董志輝 許小丁

中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院基礎醫(yī)學與轉化中心（廣州 510120）

目前，大多數(shù)臨床批準的藥物，包括用于癌癥的藥物，都是基于小分子或蛋白質/抗體的生物制劑。核酸藥物作為新一代藥物，研發(fā)工作者付出了巨大努力。半個世紀前，F(xiàn)RIEDMANN 和ROBLIN［1］提出了一個概念：通過引入功能基因拷貝，可以治療功能性基因產(chǎn)物引起的遺傳性疾病。此后，核酸藥物克服各種挑戰(zhàn)，制定適當?shù)募膊∵x擇策略，目前主要針對罕見疾病進行治療。如今，核酸藥物治療仍處于全球抗擊2019 冠狀病毒?。–OVID-19）大流行努力的前沿［2-4］。

核酸類藥物能夠根據(jù)核苷酸的序列信息調控細胞的生物學功能。這些藥物發(fā)揮功能要么是基于它們在細胞中的表達，要么是通過基因調節(jié)，特別是那些具有互補序列的基因的調節(jié)。這些機制為核酸藥物提供了一個主要優(yōu)勢，即無論目標分子的定位或結構如何，核酸藥物都可以被設計，用來靶向這些小分子或抗體無法達到的目標分子。本文主要綜述了三種核酸類藥物：DNA 藥物、信使RNA（mRNA）藥物以及小干擾RNA（siRNA）藥物的工作原理及應用等。但是考慮到它們的大體積和負電荷的特點，以及基因在體內(nèi)遞送存在的生物屏障，這些大分子的遞送通常需要經(jīng)過結構的改性，或者需要一些遞送系統(tǒng)如納米遞送系統(tǒng)的結合來達到長期有效的治療效果。

1 核酸藥物的分類

1.1 DNA 藥物 反義寡核苷酸（ASO）作為一種常見的DNA 類藥物，是長度在13 ～30 堿基的單鏈短DNA 序列。ASO 通過利用與靶基因互補的寡核苷酸序列，在靶點位形成DNA/RNA 雙鏈結構，導致基因功能被抑制。ASO 除了靶向mRNA 基因外，也可以靶向Micro RNA（miRNAs），在這種情況下，靶向miRNA 的ASO 被稱為antimir 或antagomir［5-6］。ASO 發(fā)揮作用的方式不僅可以通過形成一個強大的雙鏈結構導致空間位阻，還可以誘導RNase H切割RNA 鏈。RNase H 是一種內(nèi)源性酶，能夠識別DNA/RNA 雙鏈，并特異地切割RNA 鏈。因此，ASOs形成的雙鏈可以催化RNase H的定向切割［7］。

ASOs 的研究早于其他核酸藥物。Fomivirsen是一種ASO 藥物，于1998年被批準為美國第一個核酸藥物［8］。隨后批準用于臨床的反義寡核苷酸藥物還有mipomersen［9］和inotersen［10］等。

1.2 mRNA 類藥物 mRNA 類藥物由成百上千個核苷酸組成。不同于以寡核苷酸為基礎的藥物類別，mRNA 藥物能夠直接導入靶細胞，以蛋白質的形式表達［11-12］。mRNA 藥物不需要細胞核定位，從而避免了基因組整合導致的突變，因此，這些藥物被認為是高度安全的。WOLFF等［13］在1990年首次報道了肌內(nèi)注射mRNA 到小鼠骨骼肌誘導編碼蛋白的表達。從那時起，以mRNA 為基礎的治療方法在各種應用中得到了研究，包括癌癥治療、傳染病疫苗、蛋白質替代和細胞基因工程。特別是自2020年COVID-19 大流行爆發(fā)以來，嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）疫苗的臨床試驗進展迅速。例如：2021年8月23日，美國食品和藥物管理局（FDA）首次批準的Comirnaty COVID-19疫苗以及2020年12月18日FDA 批準的Moderna COVID-19 疫苗，都屬于mRNA 類核酸藥物。

