李 晶，張夢瑤，劉開東，柳 楠，賀建寧

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.曲阜市畜牧獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)中心，山東 曲阜 273100；3.青島畜牧獸醫(yī)研究所，山東 青島 266121)

敖漢細毛羊是我國很早培育出的細毛羊品種，它主要分布在東北部地區(qū)，是我國最具有代表性的細毛羊之一[1]，其羊毛是紡織工業(yè)的重要原料。敖漢細毛羊毛囊的結(jié)構(gòu)和特性直接決定毛發(fā)品質(zhì)和商業(yè)價值[2]，毛囊擁有著相對復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，它的形成是由多種細胞來協(xié)同完成的。毛囊通過一系列的分化生長最后成為羊毛，其生長發(fā)育也有些復(fù)雜，它是由多種因子來相互調(diào)節(jié)，因此,通過研究相關(guān)因子來探討毛囊的生長發(fā)育顯得尤為重要。

Hox家族在生物體內(nèi)是一類與發(fā)育調(diào)控相關(guān)十分重要的基因。Hox家族這類轉(zhuǎn)錄因子都是高度保守的[3]，對毛囊細胞增殖分化也起著十分重要的作用[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚和毛囊生長發(fā)育過程中Hox家族基因起到了主導(dǎo)作用[6]，Hoxa5主導(dǎo)了皮膚細胞增殖、分化與凋亡[5]，對毛囊退行期進行了調(diào)控，并誘導(dǎo)了細胞分化[7]。動物形態(tài)的進化和多樣性與Hox基因數(shù)目、序列及其表達方式密切相關(guān)，已有研究結(jié)果表明，當(dāng)Hox家族基因發(fā)生變化時，動物在被毛生長時會表現(xiàn)出缺陷[8]。BMP6基因是TGF-β超家族中的一員[9-10]，TGF通路中的許多轉(zhuǎn)錄因子都受BMP6調(diào)控，均表現(xiàn)出上調(diào)和下調(diào)趨勢。楊燕燕等[11]在生殖發(fā)育上對BMP6進行了研究，它控制著羊的多胎，尤其是在發(fā)情期基因表達相當(dāng)明顯。也有研究表明，BMPs通路中的轉(zhuǎn)錄組因子對毛囊發(fā)育主要表現(xiàn)出抑制作用，而它的下游靶標(biāo)BMPRs主要表現(xiàn)出促進的作用[12-13]。程旭等[14]通過對鐵調(diào)素在BMP6-HJV-SMAD信號通路的作用，驗證了BMP6的重要性。由此可見，Hoxa5和BMP6基因都能抑制毛囊生長，但二者之間的關(guān)系鮮有報道。

對于家畜皮膚毛囊的一些研究大多集中在單個基因的功能驗證上，還有一些是與骨的調(diào)節(jié)、繁殖等與皮膚毛囊無關(guān)的研究，本試驗主要的側(cè)重點是利用同源重組技術(shù)構(gòu)建表達載體通過與單、共轉(zhuǎn)染比較基因表達量的變化來研究Hoxa5和BMP6之間的作用關(guān)系，旨在為更深層次上研究毛囊功能基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

健康的30日齡胎羊由青島畜牧所奧特種羊場提供；TRIzol、KpnⅠ、倒置顯微鏡、熒光定量PCR等均購自Bio-Rad公司[9]。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 選取綿羊Hoxa5基因(GenBank登錄號為NM-001009431.1)CDS區(qū) 和BMP6基因(GenBank登錄號為NM-001110277.1)CDS區(qū)，軟件導(dǎo)入pcDNA3.1表達載體的序列，通過Snap Gene設(shè)計Hoxa5基因和BMP6基因上下游引物，序列分別如下：

F(Hoxa5)：5′-ATGCGTTAACTCAGGAATCGGATGCATCGGTCAAGCTGGCAT-3′；R(Hoxa5)：5′-TGGCCTTAAAATCTCCGAGGAAATACTCGCTCACGCGGTAG-3′。F(BMP6)：5′-TTACGGGCATCGGTAGGGAAATTCGTATTGCATGCAAAGCT-3′；R(BMP6)：5′-TGTCCGAGACCTGCACATCCACGGCGGCCCTTCAGCATACCCCTA-3′。擴增體系：20 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，Mix 17 μL。

