王長龍，張 力，羅立新，王 慧，郭 濤，劉永柱，周繼勇，陳志強，肖武名

(1.華南農業(yè)大學，國家植物航天育種工程技術研究中心，廣東 廣州 510642；2.廣東省農業(yè)技術推廣總站，廣東 廣州 510520)

水稻(OryzasativaL.)是重要的糧食作物之一，在大田生產中經常遭受各種非生物脅迫的影響，挖掘耐逆基因具有一定的研究意義。非生物逆境脅迫一般情況下包括干旱、高鹽、低氧、極端溫度，通常會導致生物體內一系列的生理生化和分子變化，主要是通過改變蛋白質的功能進而對農業(yè)生產造成嚴重威脅，對植物生長和生產均產生不利影響，因此保持蛋白質的正常功能構象對于在應激條件下的細胞存活至為重要[1-2]。

熱激蛋白(Heat shock proteins，HSPs)是一類在逆境脅迫下特別是高溫誘導下在生物體內迅速合成的蛋白質，可以通過與靶蛋白結合的形式來修復已經變性的蛋白質，在穩(wěn)定細胞結構、維持細胞正常生理代謝功能和提高抗逆性方面發(fā)揮著重要作用[3-5]。因此，熱激蛋白在植物生長發(fā)育和抗逆過程中起著重要作用。熱激蛋白在各種生物體內均廣泛存在[6]，根據HSPs分子量的大小，可分為5類：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSPs(Small heat shock proteins，分子量約15～50 ku，主要包含HSP20和HSP40)[7-8]。熱激蛋白可以作為分子伴侶參與蛋白質折疊，Chen等[9]研究發(fā)現HSP21作為分子伴侶蛋白通過與光系統(tǒng)Ⅱ復合體(Photosystem Ⅱ，PSⅡ)核心亞基蛋白(D1和D2等)的直接結合，維持高溫脅迫下PSⅡ復合體及類囊體膜的穩(wěn)定性，進而提高植物高溫脅迫下光合效率及存活率。Zou等[10]研究表明，熱激蛋白對不同逆境的響應具有多樣性，在不同逆境條件下可能存在不同調控模式。Lin等[11]研究表明，熱處理的水稻幼苗存在HAS32/HSP101轉錄后互作，從而延長熱鍛煉的效應。在擬南芥中，異源過表達OsHSP1會增加擬南芥耐熱性，熱脅迫下轉基因植株種子萌發(fā)率比對照更高；OsHSP1過表達植株對鹽和滲透脅迫更敏感[12]。OsHSP18.0-CI編碼一個小分子熱休克蛋白，OsHsp18.0-CI過表達株系對細菌性條斑病的抗性增強，抑制株系的抗性下降[13]。王瑩[14]研究了鹽脅迫對鹽敏感水稻品種武運粳8號根尖細胞程序性死亡的誘導效應，發(fā)現mtHSP70可能通過影響呼吸鏈復合物的穩(wěn)定性，進而調節(jié)線粒體內活性氧的產生。由此可見，熱激蛋白在植物應對逆境響應方面具有重要作用。

雖然對熱激蛋白的研究已經開展了幾十年，但是對于熱激蛋白與植物抗逆的認識仍然處于初步階段[15]，對于其內在的發(fā)生機制和分子機理方面的深入研究仍十分欠缺。華南農業(yè)大學國家植物航天育種工程技術研究中心通過圖位克隆鑒定到一個影響水稻葉寬、分蘗等株型性狀的基因NAL11，在線預測其編碼產物為一個Hsp40家族的熱激蛋白[16]。根據已有報道，熱激蛋白在植物應對逆境響應方面發(fā)揮著重要作用，NAL11基因是否也參與了植物逆境，闡明該基因在逆境方面的作用，有助于全面了解其功能。本研究用攜帶NAL11基因的粳型水稻品種02428及其近等基因系材料NIL-8(攜帶突變了的nal11基因)進行苗期逆境方面的研究，通過表型比較、生理指標測定及基因表達分析明確NAL11基因對于不同逆境脅迫的響應，擬探明其參與的逆境調控情況。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