1.3 siRNA 類藥物 合成的siRNA 是雙鏈RNA，是模仿細胞內(nèi)的雙鏈RNA 專一性RNA 內(nèi)切酶（Dicer 酶）將外源性雙鏈RNA（dsRNA）切割的產(chǎn)物，一般為20～30 個核苷酸長度［14-15］。當外源性的siRNA 進入細胞后，與細胞內(nèi)的解旋酶以及其他因子結合形成RNA 誘導沉默復合物（RISC）［16］。激活的RISC 通過堿基互補配對原則定位到同源mRNA 轉錄本上，在距離siRNA 3′端12個堿基處切割mRNA，特異性地阻斷體內(nèi)特定基因的表達，誘發(fā)細胞呈現(xiàn)出特定基因表達降低表型。siRNA 對于由基因異常表達或基因突變引起的疾病，如癌癥、病毒感染和遺傳疾病等的治療具有巨大的應用潛力。并且由于其RNA 干擾過程發(fā)生在細胞質中，不需要穿透細胞核，這使siRNA 核酸藥物的開發(fā)更具吸引力。Patisiran 是2018年美國FDA 批準的第一種siRNA 藥物［17］，在此之后，2020年FDA 又相繼批準三種siRNA 類核酸藥物。

2 核酸藥物面臨的挑戰(zhàn)及解決辦法

核酸藥物具有其他藥物所沒有的優(yōu)異性能，但也面臨著諸多挑戰(zhàn)。事實上，未經(jīng)修飾的核酸根本無法進入細胞，除了由于核酸本身的低穩(wěn)定性外，還包括半衰期短、容易被內(nèi)源性核酸酶降解、被腎小球過濾并經(jīng)過尿液排出體外、被細胞攝取效率低以及核酸的免疫原性等，使得核酸藥物的臨床應用受到極大的限制［18-19］。大多數(shù)已獲批或正在進行Ⅲ期臨床試驗的核酸藥物，要么是局部給藥（包括鞘內(nèi)給藥），要么是通過全身循環(huán)肝臟給藥，研究者們一直在為將核酸藥物高效傳遞到其他組織（如腫瘤組織）中而努力。目前所應用較多的提高核酸藥物遞送效率的方法包括核酸藥物化學修飾和納米遞送系統(tǒng)。

2.1 核酸藥物的化學修飾 為保證核酸藥物的成藥性，提高其抗酶解的能力等，研究者對核酸藥物進行了各種化學修飾。此類修飾主要包括：堿基修飾、磷酸基團上的修飾、核糖部分的修飾、核糖-磷酸骨架修飾以及針對核酸藥物的組合修飾等。

堿基修飾中一般在嘧啶堿基的5′-位以及嘌呤堿基的8′-位引入羧基、咪唑基、芳香基以及氨基等功能基團，來達到增強對靶基因的親和性、提高核酸藥物的化學活性以及穩(wěn)定性等目的；磷酸基團的修飾作為目前使用最廣泛的修飾方法，其典型例子包括硫代磷酸化［20］，核苷酸鏈中磷酸基團上帶雙鍵的氧原子被硫原子取代。一方面，使得修飾之后的核酸類藥物具有抗核酸酶降解，并增強與血漿蛋白的結合，阻止快速的腎清除，增強其生物利用度。另一方面，硫代修飾序列與靶RNA形成的雜交雙螺旋片段能被RNase H 識別并降解靶RNA。但是不足之處是高濃度帶來的免疫毒性的副作用，以及對靶序列的親和性相對較低；核糖部分的修飾中較為常見的是在核酸中糖2′-位引入一個取代基的修飾［20］。2′-甲氧基、2′-甲氧基乙氧基和2′-氟是具有糖基的核酸最常見的修飾［21-22］。此外，2′-O，4′-C-亞甲基橋連核酸/鎖定核酸（2′，4′-BNA/LNA）、2′-O、4′-C-乙烯橋連核酸（ENA）等核糖部分的修飾都可以增強核酸酶的穩(wěn)定性和對靶標RNA 的親和力；核糖-磷酸骨架修飾主要有兩種方式：嗎啉磷酰二胺寡聚體（PMO）［23］和肽核酸（PNA）［24］修飾。高親和性的PMO 具有很好的水溶性，能夠與各種RNA 結合，以達到干擾RNA 剪接和抑制mRNA 翻譯的效果，有幾種此類核酸藥物已處于臨床試驗階段；組合修飾的方法能夠有效避免單一修飾所帶來的弊端，例如：糖修飾的核酸由于其高的RNA 結合強度，有助于形成強大的雙鏈，然而RNase H 不能識別它們。因此，通常引入gapmer 結構，其中糖修飾的核酸放置在ASO 的兩端，PS-DNA 修飾部分放置在中間，中間的PS-修飾部分可以被RNase H 識別，達到降解mRNA 的目的［25］。

