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        核酸藥物研究進(jìn)展及挑戰(zhàn)

        2023-01-05 19:07:34董志輝許小丁
        實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2022年11期
        關(guān)鍵詞:雙鏈堿基核酸

        董志輝 許小丁

        中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化中心(廣州 510120)

        目前,大多數(shù)臨床批準(zhǔn)的藥物,包括用于癌癥的藥物,都是基于小分子或蛋白質(zhì)/抗體的生物制劑。核酸藥物作為新一代藥物,研發(fā)工作者付出了巨大努力。半個(gè)世紀(jì)前,F(xiàn)RIEDMANN 和ROBLIN[1]提出了一個(gè)概念:通過引入功能基因拷貝,可以治療功能性基因產(chǎn)物引起的遺傳性疾病。此后,核酸藥物克服各種挑戰(zhàn),制定適當(dāng)?shù)募膊∵x擇策略,目前主要針對(duì)罕見疾病進(jìn)行治療。如今,核酸藥物治療仍處于全球抗擊2019 冠狀病毒?。–OVID-19)大流行努力的前沿[2-4]。

        核酸類藥物能夠根據(jù)核苷酸的序列信息調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能。這些藥物發(fā)揮功能要么是基于它們?cè)诩?xì)胞中的表達(dá),要么是通過基因調(diào)節(jié),特別是那些具有互補(bǔ)序列的基因的調(diào)節(jié)。這些機(jī)制為核酸藥物提供了一個(gè)主要優(yōu)勢(shì),即無論目標(biāo)分子的定位或結(jié)構(gòu)如何,核酸藥物都可以被設(shè)計(jì),用來靶向這些小分子或抗體無法達(dá)到的目標(biāo)分子。本文主要綜述了三種核酸類藥物:DNA 藥物、信使RNA(mRNA)藥物以及小干擾RNA(siRNA)藥物的工作原理及應(yīng)用等。但是考慮到它們的大體積和負(fù)電荷的特點(diǎn),以及基因在體內(nèi)遞送存在的生物屏障,這些大分子的遞送通常需要經(jīng)過結(jié)構(gòu)的改性,或者需要一些遞送系統(tǒng)如納米遞送系統(tǒng)的結(jié)合來達(dá)到長(zhǎng)期有效的治療效果。

        1 核酸藥物的分類

        1.1 DNA 藥物 反義寡核苷酸(ASO)作為一種常見的DNA 類藥物,是長(zhǎng)度在13 ~30 堿基的單鏈短DNA 序列。ASO 通過利用與靶基因互補(bǔ)的寡核苷酸序列,在靶點(diǎn)位形成DNA/RNA 雙鏈結(jié)構(gòu),導(dǎo)致基因功能被抑制。ASO 除了靶向mRNA 基因外,也可以靶向Micro RNA(miRNAs),在這種情況下,靶向miRNA 的ASO 被稱為antimir 或antagomir[5-6]。ASO 發(fā)揮作用的方式不僅可以通過形成一個(gè)強(qiáng)大的雙鏈結(jié)構(gòu)導(dǎo)致空間位阻,還可以誘導(dǎo)RNase H切割RNA 鏈。RNase H 是一種內(nèi)源性酶,能夠識(shí)別DNA/RNA 雙鏈,并特異地切割RNA 鏈。因此,ASOs形成的雙鏈可以催化RNase H的定向切割[7]。

        ASOs 的研究早于其他核酸藥物。Fomivirsen是一種ASO 藥物,于1998年被批準(zhǔn)為美國(guó)第一個(gè)核酸藥物[8]。隨后批準(zhǔn)用于臨床的反義寡核苷酸藥物還有mipomersen[9]和inotersen[10]等。