本研究所用的水稻材料為粳型水稻品種02428(攜帶NAL11基因)及BC4F6近等基因系NIL-8(以02428作輪回親本培育而成，攜帶隱性基因nal11[16])，經56 K基因組芯片分析發(fā)現NIL-8與02428的遺傳背景一致性高達98.75%。將02428與NIL-8催芽萌發(fā)后均在相同的人工氣候箱中育苗，其中溫度脅迫用稻田土育苗，干旱和鹽脅迫采用國際水稻研究所水培營養(yǎng)液[17]培育幼苗，14 d后對02428與NIL-8的幼苗進行脅迫處理。為了較好地開展脅迫處理，前期采用不同的溫度梯度、鹽濃度梯度及15% PEG-6000的濃度梯度開展了預處理試驗。最后確定本研究的高溫脅迫處理為42 ℃，持續(xù)3 d；低溫脅迫處理為10 ℃，持續(xù)5 d；鹽脅迫為100 mmol/L NaCl的水培液處理3 d；模擬干旱脅迫采用15% PEG-6000的水培液處理3 d；均在上海啟前電子科技有限公司生產的二氧化碳人工氣候箱(貨號PRX-600C-CO2)中種植，光照12 h(光照強度為12 000 lx)、黑暗12 h。在處理的不同時間點取水稻葉片測定SPAD(Soil and plant analyzer develotrnent)、相對電導率、含水量、可溶性蛋白、CAT(Catalase)、SOD(Superoxide dismutase)等生理指標。

1.2 相關生理指標測定

葉綠素測定：隨機選取5株相對一致的幼苗標記后取完全展開的第二葉，利用點將(上海)科技股份有限公司生產的葉綠素測定儀(貨號SPAD-502)進行測定。

葉片含水量測定：將葉片從葉基部剪下，稱量鮮質量，隨后用錫箔紙包裹放入105 ℃殺青1 h，在80 ℃烘干至恒質量后稱取干質量，計算各葉片樣本含水量=(葉片鮮質量-葉片干質量)/葉片鮮質量×100%[18]。

相對電導率測定：將水稻葉片剪成1 cm長的碎片樣品，準確稱取0.1 g樣品，對應放入已編號的三角瓶中，加入10 ml無離子水在振蕩器上浸泡90 min。采用上海恒磁電子科技有限公司生產的電導儀(型號為DDS-11A型)測定初始電導率R1，然后沸水浴加熱30 min，冷卻至室溫后搖勻，再次測定浸提液的電導率R2。根據公式Ec=R1/R2×100%計算細胞傷害率，其中R1為煮沸前的初始電導率、R2為煮沸冷卻后的電導率[19]，3次生物學重復。

可溶性蛋白含量測定：取幼苗根上部分進行勻漿，采用生工BCA法微量蛋白濃度測定試劑盒(Micro BCA Protein Assay Kit，貨號C503061)進行測定，3次生物學重復。

SOD和CAT測定：取水稻葉片部分進行勻漿，分別采用南京建成生物科技有限公司SOD測定試盒(貨號A001-1)和CAT測定試劑盒(貨號A007-1)進行測定，3次生物學重復。

1.3 基因NAL11在不同逆境處理下的表達量分析

對02428在各種逆境處理下的不同時間點取樣，非處理的幼苗作為平行對照。分別采用GENEMARK試劑盒(貨號TR02)及TOYOBO公司的逆轉錄試劑盒(貨號FSK-100)提取總RNA并合成cDNA。在美國ABI公司StepOne定量PCR儀開展實時定量PCR分析，所用試劑為VAZYME公司的試劑(貨號SYBR Green Master Mix Q111-02)。水稻β-Actin基因(LOC_Os03g50885)作為內參。定量PCR分析的引物(5′-3′)分別為Actin-F：TCTCTCAGCACATTCCAGCA、Actin-R：AATCACAAGTGAGAACCACAG；NAL11-F：CTACACCACTCATAGCAGGACTCAC、NAL11-R：GAAAGCCACCTTCATAGAATTTGCG。定量PCR的反應體系為20 μL(10 μL的AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，正反引物(10 μmol/L)各0.4 μL，2 μL的模板，7.2 μL的ddH2O)，采用兩步法標準程序(擴增程序為95 ℃預變性30 s；95 ℃反應10 s，60 ℃反應30 s，40個循環(huán))；最后按照2-ΔΔCT法[20]分析目的基因的相對表達量及其標準差。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2016和Prism 7對數據進行處理和分析，每處理取5株進行分析、3次生物學重復，采用SPASS 19.0開展方差分析和t測試，取平均值±標準誤用于數據展示和繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同脅迫處理對水稻02428及NIL-8幼苗的影響

