，下調(diào)miR-498 可抑制三陰性乳腺癌細胞的增殖；而磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1（phosphoenolpyruvate carboxykinase 1，PCK1）作為糖異生途徑中的一個限速酶，在肝癌細胞中低表達，過表達PCK1 可抑制肝癌細胞的增殖［6］。但miR-498 及PCK1 對OSCC 細胞生長的影響尚未見報道，基于此，本研究主要探討miR-498 對OSCC 細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的作用以及內(nèi)部的分子機制，以期為OSCC 的臨床診治提供新的分子靶標。

1 材料與方法

1.1 OSCC 組織和細胞系 收集2019年2月至2021年2月期間，在本院采用外科切除術進行手術治療的OSCC 患者的OSCC 組織及與之匹配的癌旁組織，共150 對。將所有組織標本置于液氮中冷凍保存?zhèn)溆?，所有患者均簽署知情同意書。人OSCC 細胞系HSC-3、SCC-15、SCC-9 及人正?？谇唤琴|(zhì)細胞HOK 均購自美國典型菌種保藏中心。

1.2 主要試劑與儀器 miR-498 模擬物（miR-498 mimics）及其陰性對照（miR-NC）、miR-498 抑制物（anti-miR-498）及其陰性對照（anti-miR-NC）、siRNA PCK1（si-PCK1）及其陰性對照（si-NC）、PCK1過表達物（OE-PCK1）及其陰性對照（OE-NC）均購自美國ThermoFisher 公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)基、BCA試劑盒均購自美國Bio-Rad 公司；PrimeScriptTMRT Master Mix、TransStart?Green qPCR SuperMix 均 購自TaKaRa公司；Trizol試劑、ECL化學發(fā)光試劑盒均購自美國Sigma 公司；PCK1、GAPDH 兔多克隆抗體（anti-PCK1、anti-GAPDH）、辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗均購自美國Abcam 公司；熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司；CO2培養(yǎng)箱均購自德國SIGMA 公司。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人OSCC 細胞系HSC-3、SCC-15、SCC-9 及人正?？谇唤琴|(zhì)細胞HOK 均在含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。收集對數(shù)生長期的SCC-15 細胞，嚴格按照LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明書操作步驟對SCC-15 細胞進行轉(zhuǎn)染，并分組為：對照組（細胞未轉(zhuǎn)染）、miR-NC 組（miR-NC 轉(zhuǎn)染細胞）、miR-498 mimics 組（miR-498 mimics 轉(zhuǎn)染細胞）、anti-miR-NC 組（anti-miR-NC 轉(zhuǎn)染細胞）、antimiR-498 組（anti-miR-498 轉(zhuǎn)染細胞）、miR-NC+OENC 組（miR-NC 和OE-NC 共轉(zhuǎn)染細胞）、miR-NC+OE-PCK1 組（miR-NC 和OE-PCK1 共轉(zhuǎn)染細胞）、miR-498 mimics+OE-NC 組（miR-498mimics 和OENC 共轉(zhuǎn)染細胞）、miR-498 mimics+OE-PCK1 組（miR-498 mimics 和OE-PCK1 共轉(zhuǎn)染細胞）、antimiR-NC+si-NC 組（anti-miR-NC 和si-NC 組共轉(zhuǎn)染細胞）、anti-miR-NC+si-PCK1 組（anti-miR-NC 和si-PCK1 共轉(zhuǎn)染細胞）、anti-miR-498+si-NC 組（antimiR-498 和si-NC 共轉(zhuǎn)染細胞）、anti-miR-498+si-PCK1 組（anti-miR-498 和si-PCK1 共轉(zhuǎn)染細胞）。