2.2 納米遞送系統(tǒng) 病毒載體是應用最早的核酸藥物體內(nèi)遞送的載體，但是由于其本身難以大規(guī)模制備、具有潛在的免疫原性和致突變性等缺點［26］，目前已經(jīng)不是核酸藥物體內(nèi)遞送的首選。理想的核酸藥物遞送系統(tǒng)通常需要具備五個條件：（1）生物相容性較好，不引起機體的免疫反應；（2）體內(nèi)血液循環(huán)時間長，不被核酸酶降解；（3）靶向性較好，在病灶部位富集量高；（4）細胞攝取量高；（5）被細胞攝取之后能夠快速高效地從內(nèi)涵體中逃逸出來。因此，非病毒載體尤其是納米載體，由于其較好的生物相容性、低的免疫原性以及容易被大規(guī)模制備等特點，成為核酸載體選擇的新起之秀［27］。

以惡性腫瘤為例，研究者們基于實體瘤組織特殊的生理微環(huán)境［28-29］，如：弱酸、缺氧環(huán)境、特定酶如基質金屬蛋白酶（MMP）的過度表達、腫瘤細胞中存在高水平的反應活性氧（ROS）以及高濃度的還原性物質如谷胱甘肽（GSH）等特點，構建了一系列腫瘤微環(huán)境響應型納米載體。例如：本團隊設計合成的一種包含酸響應基團的腫瘤組織弱酸性響應納米材料Meo-PEG-b-PHMEMA［30］，該材料的pKa為6.9接近腫瘤組織pH（6.5～6.8）。該納米載體上的親水性的PEG 外殼能夠大大延長siRNA的體內(nèi)循環(huán)時間［31］，當納米載體利用腫瘤組織的高滯留效應（EPR 效應）富集到腫瘤組織后，PHMEMA 鏈被質子化導致納米結構的解散［32］，疏水性的內(nèi)殼siRNA 與兩親性功能肽TCPA 復合物釋放出來，隨后TCPA 一方面利用其結構中的RGD肽序列攜帶siRNA 靶向腫瘤細胞，另一方面利用其結構中具有膜穿透功能的寡聚精氨酸序列協(xié)助siRNA 的內(nèi)涵體逃逸，達到基因沉默從而抑制腫瘤生長的目的；除此之外研究者還利用乏氧響應基團2-硝基咪唑［33］、偶氮苯基團［34］設計了一系列乏氧響應型納米載體；由于腫瘤組織中基質金屬蛋白酶的活性較高，WANG 等［35］設計合成了一種基質金屬蛋白酶-2/9（MMP-2/9）響應的兩親型高分子材料聚乙二醇-聚己內(nèi)酯（PEG-PCL）向腫瘤部位遞送siRNA；依據(jù)苯硼酸或苯硼酸酯的ROS響應性，LI 等［36］設計制備了一種苯硼酸修飾的ROS 響應的納米載體用于siRNA 的體內(nèi)遞送和結腸癌治療；同時基于腫瘤細胞內(nèi)一些抗氧化物質（如GSH）表達較高［37］，本團隊［38-39］設計合成一種GSH 響應的Cys-PDSA 納米載體，用于MYC siRNA（siMYC）或Kinesin family member 11 siRNA（siKIF11）的體內(nèi)遞送和前列腺癌治療。

3 總結與展望

將核酸藥物安全高效的遞送入細胞并發(fā)揮其編輯、剪接、替換或抑制的功能，實現(xiàn)致病基因的長期抑制以及抑病基因的過表達，是一種理想的治療方案。從1990年第一次將基因導入細胞并成功表達，到如今已經(jīng)有多種核酸藥物經(jīng)過審批并應用于臨床治療。核酸藥物在化學修飾、遞送載體等方面積累了豐富的經(jīng)驗，除小分子藥物和抗體藥物外，核酸藥物正在被建立成為第三種治療模式。利用核酸藥物不同于常規(guī)藥物的特點，能夠針對性選擇靶點，對一些不存在治療藥物的罕見疾病開發(fā)出核酸藥物。但是到目前為止，核酸藥物依然沒有被廣泛應用于各類疾病的治療。希望研究者們對生物學的進一步了解能夠幫助克服與核酸藥物相關的挑戰(zhàn)，并在不久的將來增加新的治療選擇。