由圖1可知，42 ℃高溫處理3 d后，02428和NIL-8的葉片均表現出一定的黃化，但二者無明顯差異；經100 mmol/L NaCl處理3 d，二者均出現不同程度的萎蔫，但無明顯差異；10 ℃處理5 d后，02428及NIL-8葉片均呈現明顯的卷曲且葉尖干枯，常溫恢復培養(yǎng)7 d后所有幼苗全部枯死，二者無明顯差異；15% PEG-6000模擬干旱處理下，02428及NIL-8均出現明顯的葉片卷曲、葉尖萎蔫等癥狀，但02428萎蔫程度更嚴重，推測NIL-8的抗旱能力可能優(yōu)于02428。

2.2 脅迫處理對葉綠素含量的影響

葉綠素含量即SPAD值，與光合速率、作物營養(yǎng)狀況密切相關。一般情況下通過測定葉綠素含量以表征作物生長狀況。在不同脅迫處理期間，02428與NIL-8的葉片SPAD值均有所下降(圖2)，說明高溫、低溫、鹽害及模擬干旱均對植株的葉綠素合成造成了影響。高溫脅迫下，兩者葉片SPAD值在0～48 h均在下降，在48 h后下降幅度明顯加快，且在72 h表現出顯著差異(圖2-A)；低溫和鹽害脅迫下，02428和NIL-8的SPAD值均緩慢下降，兩者下降趨勢基本相同，兩者的SPAD值也無顯著差異(圖2-B、C)；15% PEG-6000處理下，兩者的SPAD值均下降較快，但在處理12 h以后，NIL-8的SPAD的含量始終高于02428，且差異達顯著水平(圖2-D)，說明模擬干旱脅迫對NIL-8葉綠素合成的影響較小，與其模擬干旱下的葉片萎蔫程度基本吻合。

2.3 脅迫處理對葉片含水量的影響

與對照相比，02428和NIL-8的葉片含水量在4種逆境脅理下均呈下降趨勢(表1)。42 ℃高溫處理3 d時，02428的葉片含水量從81.07%降低至74.64%，下降了6.43百分點，NIL-8的葉片含水量從80.93%降低至74.38%，下降了6.55百分點，兩者下降幅度差異不顯著。10 ℃低溫處理3 d時，02428的葉片含水量從81.07%降低至65.55%，下降了15.52百分點，NIL-8的葉片含水量則從80.93%降低至65.11%，下降了15.82百分點，兩者下降幅度差異也不顯著。100 mmol/L NaCl處理3 d時，02428的葉片含水量從80.78%降低至64.39%，下降了16.39百分點，NIL-8的含水量則從79.83%降低至72.25%，下降了7.58百分點，下降幅度低于02428，且處理后NIL-8的葉片含水量仍顯著高于02428。15% PEG-6000處理3 d時，02428的葉片含水量從80.78%降低至70.17%，下降了10.61百分點，NIL-8的含水量則從79.83%降低至72.41%，下降了7.42百分點，下降幅度低于02428。由此可知，在高溫和低溫處理下，02428與NIL-8含水量下降幅度基本相當，而在鹽處理和模擬干旱處理下NIL-8的葉片含水量下降幅度均小于02428，說明NIL-8在處理后仍能保持相對較高的葉片含水量。

同一張圖片的左邊植株為02428，右邊植株為NIL-8；標尺為2 cm。The plants in the left side of the same picture are 02428，and the plants in the right side are NIL-8； Scale bar = 2 cm.