        1.2 mRNA 類藥物 mRNA 類藥物由成百上千個(gè)核苷酸組成。不同于以寡核苷酸為基礎(chǔ)的藥物類別,mRNA 藥物能夠直接導(dǎo)入靶細(xì)胞,以蛋白質(zhì)的形式表達(dá)[11-12]。mRNA 藥物不需要細(xì)胞核定位,從而避免了基因組整合導(dǎo)致的突變,因此,這些藥物被認(rèn)為是高度安全的。WOLFF等[13]在1990年首次報(bào)道了肌內(nèi)注射mRNA 到小鼠骨骼肌誘導(dǎo)編碼蛋白的表達(dá)。從那時(shí)起,以mRNA 為基礎(chǔ)的治療方法在各種應(yīng)用中得到了研究,包括癌癥治療、傳染病疫苗、蛋白質(zhì)替代和細(xì)胞基因工程。特別是自2020年COVID-19 大流行爆發(fā)以來,嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)疫苗的臨床試驗(yàn)進(jìn)展迅速。例如:2021年8月23日,美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)首次批準(zhǔn)的Comirnaty COVID-19疫苗以及2020年12月18日FDA 批準(zhǔn)的Moderna COVID-19 疫苗,都屬于mRNA 類核酸藥物。

        1.3 siRNA 類藥物 合成的siRNA 是雙鏈RNA,是模仿細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA 專一性RNA 內(nèi)切酶(Dicer 酶)將外源性雙鏈RNA(dsRNA)切割的產(chǎn)物,一般為20~30 個(gè)核苷酸長(zhǎng)度[14-15]。當(dāng)外源性的siRNA 進(jìn)入細(xì)胞后,與細(xì)胞內(nèi)的解旋酶以及其他因子結(jié)合形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)[16]。激活的RISC 通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則定位到同源mRNA 轉(zhuǎn)錄本上,在距離siRNA 3′端12個(gè)堿基處切割mRNA,特異性地阻斷體內(nèi)特定基因的表達(dá),誘發(fā)細(xì)胞呈現(xiàn)出特定基因表達(dá)降低表型。siRNA 對(duì)于由基因異常表達(dá)或基因突變引起的疾病,如癌癥、病毒感染和遺傳疾病等的治療具有巨大的應(yīng)用潛力。并且由于其RNA 干擾過程發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中,不需要穿透細(xì)胞核,這使siRNA 核酸藥物的開發(fā)更具吸引力。Patisiran 是2018年美國(guó)FDA 批準(zhǔn)的第一種siRNA 藥物[17],在此之后,2020年FDA 又相繼批準(zhǔn)三種siRNA 類核酸藥物。

        2 核酸藥物面臨的挑戰(zhàn)及解決辦法

        核酸藥物具有其他藥物所沒有的優(yōu)異性能,但也面臨著諸多挑戰(zhàn)。事實(shí)上,未經(jīng)修飾的核酸根本無法進(jìn)入細(xì)胞,除了由于核酸本身的低穩(wěn)定性外,還包括半衰期短、容易被內(nèi)源性核酸酶降解、被腎小球過濾并經(jīng)過尿液排出體外、被細(xì)胞攝取效率低以及核酸的免疫原性等,使得核酸藥物的臨床應(yīng)用受到極大的限制[18-19]。大多數(shù)已獲批或正在進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗(yàn)的核酸藥物,要么是局部給藥(包括鞘內(nèi)給藥),要么是通過全身循環(huán)肝臟給藥,研究者們一直在為將核酸藥物高效傳遞到其他組織(如腫瘤組織)中而努力。目前所應(yīng)用較多的提高核酸藥物遞送效率的方法包括核酸藥物化學(xué)修飾和納米遞送系統(tǒng)。

        2.1 核酸藥物的化學(xué)修飾 為保證核酸藥物的成藥性,提高其抗酶解的能力等,研究者對(duì)核酸藥物進(jìn)行了各種化學(xué)修飾。此類修飾主要包括:堿基修飾、磷酸基團(tuán)上的修飾、核糖部分的修飾、核糖-磷酸骨架修飾以及針對(duì)核酸藥物的組合修飾等。