1.2.2 pcDNA3.1與Hoxa5、BMP6基因同源重組 對Hoxa5、BMP6進行切膠，用KpnⅠ對pcDNA3.1進行單酶切，體系：KpnⅠ 1 μL，pcDNA3.1 5 μL，Buffer 5 μL，ddH2O 39 μL。通過電泳對BMP6、Hoxa5基因片段及pcDNA3.1進行膠回收，SoSo連接體系：BMP6、Hoxa5基因上、下游引物各1 μL，pcDNA3.1 1 μL，SoSo 5 μL，ddH2O 3 μL，轉(zhuǎn)化DH5α，過夜對菌液進行振蕩培養(yǎng)，將菌液生長良好的送往公司進行測序[12-13]。

1.2.3 胎兒成纖維細胞培養(yǎng) 在細胞室將30日齡胎羊從母羊子宮內(nèi)取出，先用75%的酒精對胎兒進行消毒，再用PBS將胎兒表面的酒精沖洗掉。在培養(yǎng)皿中用手術(shù)刀將胎兒的頭部和四肢、內(nèi)臟等全部剔除，只用胎羊的軀干，將其剪碎，分布在培養(yǎng)皿中，在每一個肌肉塊上面加2滴已經(jīng)預(yù)熱的胎牛血清，放進CO2培養(yǎng)箱(37 ℃，5.0% CO2)，24 h對其進行觀察并且換液[15-16]。

1.2.4 細胞轉(zhuǎn)染 細胞進行傳代以后，等密度再次達到95%左右時，借助轉(zhuǎn)染試劑對重組的載體進行瞬時轉(zhuǎn)染。取脂質(zhì)體20 μL，PBS 480 μL，加入到無菌的離心管中并混勻，靜置5 min。進一步進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時分為2組，分別是共轉(zhuǎn)染組和單轉(zhuǎn)染組，共轉(zhuǎn)染組中加入Hoxa5、BMP6質(zhì)粒各20 μL，單轉(zhuǎn)染組加入Hoxa5質(zhì)粒40 μL或者BMP6質(zhì)粒40 μL，2組均加入PBS 460 μL，具體詳細操作步驟參照Lipofectamine2000說明書[17]。

1.2.5 細胞轉(zhuǎn)染后的qPCR 重組載體轉(zhuǎn)染成纖維細胞后需要進一步的增殖培養(yǎng)，當(dāng)密度達到95%左右時，對成纖維細胞的RNA進行提取，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA[18]。使用Snap Gene軟件對Hoxa5、BMP6和GAPDH基因進行qPCR引物設(shè)計，序列見表1。

表1 引物信息Tab.1 Primers information

qPCR反應(yīng)條件：95 ℃反應(yīng)7 min；95 ℃ 40 s，60 ℃退火40 s，35個循環(huán)；72 ℃ 30 s，4 ℃保存。每組3個生物學(xué)重復(fù)，對數(shù)據(jù)利用Ct(2-ΔΔCt)公式進行計算，得出Hoxa5、BMP6的相對表達量。借助SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性的分析，以P<0.01作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)[17]。

1.2.6 Hoxa5、BMP6蛋白表達的檢測 提取成纖維細胞中的組蛋白，進行Western Blot，首先進行轉(zhuǎn)膜，后進行封閉，時長2 h；進行一抗、二抗的孵育，均對抗體進行2 000倍的稀釋。孵育完成后利用1∶1的曝光液進行曝光拍照[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hoxa5、BMP6基因PCR擴增

以cDNA為模板，添加引物進行PCR 擴增獲取Hoxa5、BMP6基因片段。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明(圖1)，Hoxa5基因條帶在圖中804 bp處，BMP6基因條帶在圖中537 bp處，都與目的基因CDS區(qū)大小吻合，可用于后期的試驗。

M.2000 Marker；1.Hoxa5基因擴增片段(804 bp)；2.BMP6基因擴增片段(537 bp)。M.2000 Marker；1.Hoxa5 product(804 bp)；2.BMP6 product(537 bp).

