黃婷婷 黎俏 袁慧珍 王欣榮 劉艷秋

江西省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心（南昌 330006）

出生缺陷是指嬰兒在出生前所發(fā)生的結(jié)構(gòu)、功能或者代謝異常等，導(dǎo)致出生缺陷的常見原因之一為染色體異常。傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)可檢測出染色體數(shù)目和大片段結(jié)構(gòu)異常，是產(chǎn)前診斷胎兒染色體異常的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但該技術(shù)需經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)導(dǎo)致檢測周期長、分辨力低且無法檢出染色體片段小于5 Mb 的拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）［1-2］。染色體微陣列分析（chromosome microarray analysis，CMA）則能在全基因組亞顯微水平上檢測出1 kb 以上的CNVs，從而彌補(bǔ)傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)上的不足，增加異常染色體的檢出率，被逐漸應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［3-4］。但CMA 在產(chǎn)前診斷臨床應(yīng)用中的具體價值評估則需要更大量的數(shù)據(jù)支持。本研究通過回顧性分析4 854 例胎兒樣本的染色體核型分析及CMA 檢測結(jié)果，比較兩種方法優(yōu)缺點，為更好地產(chǎn)前遺傳咨詢和對胎兒進(jìn)行預(yù)后評估提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 取2020年1月至2021年12月因不同指征在江西省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心行介入性產(chǎn)前診斷的孕婦4 854 例。獲取的胎兒樣本同時行染色體核型分析及CMA 檢測，在產(chǎn)前診斷術(shù)前孕婦及家屬進(jìn)行詳細(xì)遺傳咨詢并簽署知情同意書。

1.1.2 有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷指征 有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷指征主要有：血清學(xué)生化篩查或無創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測高風(fēng)險；胎兒超聲軟指標(biāo)陽性或結(jié)構(gòu)異常，孕婦高齡（預(yù)產(chǎn)期年齡≥35 周歲）；夫婦之一染色體異常；異常孕產(chǎn)史及醫(yī)師認(rèn)為需進(jìn)行產(chǎn)前診斷的其他情況等。

1.2 方法

1.2.1 介入性產(chǎn)前診斷 根據(jù)指征，排除介入性產(chǎn)前診斷禁忌證后，對不同孕周夫婦選擇合適的介入性產(chǎn)前診斷方案（經(jīng)腹絨毛活檢術(shù)、羊膜腔穿刺術(shù)或臍靜脈穿刺術(shù)），所有孕婦及家屬均行遺傳咨詢并簽署知情同意書。

1.2.2 染色體核型檢查 在無菌條件下將產(chǎn)前診斷術(shù)后獲得的胎兒樣本經(jīng)細(xì)胞接種、培養(yǎng)、收獲、制片、G 顯帶后上機(jī)，分析5 個核型，至少計數(shù)20 個細(xì)胞分裂相，必要時增加計數(shù)量。

1.2.3 CMA 根據(jù)基因芯片實驗操作流程對所獲得的胎兒樣本全基因組DNA 進(jìn)行分析處理。參照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)會（ACMG）和臨床基因組資源（ClinGen）對CNVs 結(jié)果進(jìn)行致病性解讀，目前分五類［5］：致病性CNVs（pCNVs）、可能致病性CNVs（lpCNVs）、臨床意義未明CNVs（VUS）、可能良性CNVs 和良性CNVs。必要時抽取父母外周血樣本行CMA 驗證，有助于胎兒預(yù)后分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用Excel 表格記錄所有數(shù)據(jù)，SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理。計數(shù)資料以例數(shù)或百分?jǐn)?shù)（%）表示，應(yīng)用χ2檢驗對不同組間的差異進(jìn)行比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢出的胎兒異常染色體分類情況 共4 854例孕婦因不同指征于我院行有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，通過CMA 聯(lián)合染色體核型分析共檢出848 例染色體異常，其中540 例為致病性染色體異常，致病性染色體異常檢出率達(dá)11.12%（540/4 854）。致病性染色體異常中除染色體非整倍體外CMA 檢出151 例pCNVs 和可能致病性CNVs，檢出率為3.11%（151/4 854），其中108 例為染色體核型正常，CMA 檢出異常，故CMA 增加胎兒致病性染色體異常檢出率為2.22%（108/4 854）；CMA 還檢出VUS 224 例，占比26.42%。染色體核型分析檢出75例染色體平衡重排（易位/倒位/插入）等，CMA 正常（表1）。

表1 胎兒異常染色體檢出情況Tab.1 Detection of fetal abnormal chromosomes

2.2 不同產(chǎn)前診斷指征CMA 檢出pCNVs 及可能致病性CNVs 情況 CMA 檢出的151 例pCNVs 和可能致病性CNVs 孕婦產(chǎn)前診斷指征不同，主要為胎兒超聲異常83 例，占比54.97%。胎兒超聲異常為結(jié)構(gòu)異常及超聲軟指標(biāo)陽性，胎兒超聲軟指標(biāo)包括：單臍動脈、鎖骨下動脈迷走、鼻骨發(fā)育不良，心室強(qiáng)光點，腎集合管分離，腎臟回聲增強(qiáng)，脈絡(luò)叢囊腫、側(cè)腦室增寬及長骨稍短等等；其次為無創(chuàng)DNA 產(chǎn)前檢測高風(fēng)險30 例，占比19.87%；血清學(xué)篩查高風(fēng)險14 例，占比9.27%。見表2。