        堿基修飾中一般在嘧啶堿基的5′-位以及嘌呤堿基的8′-位引入羧基、咪唑基、芳香基以及氨基等功能基團(tuán),來達(dá)到增強(qiáng)對(duì)靶基因的親和性、提高核酸藥物的化學(xué)活性以及穩(wěn)定性等目的;磷酸基團(tuán)的修飾作為目前使用最廣泛的修飾方法,其典型例子包括硫代磷酸化[20],核苷酸鏈中磷酸基團(tuán)上帶雙鍵的氧原子被硫原子取代。一方面,使得修飾之后的核酸類藥物具有抗核酸酶降解,并增強(qiáng)與血漿蛋白的結(jié)合,阻止快速的腎清除,增強(qiáng)其生物利用度。另一方面,硫代修飾序列與靶RNA形成的雜交雙螺旋片段能被RNase H 識(shí)別并降解靶RNA。但是不足之處是高濃度帶來的免疫毒性的副作用,以及對(duì)靶序列的親和性相對(duì)較低;核糖部分的修飾中較為常見的是在核酸中糖2′-位引入一個(gè)取代基的修飾[20]。2′-甲氧基、2′-甲氧基乙氧基和2′-氟是具有糖基的核酸最常見的修飾[21-22]。此外,2′-O,4′-C-亞甲基橋連核酸/鎖定核酸(2′,4′-BNA/LNA)、2′-O、4′-C-乙烯橋連核酸(ENA)等核糖部分的修飾都可以增強(qiáng)核酸酶的穩(wěn)定性和對(duì)靶標(biāo)RNA 的親和力;核糖-磷酸骨架修飾主要有兩種方式:?jiǎn)徇柞6饭丫垠w(PMO)[23]和肽核酸(PNA)[24]修飾。高親和性的PMO 具有很好的水溶性,能夠與各種RNA 結(jié)合,以達(dá)到干擾RNA 剪接和抑制mRNA 翻譯的效果,有幾種此類核酸藥物已處于臨床試驗(yàn)階段;組合修飾的方法能夠有效避免單一修飾所帶來的弊端,例如:糖修飾的核酸由于其高的RNA 結(jié)合強(qiáng)度,有助于形成強(qiáng)大的雙鏈,然而RNase H 不能識(shí)別它們。因此,通常引入gapmer 結(jié)構(gòu),其中糖修飾的核酸放置在ASO 的兩端,PS-DNA 修飾部分放置在中間,中間的PS-修飾部分可以被RNase H 識(shí)別,達(dá)到降解mRNA 的目的[25]。

        2.2 納米遞送系統(tǒng) 病毒載體是應(yīng)用最早的核酸藥物體內(nèi)遞送的載體,但是由于其本身難以大規(guī)模制備、具有潛在的免疫原性和致突變性等缺點(diǎn)[26],目前已經(jīng)不是核酸藥物體內(nèi)遞送的首選。理想的核酸藥物遞送系統(tǒng)通常需要具備五個(gè)條件:(1)生物相容性較好,不引起機(jī)體的免疫反應(yīng);(2)體內(nèi)血液循環(huán)時(shí)間長(zhǎng),不被核酸酶降解;(3)靶向性較好,在病灶部位富集量高;(4)細(xì)胞攝取量高;(5)被細(xì)胞攝取之后能夠快速高效地從內(nèi)涵體中逃逸出來。因此,非病毒載體尤其是納米載體,由于其較好的生物相容性、低的免疫原性以及容易被大規(guī)模制備等特點(diǎn),成為核酸載體選擇的新起之秀[27]。