2.2 pcDNA3.1表達載體酶切純化

使用KpnⅠ將pcDNA3.1表達載體從環(huán)狀酶切成鏈狀，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測是否酶切成功(圖2)。1，2是對pcDNA3.1的KpnⅠ單酶切，pcDNA3.1長度為5 428 bp，圖中條帶所在位置約是5 428 bp，結(jié)果顯示酶切完成，回收條帶進行重組。

圖2 pcDNA3.1載體單酶切鑒定Fig.2 Single enzyme digestion identification of pcDNA3.1 vector

2.3 pcDNA3.1表達載體的重組及鑒定

將pcDNA3.1酶切成鏈狀后，用SoSo試劑盒將BMP6、Hoxa5分別與pcDNA3.1相連接，轉(zhuǎn)化，振蕩培養(yǎng)，進行菌液PCR驗證如圖3所示，在約804 bp處有明亮電泳條帶，是Hoxa5基因；537 bp處的是BMP6基因。菌液測序結(jié)果用Blast進行對比，結(jié)果如圖4，說明BMP6、Hoxa5沒有堿基的突變，已成功的連接到pcDNA3.1載體上。將連接好的重組載體從菌液中提取出來，如圖5所示，1-2為pcDNA3.1-BMP6重組質(zhì)粒，大小為5 965 bp，3-4為pcDNA3.1-Hoxa5重組質(zhì)粒，大小為6 232 bp，與圖中條帶相符。

M.2000 Marker；1，4.BMP6菌液PCR；2，3.Hoxa5菌液PCR。M.2000 Marker；1，4.BMP6 bacterial PCR；2，3. Hoxa5 bacterial PCR.

2.4 細胞培養(yǎng)觀察

對胎兒成纖維細胞的生長情況進行觀察記錄(圖6)，24 h能夠觀察到細胞已經(jīng)開始貼到培養(yǎng)皿底部，周圍也有一些漂浮的組織。培養(yǎng)至96 h后，密度再次達到95%左右，此時即可對原代細胞進行傳代[18]。

2.5 RT-PCR檢測Hoxa5、BMP6基因mRNA表達

對引物進行驗證，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖7)表明，引物擴增效果良好，沒有出現(xiàn)二聚體等雜物，在128 bp 處的是內(nèi)參基因GAPDH，在186 bp處的是Hoxa5基因，在116 bp處的是BMP6基因，綜上可得引物均可用于實時熒光定量PCR試驗。

圖4 BMP6(上)和Hoxa5(下)表達載體菌液的測序比對Fig.4 Sequencing comparison of BMP6 (up) and Hoxa5 (down) expression vector bacilli

M.10000 Marker；1-2.pcDNA3.1-BMPR6；3-4.pcDNA3.1-Hoxa5。M. 10000 Marker；1-2. pcDNA3.1-BMPR6 recombinant plasmids；3-4. pcDNA3.1-Hoxa5 recombinant plasmids

圖 8，9分別為Hoxa5、BMP6和GAPDH的qPCR過程中的擴增曲線、熔解曲線，兩線效果顯示均良好，在qPCR過程中沒有出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物。對2組的mRNA表達進行差異顯著性分析(圖10)，分析顯示Hoxa5與BMP6共轉(zhuǎn)染后的Hoxa5基因相對表達量極顯著低于單轉(zhuǎn)染(P<0.01)，而共轉(zhuǎn)染后的BMP6基因相對表達量在共轉(zhuǎn)染卻極顯著高于單轉(zhuǎn)染(P<0.01)。

圖6 成纖維細胞原代(左)、傳代(右)培養(yǎng)(×100)Fig.6 Primary (left) and passage (right) culture of fibroblasts (×100)

A：M.500 Marker；1-2.內(nèi)參基因GAPDH；B：M.500 Marker；1-2.目的基因BMP6；C：M.500 Marker；1-2.目的基因Hoxa5。A：M.500 Marker；1-2 .Reference gene GAPDH；B：M. 500 Marker；1-2.Target gene BMP6；C：M.500 Marker；1-2. Target gene Hoxa5.