表2 pCNVs 及可能致病性CNVs 產(chǎn)前診斷指征分析Tab.2 Analysis of prenatal diagnosis indications of pCNVs and possible pathogenic CNVs

2.3 染色體核型分析與CMA 結(jié)果不一致情況分析 染色體核型分析與CMA 結(jié)果不一致9 例，其中5 例為染色體核型未見明顯異常，而CMA 提示為不同染色體非整倍體嵌合體，其中4 例終止妊娠，1 例為性染色體46，XX 與47，XXX 嵌合體，目前隨訪中；染色體核型分析發(fā)現(xiàn)3 例額外小標(biāo)記染色體（small supernumerary marker chromosome，sSMC），其中1 例為嵌合體，經(jīng)CMA 檢測2 例未見明顯異常，遺傳咨詢后繼續(xù)妊娠結(jié)局良好，1 例明確該變異位于4p16.3q12 及8p23.3p23.1 處，4p16.3q12重復(fù)片段約56.23 Mb（pCNVs），8p23.3p23.1 重復(fù)片段約8.88 Mb（VUS），經(jīng)遺傳咨詢后選擇終止妊娠。見表3。

表3 染色體核型分析與CMA 結(jié)果不一致情況Tab.3 Inconsistency between chromosome karyotype analysis and CMA results

3 討論

染色體異常是導(dǎo)致出生缺陷的重要原因，包括染色體數(shù)目異常和染色體結(jié)構(gòu)異常［6］，如13、18、21-三體綜合征及微缺失微重復(fù)綜合征（micro-deletion and microduplication syndromes，MMS）等。MMS 是由于染色體微結(jié)構(gòu)改變所導(dǎo)致的微小片段的缺失和重復(fù)，主要是由于特定染色體區(qū)域的CNVs 而引起的，目前已明確由CNVs 所致的染色體微缺失及微重復(fù)綜合征有300 余種［7］，傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷方法是對有產(chǎn)前診斷指征的孕婦進(jìn)行絨毛活檢、羊膜腔穿刺、臍靜脈穿刺、胎兒活檢等獲取胎兒細(xì)胞行染色體核型分析，常規(guī)染色體核型分析會漏診5 Mb 以下的CNVs 所致的出生缺陷［8］。CMA 技術(shù)分辨率高，可用于未經(jīng)培養(yǎng)的DNA 樣本，檢測周期短，自動化程度較高，彌補(bǔ)了核型分析的不足［9］。在染色體核型分析正常但超聲提示有結(jié)構(gòu)異常的胎兒中，發(fā)現(xiàn)存在6%～7%明確致病或可能致病的CNVs［10］。本研究中共4 854 例孕婦因不同指征于我院行有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷，通過CMA 聯(lián)合染色體核型分析共檢出848 例染色體異常，其中540 例為致病性染色體異常，致病性染色體異常檢出率達(dá)11.12%（540/4 854）。致病性染色體異常中除染色體非整倍體外CMA 檢出151 例pCNVs，檢出率為3.11%（151/4 854），其中43 例為染色體核型分析及CMA 均檢出異常，108 例為染色體核型正常，CMA 異常，CMA 增加胎兒致病性染色體異常檢出率為2.22%（108/4 854）。

2013年CMA 技術(shù)己被美國婦產(chǎn)科學(xué)會和母胎醫(yī)學(xué)協(xié)會推薦作為一線檢測技術(shù)應(yīng)用于存在產(chǎn)前超聲結(jié)構(gòu)畸形的胎兒中［11］；我國2014年的CMA技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識中也提出，當(dāng)超聲提示胎兒存在結(jié)構(gòu)異常時應(yīng)在使用染色體核型分析技術(shù)基礎(chǔ)上同時應(yīng)用CMA，這樣可以提高pCNVs 的檢出率；同時推薦當(dāng)胎兒出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常時，CMA 可作為一線檢測手段［12］。有研究［13-14］發(fā)現(xiàn)，在骨骼發(fā)育異常胎兒中聯(lián)合使用CMA 對pCNVs 檢出率較單純傳統(tǒng)染色體核型分析增加8.7%～16%。有數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)胎兒出現(xiàn)單一中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常時，pCNVs 檢出率為5.86%，當(dāng)胎兒出現(xiàn)多個中樞神經(jīng)系統(tǒng)異?；蚝喜⑵渌Y(jié)構(gòu)異常時，pCNVs 檢出率為12.3%［15］。在超聲提示胎兒存在先天性心臟病時，CMA 可增加3.0%的pCNVs 或lpCNVs 檢出率［16］。在本研究中CMA 檢出151 例pCNVs，其中83 例產(chǎn)前診斷指征為胎兒超聲結(jié)構(gòu)異?；蛱撼曑浿笜?biāo)陽性，占比54.97%（83/151）。