1.4 qRT-PCR 檢測OSCC 組織及細胞中miR-498表達水平 Trizol 試劑用于從OSCC 組織及細胞中提取總RNA。使用PrimeScriptTMRT Master Mix 合成cDNA，利用TransStart?Green qPCR SuperMix 在ABI 7500 熒光定量PCR 系統(tǒng)上進行PCR 擴增反應，并使用以下引物：miR-498 正向：5′-GGTTTGAAGCCAGGCGGTTTC-3′，反向：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；U6 正向：5′-CTCGCTTCGGGCAGCACA-3′，反向：5′-AACGCTTTCACGAATTTGCGT-3′。使用2-ΔΔCt方法以U6 作為內(nèi)部對照計算miR-498 相對表達水平。

1.5 CCK-8 法檢測細胞增殖 將各組SCC-15 細胞以2×104個/孔的密度接種在96 孔板中，并在補充有10% FBS 的DMEM 中孵育過夜。在轉(zhuǎn)染后24、48、72 h，分別向每孔中加10 μL CCK-8 溶液，在37 ℃下孵育2 h 后，利用酶標儀檢測450 nm 波長處的吸光度。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 將各組SCC-15細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，用PBS 洗滌，并用20 μL 膜聯(lián)蛋白V 結(jié)合緩沖液將細胞重懸，然后將10 μL 膜聯(lián)蛋白V 異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）加入細胞重懸液中，37 ℃下孵育15 min，并在黑暗中加入5 μL 碘化丙啶（PI）復染30 min。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 Transwell 實驗檢測細胞侵襲與遷移 對于細胞遷移實驗，將細胞以3×104個/mL 的密度接種到Transwell 上腔室中，并將500 μL 含有10% FBS的DMEM 培養(yǎng)液作為化學引誘劑添加到Transwell下腔室。在5%CO2、37 ℃條件下孵育24 h 后，用棉簽刮去上腔室中的細胞，并用100%甲醇固定，0.4%結(jié)晶紫染色20 min。然后，漂洗細胞并干燥。在倒置顯微鏡下隨機選擇6 個視圖觀察，并統(tǒng)計細胞遷移數(shù)目。

對于細胞侵襲實驗，將基質(zhì)膠預先涂在Transwell 上腔室中，待其自然干燥后，將細胞以5×104個/mL 的密度接種到預先涂有基質(zhì)膠的上腔室中，其余步驟同細胞遷移實驗。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-498 與PCK1靶向關系 使用targetscan 網(wǎng)站預測miR-498與PCK1 的結(jié)合位點。分別構(gòu)建PCK1 的野生型（WT）和突變型（MUT）3′-UTR 區(qū)質(zhì)粒，標記為WTPCK1、MUT-PCK1。按照LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將WT-PCK1 和MUT-PCK1 分別與miR-NC 或miR-498 mimics 共轉(zhuǎn)染于SCC-15 細胞，每組設置6 個復孔，轉(zhuǎn)染48 h 后，使用雙重熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)評估相對熒光素酶活性。

1.9 Western blot檢測PCK1蛋白表達 使用總蛋白提取試劑盒從細胞中提取總蛋白，并通過BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠進行電泳以分離等量的蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，將膜用5%脫脂牛奶在37 ℃下封閉2 h，然后與一抗anti-PCK1、anti-GAPDH在4 ℃下孵育過夜。第二天用TBST 將膜洗滌后，加入HRP 標記的羊抗兔二抗于室溫下孵育1 h，利用ECL 發(fā)光試劑盒可視化蛋白，Image 軟件對灰度值進行量化分析。

1.10 統(tǒng)計學方法 所有統(tǒng)計分析采用SPSS 25.0版進行，數(shù)據(jù)用（）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-498 在OSCC 組織及細胞中的表達OSCC 組織中miR-498 的表達水平明顯高于癌旁組織［（2.65 ± 0.34）vs.（1.04 ± 0.15），P＜0.05］；與人正?？谇唤琴|(zhì)細胞HOK（1.03±0.14）比較，人OSCC細胞系HSC-3（2.05 ± 0.21）、SCC-15（2.75 ± 0.31）、SCC-9（2.31 ± 0.28）中miR-498 的表達水平顯著升高（F= 53.639，P＜0.001），且SCC-15 細胞中miR-498 的表達水平最高，因此選擇SCC-15 細胞作為后續(xù)的研究對象。