        以惡性腫瘤為例,研究者們基于實(shí)體瘤組織特殊的生理微環(huán)境[28-29],如:弱酸、缺氧環(huán)境、特定酶如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的過度表達(dá)、腫瘤細(xì)胞中存在高水平的反應(yīng)活性氧(ROS)以及高濃度的還原性物質(zhì)如谷胱甘肽(GSH)等特點(diǎn),構(gòu)建了一系列腫瘤微環(huán)境響應(yīng)型納米載體。例如:本團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)合成的一種包含酸響應(yīng)基團(tuán)的腫瘤組織弱酸性響應(yīng)納米材料Meo-PEG-b-PHMEMA[30],該材料的pKa為6.9接近腫瘤組織pH(6.5~6.8)。該納米載體上的親水性的PEG 外殼能夠大大延長(zhǎng)siRNA的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間[31],當(dāng)納米載體利用腫瘤組織的高滯留效應(yīng)(EPR 效應(yīng))富集到腫瘤組織后,PHMEMA 鏈被質(zhì)子化導(dǎo)致納米結(jié)構(gòu)的解散[32],疏水性的內(nèi)殼siRNA 與兩親性功能肽TCPA 復(fù)合物釋放出來,隨后TCPA 一方面利用其結(jié)構(gòu)中的RGD肽序列攜帶siRNA 靶向腫瘤細(xì)胞,另一方面利用其結(jié)構(gòu)中具有膜穿透功能的寡聚精氨酸序列協(xié)助siRNA 的內(nèi)涵體逃逸,達(dá)到基因沉默從而抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的;除此之外研究者還利用乏氧響應(yīng)基團(tuán)2-硝基咪唑[33]、偶氮苯基團(tuán)[34]設(shè)計(jì)了一系列乏氧響應(yīng)型納米載體;由于腫瘤組織中基質(zhì)金屬蛋白酶的活性較高,WANG 等[35]設(shè)計(jì)合成了一種基質(zhì)金屬蛋白酶-2/9(MMP-2/9)響應(yīng)的兩親型高分子材料聚乙二醇-聚己內(nèi)酯(PEG-PCL)向腫瘤部位遞送siRNA;依據(jù)苯硼酸或苯硼酸酯的ROS響應(yīng)性,LI 等[36]設(shè)計(jì)制備了一種苯硼酸修飾的ROS 響應(yīng)的納米載體用于siRNA 的體內(nèi)遞送和結(jié)腸癌治療;同時(shí)基于腫瘤細(xì)胞內(nèi)一些抗氧化物質(zhì)(如GSH)表達(dá)較高[37],本團(tuán)隊(duì)[38-39]設(shè)計(jì)合成一種GSH 響應(yīng)的Cys-PDSA 納米載體,用于MYC siRNA(siMYC)或Kinesin family member 11 siRNA(siKIF11)的體內(nèi)遞送和前列腺癌治療。

        3 總結(jié)與展望

        將核酸藥物安全高效的遞送入細(xì)胞并發(fā)揮其編輯、剪接、替換或抑制的功能,實(shí)現(xiàn)致病基因的長(zhǎng)期抑制以及抑病基因的過表達(dá),是一種理想的治療方案。從1990年第一次將基因?qū)爰?xì)胞并成功表達(dá),到如今已經(jīng)有多種核酸藥物經(jīng)過審批并應(yīng)用于臨床治療。核酸藥物在化學(xué)修飾、遞送載體等方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn),除小分子藥物和抗體藥物外,核酸藥物正在被建立成為第三種治療模式。利用核酸藥物不同于常規(guī)藥物的特點(diǎn),能夠針對(duì)性選擇靶點(diǎn),對(duì)一些不存在治療藥物的罕見疾病開發(fā)出核酸藥物。但是到目前為止,核酸藥物依然沒有被廣泛應(yīng)用于各類疾病的治療。希望研究者們對(duì)生物學(xué)的進(jìn)一步了解能夠幫助克服與核酸藥物相關(guān)的挑戰(zhàn),并在不久的將來增加新的治療選擇。

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