圖8 Hoxa5、BMP6和GAPDH 熔解曲線Fig.8 Hoxa5，BMP6 and GAPDH melting curves

圖9 Hoxa5、BMP6和GAPDH擴增曲線 Fig.9 Hoxa5， BMP6 and GAPDH amplification curve

2.6 Hoxa5、BMP6蛋白表達的檢測

對Hoxa5、BMP6基因的共轉(zhuǎn)染、單轉(zhuǎn)染蛋白的表達(圖11)進行比較分析，從灰暗度以及條帶的大小，使用ImageJ和SPSS軟件進行分析，Hoxa5與BMP6共轉(zhuǎn)染后的Hoxa5蛋白表達量極顯著低于單轉(zhuǎn)染過程(P<0.01)，而共轉(zhuǎn)染的BMP6蛋白表達量卻極顯著高于單轉(zhuǎn)染過程(P<0.01)(圖12)，這與mRNA相對表達量的結(jié)果一致。

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。圖12同。Different capital letters indicate extremely significant difference(P<0.01).The same as Fig.12.

圖11 Hoxa5、BMP6蛋白表達 Fig.11 Hoxa5 and BMP6 expression protein

圖12 Hoxa5、BMP6蛋白相對表達量Fig.12 Relative expression of Hoxa5 and BMP6 protein

3 討論

許多研究表明，毛囊的發(fā)育依靠一系列的信號分子，這些信號分子在真皮細胞和上皮細胞間穿梭著，介導(dǎo)了這2個細胞群體間的相互作用，毛囊能夠穩(wěn)定的進行發(fā)育全靠這兩者的介導(dǎo)。毛囊的形成過程中離不開所謂的原始信號，此信號來源于真皮下[18]，并且在真皮下去激活Wnt信號[19-20]。目前，許多信號通路都參與毛囊的發(fā)育，最常見的有Wnt通路、FGF家族、BMP家族、TGF家族[21]等。Botchkarev等[22]利用小鼠來研究BMPs在皮膚中的表達位置以及表達時期，表明BMPs家族基因?qū)γ业陌l(fā)育存在著一定的抑制作用。BMP6基因和BMP4一樣同屬于BMP家族，是一種抑制毛囊發(fā)育的信號分子，Hoxa5基因是TNF家族中尤為重要的基因，同樣也是一種抑制毛囊發(fā)育的信號分子，兩基因?qū)γ业陌l(fā)育均有抑制作用[23]。在信號通路中，BMP家族中的信號分子對TNF通路中信號分子有干涉作用，有些是輔助基因的表達，有些是抑制基因的表達?，F(xiàn)在對單個基因功能的驗證普遍存在，多個基因相互作用還是尤為少見，本研究通過利用同源重組手段來驗證多基因相互之間的作用，幫助篩選相關(guān)基因，有助于后期育種和羊毛生產(chǎn)。

為探討Hoxa5、BMP6基因在細胞水平上是否存在互作效應(yīng)，本研究利用同源重組技術(shù)，快速構(gòu)建了pc-DNA3.1-Hoxa5、pc-DNA3.1-BMP6表達載體，并通過共轉(zhuǎn)染、單轉(zhuǎn)染后基因mRNA、蛋白表達量的比較分析，發(fā)現(xiàn)Hoxa5基因有促進BMP6基因表達，BMP6基因有抑制Hoxa5基因表達的現(xiàn)象。本研究在構(gòu)建表達載體過程中所用同源重組技術(shù)較傳統(tǒng)的T克隆技術(shù)節(jié)約了時間，減少了堿基突變；同時由分子水平到細胞水平得到了Hoxa5和BMP6基因的互作關(guān)系，一方面驗證了與羊毛生長有關(guān)的基因，為信號通路的解析添加了論證，另一方面為進一步在個體水平上驗證其功能奠定基礎(chǔ)。