2.2 miR-498對SCC-15細胞增殖與凋亡的影響與對照組和miR-NC 組比較，miR-498 mimics 組SCC-15、OD450值（24、48、72 h）顯著升高，細胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）；與對照組和anti-miR-NC 組比較，anti-miR-498 組SCC-15 細胞OD450值（24、48、72 h）顯著降低，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 miR-498 對SCC-15 細胞細胞凋亡率及OD450值的影響Fig.1 Effects of miR-498 on apoptosis rate and OD450 value of SCC-15 cells

2.3 miR-498 對SCC-15 細胞遷移與侵襲的影響 miR-498 mimics 組SCC-15 細胞遷移與侵襲數(shù)目顯著高于對照組和miR-NC 組（P＜0.05）；antimiR-498 組SCC-15 細胞遷移與侵襲數(shù)目顯著低于對照組和anti-miR-NC 組（P＜0.05），見表1、圖2。

表1 miR-498 對SCC-15 細胞遷移數(shù)目及侵襲數(shù)目的影響Tab.1 Effect of mir-498 on migration number and invasion number of scc-15 cells ±s

表1 miR-498 對SCC-15 細胞遷移數(shù)目及侵襲數(shù)目的影響Tab.1 Effect of mir-498 on migration number and invasion number of scc-15 cells ±s

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與miR-NC 組比較，bP ＜0.05；與anti-miR-NC 組比較，cP ＜0.05

分組對照組miR-NC 組miR-498 mimics 組anti-miR-NC 組anti-miR-498 組F 值P 值遷移細胞數(shù)目（個）132.46±15.37 130.56±14.67 160.68±18.63ab 135.12±16.29 65.42±6.33ac 34.048＜0.001侵襲細胞數(shù)目（個）85.52±7.39 87.82±8.16 125.54±12.81ab 86.32±8.46 30.49±4.35ac 91.956＜0.001

圖2 Transwell 實驗檢測細胞遷移及侵襲Fig.2 Transwell assay for cell migration and invasion

2.4 miR-498 靶向調(diào)控PCK1 的表達 使用targetscan 預測miR-498 與PCK1 存在結(jié)合位點，見圖3。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明，與miR-NC+WT-PCK1 組（1.07 ± 0.13）比較，miR-498 mimics+WT-PCK1 組（0.36±0.08）熒光素酶相對活性顯著降低（P＜0.05），而miR-498 mimics+MUT-PCK1 組（1.08 ± 0.11）熒光素酶相對活性與miR-NC+MUTPCK1組（1.10±0.14）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Western blot 結(jié)果顯示，miR-498 mimics 組（0.23 ±0.02）SCC-15 細胞中PCK1 蛋白表達水平顯著低于對照組（0.51±0.08）和miR-NC 組（0.49±0.06）（P＜0.05）；anti-miR-498 組（1.03 ± 0.05）SCC-15 細胞中PCK1 蛋白表達水平顯著高于對照組（0.51 ± 0.08）和anti-miR-NC 組（0.48±0.07）（P＜0.05），見圖4。

圖3 使用targetscan 網(wǎng)站預測miR-498 與PCK1 的結(jié)合位點Fig.3 Predicted the binding site of mir-498 to PCK1 using targetscan website

圖4 Western blot 檢測各組細胞中PCK1 蛋白表達Fig.4 The expression of PCK1 protein in cells of each group was detected by western blot

2.5 共轉(zhuǎn)染miR-498 和PCK1 對SCC-15 細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響 PCK1 上調(diào)可顯著減弱miR-498 mimics 對SCC-15 細胞增殖、遷移和侵襲能力的增強作用，并顯著減弱miR-498 mimics對SCC-15 細胞凋亡的抑制作用，見表2、圖5-6；PCK1 下調(diào)可顯著減弱anti-miR-498 對SCC-15 細胞增殖、遷移及侵襲能力的抑制作用，并顯著減弱anti-miR-498 對SCC-15 細胞凋亡的促進作用，見表3、圖7-8。