本研究中發(fā)現(xiàn)有染色體核型分析與CMA 結(jié)果不一致情況，其中5 例為染色體核型未見明顯異常，而CMA 提示為不同染色體非整倍體嵌合體，其中4 例終止妊娠，1 例為性染色體46，XX 與47，XXX 嵌合體，孕婦及家屬經(jīng)過遺傳咨詢后考慮繼續(xù)妊娠，妊娠結(jié)局目前仍在隨訪中；1 例為核型提示7 號染色體三體嵌合體，嵌合比例22%，為單瓶生長，但CMA 結(jié)果未見明顯異常，經(jīng)遺傳咨詢后，孕婦及家屬決定繼續(xù)妊娠，隨訪妊娠結(jié)局良好，新生兒正常。染色體核型分析與CMA 結(jié)果不一致可能與核型分析需要細(xì)胞培養(yǎng)有關(guān)，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中存在細(xì)胞克隆優(yōu)勢生長情況，造成染色體數(shù)目異常的假性嵌合或嵌合比例不真實，而未經(jīng)培養(yǎng)的胎兒組織進(jìn)行CMA 檢查更能說明嵌合真實情況［17］。CMA 計算出的嵌合比例與采用的探針密度相關(guān)，不能檢出低比例的嵌合體。在產(chǎn)前診斷應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的染色體核型分析聯(lián)合CMA技術(shù)可以增加染色體嵌合體的檢出率［18］。

sSMC 是指存在結(jié)構(gòu)異常的染色體，異常片段來源無法通過常規(guī)染色體核型分析辨別［19］。有報道sSMC 在新生兒中的檢出率約為0.44‰，在產(chǎn)前診斷胎兒中的發(fā)生率為0.75‰［20］。LIEHR 等［21］認(rèn)為，sSMC攜帶者的臨床表型與sSMC 攜帶的基因劑量效應(yīng)及印記介導(dǎo)的表觀遺傳相關(guān)，當(dāng)核型分析發(fā)現(xiàn)胎兒為sSMC 攜帶時，須行染色體微陣列分析檢測或高通量測序，以便能更準(zhǔn)確地判斷sSMC來源及致病性。本研究染色體核型分析發(fā)現(xiàn)3 例sSMC，其中1 例為嵌合體，但無法檢測其額外染色體的來源及致病性，經(jīng)CMA 檢測2 例未見明顯異常，遺傳咨詢后繼續(xù)妊娠結(jié)局良好，1例明確該變異位于4p16.3q12及8p23.3p23.1 處，4p16.3q12 重復(fù)片段約56.23 Mb，累及183 個OMIM 基因。涉及染色體大片段的重復(fù)，不排除胎兒可能會具有染色體病的常見臨床表型，綜合考慮為pCNVs；8p23.3p23.1重復(fù)片段約8.88 Mb，根據(jù)當(dāng)前數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)資料，綜合考慮為VUS，結(jié)合其超聲提示胎兒主動脈弓縮窄，透明隔欠清，最后經(jīng)遺傳咨詢后孕婦及家屬決定終止妊娠。CMA 可對未知來源sSMC 進(jìn)行檢測，明確該遺傳物質(zhì)來源及片段大小，更好地指導(dǎo)臨床進(jìn)行遺傳咨詢［22］。

本研究中染色體核型分析發(fā)現(xiàn)75 例平衡重排（易位/倒位/插入）攜帶者，而CMA 未見明顯異常。平衡重排一般不影響妊娠結(jié)局，但如果父母中的一方是攜帶者，對未來的妊娠仍有生殖影響［23］。CMA 技術(shù)在染色體平衡重排等檢測方面存在一定的局限性，也被視為不能完全替代傳統(tǒng)核型分析技術(shù)的重要原因之一。同時隨著CMA 技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用，會增加VUS 的檢出率［24］，VUS 是指CNVs 在目前已知數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)資料中未找到對應(yīng)的片段，且片段內(nèi)含有的基因功能不明確，與臨床表型相關(guān)性也不明確，對VUS 的判讀和解釋仍面臨很大困難及挑戰(zhàn)，增加孕婦及家屬的焦慮，甚至可能造成健康胎兒妊娠的終止。

綜上，染色體核型分析聯(lián)合CMA 可以增加異常染色體檢出率［25］，兩種技術(shù)相輔相成，為產(chǎn)前診斷及遺傳咨詢提供更準(zhǔn)確及詳細(xì)的信息。CMA 技術(shù)在產(chǎn)前診斷臨床應(yīng)用中，需通過數(shù)據(jù)的不斷累積，增強(qiáng)對檢測到的CNVs 進(jìn)行致病性判讀能力，提高數(shù)據(jù)的可信度。