表2 miR-498 mimics 和OE-PCK1 共轉(zhuǎn)染對SCC-15 細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響Tab.2 Effects of CO transfection of miR-498 mimics and OE-PCK1 onproliferation，apoptosis，migration and invasion of SCC-15 cells ±s

表2 miR-498 mimics 和OE-PCK1 共轉(zhuǎn)染對SCC-15 細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響Tab.2 Effects of CO transfection of miR-498 mimics and OE-PCK1 onproliferation，apoptosis，migration and invasion of SCC-15 cells ±s

注：與miR-NC+OE-NC 組比較，aP ＜0.05；與miR-NC+OE-PCK1 組比較，bP ＜0.05；與miR-498mimics+OE-NC 組比較，cP ＜0.05

分組miR-NC+OE-NC 組miR-NC+OE-PCK1 組miR-498mimics+OE-NC 組miR-498mimics+OE-PCK1 組F 值P 值OD450值24 h 0.41±0.06 0.18±0.04a 0.61±0.07a 0.39±0.05bc 58.841＜0.001 48 h 0.99±0.14 0.35±0.06a 1.23±0.16a 0.91±0.12bc 52.658＜0.001 72 h 1.33±0.24 0.54±0.09a 1.76±0.30a 1.30±0.22bc 30.255＜0.001細胞凋亡率（%）13.96±1.72 46.35±5.23a 7.25±1.36a 16.87±2.65bc 183.395＜0.001遷移細胞數(shù)目（個）125.51±15.33 62.56±6.56a 168.15±18.78a 120.36±16.74bc 49.577＜0.001侵襲細胞數(shù)目（個）84.36±8.36 32.25±4.67a 123.66±12.36a 77.56±8.21bc 107.994＜0.001

表3 anti-miR-498 和si-PCK1 共轉(zhuǎn)染對SCC-15 細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響Tab.3 Effects of anti-miR-498 and si-PCK1 co transfection on proliferation，apoptosis，migration and invasion of SCC-15 cells x±s

圖5 miR-498 mimics 和OE-PCK1 共轉(zhuǎn)染對SCC-15 細胞凋亡的影響Fig.5 Effect of CO transfection of miR-498 mimics and OE-PCK1 on the apoptosis of SCC-15 cells

圖6 miR-498 mimics 和OE-PCK1 共轉(zhuǎn)染對SCC-15 細胞遷移及侵襲的影響Fig.6 Effect of CO transfection of miR-498 mimics and OE-PCK1 on migration and invasion of SCC-15 cells

圖7 anti-miR-498 和si-PCK1 共轉(zhuǎn)染對SCC-15 細胞凋亡的影響Fig.7 Effects of anti-miR-498 and si-PCK1 co transfection on apoptosis of SCC-15 cells

圖8 anti-miR-498 和si-PCK1 共轉(zhuǎn)染對SCC-15 細胞遷移及侵襲的影響Fig.8 Effects of anti-miR-498 and si-PCK1 co transfection on migration and invasion of SCC-15 cells

3 討論

OSCC 的特點是局部侵襲性強、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其發(fā)生發(fā)展是一個復雜的過程，受多種因素影響，多種基因參與并協(xié)同作用，不同基因發(fā)揮不同作用［7］。盡管近年來在OSCC 的診斷和治療方面已經(jīng)取得了較大的進步，但OSCC 患者的5年生存率仍然低于50%［8］。因此，確定OSCC 的發(fā)病機制對于開發(fā)新的治療策略具有重要的意義。

miRNAs 是一類沒有蛋白質(zhì)編碼能力的內(nèi)源性單鏈RNAs，且miRNA 可以通過互補作用與其靶mRNA 的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［9-10］。miR-498 是一種在腫瘤細胞的生長、侵襲與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用的miRNA［11］。據(jù)報道，miR-498 可促進腎上腺皮質(zhì)癌細胞的增殖，下調(diào)miR-498 表達后，腎上腺皮質(zhì)細胞增殖明顯下降［12］；下調(diào)miR-498 在OSCC 細胞SCC-15 中的表達可顯著降低細胞侵襲和遷移［13］；miR-498 在乳腺癌細胞中高表達，其通過抑制PTEN 促進乳腺癌細胞的增殖和遷移［14］；miR-498 在轉(zhuǎn)移性甲狀腺髓樣癌中的表達水平顯著高于原發(fā)性甲狀腺髓樣癌［15］。以上研究表明miR-498 在多種腫瘤中發(fā)揮著癌基因的作用。本研究結(jié)果與其是一致的，本研究結(jié)果顯示，miR-498 在OSCC 組織和細胞HSC-3、SCC-15、SCC-9 中高表達，且SCC-15 細胞中miR-498 的表達水平最高，因此，選擇SCC-15 細胞進行轉(zhuǎn)染實驗；本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達miR-498 可促進SCC-15 細胞的增殖、遷移及侵襲，抑制細胞凋亡，而下調(diào)miR-498 可抑制SCC-15 細胞的增殖、遷移及侵襲，促進細胞凋亡，提示miR-498 在SCC-15 細胞中具有促癌的作用。

為了進一步探究miR-498 在SCC-15 細胞中促進細胞增殖、遷移及侵襲，抑制細胞凋亡的內(nèi)部機制，本研究通過雙熒光素酶報告基因證實了PCK1為miR-498 的靶基因，且miR-498 可靶向負調(diào)控PCK1 的表達。PCK1 是調(diào)節(jié)糖異生過程中的限速酶，其能夠廣泛參與糖代謝、脂代謝、衰老、糖尿病以及腫瘤細胞增殖和凋亡等代謝和生物學進

程［16］。相關研究表明，PCK1 在腎透明細胞癌組織中的表達水平顯著低于癌旁組織，PCK1 高表達組患者的總體生存率明顯高于低表達組［17］；PCK1 過表達后可明顯抑制肝癌細胞的遷移能力，而敲除后促進其遷移，說明PCK1 作為抑癌基因參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展［18］；沉默PCK1 通過誘導氧化應激和轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 的激活促進肝癌細胞的增殖［19］；過表達PCK1 通過激活糖異生和抑制糖酵解途徑來降低肝癌細胞的活力，誘導細胞凋亡，并抑制細胞遷移［20］；circC3P1 通過海綿miR-4641 在肝癌細胞中促進PCK1 表達，進而抑制細胞的增殖、遷移與侵襲［21］。上述研究成果揭示了PCK1 在腫瘤中發(fā)揮著抑癌基因的作用，本研究結(jié)果與上述研究也是一致的，本研究結(jié)果顯示，過表達或敲低miR-498 可引起PCK1 蛋白表達水平的顯著下調(diào)或上調(diào)；PCK1 上調(diào)可顯著減弱miR-498 mimics 對SCC-15 細胞增殖、遷移和侵襲能力的增強作用及對細胞凋亡的抑制作用；PCK1 下調(diào)可顯著減弱antimiR-498 對SCC-15 細胞增殖、遷移及侵襲能力的抑制作用及對細胞凋亡的促進作用。提示miR-498 通過靶向抑制PCK1 的表達促進SCC-15 細胞增殖、遷移及侵襲，并抑制細胞凋亡。然而本研究僅僅在體外細胞水平上進行了探究，miR-498 對PCK1 的調(diào)控作用在體內(nèi)水平上是否還具有類似的趨勢，有待進一步探究。

綜上所述，miR-498 通過靶向抑制PCK1 的表達促進SCC-15 細胞增殖、遷移及侵襲，并抑制細胞凋亡。但關于miR-498 調(diào)控PCK1 涉及的作用機制較為復雜，這將是本研究后續(xù)研究的重點。