不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。圖3-4同。Different small letters indicates significant difference among treatments at 0.05 level.The same as Fig.3-4.

表1 不同脅迫處理下02428和NIL-8的葉片含水量Tab.1 The water content in the leaves of 02428 and NIL-8 under different stress treatments %

2.4 脅迫處理對葉片相對電導率的影響

葉片相對電導率也被稱為細胞膜相對透性，在一定情況下能夠反映出植物的受傷害程度。隨著逆境處理的進行，葉片相對電導率逐漸增大，說明逆境對苗期植株均造成了損傷，并隨處理時間延長而加重(圖3)。42 ℃高溫條件下，在處理48，72 h，02428的相對電導率均顯著高于NIL-8(圖3-A)，說明NIL-8葉片細胞液外滲程度較小，高溫對其傷害較低。在低溫處理24，48 h，02428的相對電導率均顯著低于NIL-8，但處理到72 h兩者的相對電導率并無顯著差異(圖3-B)，說明在低溫處理前期02428所受傷害程度小于NIL-8。100 mmol/L NaCl處理下，02428與NIL-8的相對電導率在24 h顯著高于0 h，但在48 h兩者的相對電導率與24 h的變化不顯著，而到72 h兩者的相對電導率均上升到一個新的水平(圖3-C)，說明在鹽脅迫處理前期可能對植株傷害較大，處理過程中植株可能存在相應的應對機制來抑制細胞液的滲透，隨著處理時間的延長，這種應對機制被打破，相對電導率進一步升高。在整個鹽脅迫處理下，02428與NIL-8的相對電導率均無顯著差異。15% PEG-6000的模擬干旱處理后02428的相對電導率均顯著高于NIL-8(圖3-D)，說明在幼苗期NIL-8的抗旱能力優(yōu)于02428，與前述的表型以及葉綠素含量、葉片含水量的測定結果基本吻合。

圖3 不同脅迫處理下02428和NIL-8苗期葉片的相對電導率Fig.3 The relative conductivity in the leaves of 02428 and NIL-8 under different stress treatments

2.5 脅迫處理對葉片SOD與CAT活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是一種能夠清除活性氧的保護酶，因此SOD活性的變化能夠反映逆境脅迫的生理指標。高溫、低溫、鹽脅迫處理3 d時，02428與NIL-8葉片中SOD活性與對照相比均有所降低，但均無顯著差異；而模擬干旱處理下，02428與NIL-8葉片SOD活性與對照相比均有所升高，但仍未達到顯著水平，且升高后兩者差異并不顯著(表2)。總體而言，02428與NIL-8在4種脅迫處理下的SOD活性無顯著差異。

表2 不同脅迫處理下02428和NIL-8葉片的SOD活性Tab.2 The SOD activity in the leaves of 02428 and NIL-8 under different stress treatments U/mg

過氧化氫酶是(CAT)是一類重要的抗氧化酶，能有效地清除活性氧基團，防止細胞膜氧化損傷。42 ℃高溫處理后02428與NIL-8的CAT活性均比其對照顯著下降，而NIL-8的降幅更大(表3)。10 ℃低溫處理后，02428的CAT活性有所降低，與其對照相比并無顯著差異；但NIL-8的CAT活性不但顯著高于其對照，也顯著高于處理后的02428。100 mmol/L NaCl處理后，02428與NIL-8的CAT活性比其對照均顯著增加，且02428顯著高于NIL-8。15% PEG-6000處理后，02428的CAT活性比其對照增加，但未達顯著水平；而NIL-8的CAT活性顯著高于其對照和處理后的02428(表3)。由此可見，不同脅迫處理下，兩者的CAT活性呈現出明顯不同的變化，高溫脅迫導致CAT活性的明顯下降，而鹽脅迫處理則導致CAT活性的明顯升高。

2.6 NAL11受不同逆境脅迫誘導

在高溫處理的4，8，36，72 h時，NAL11的表達量均顯著高于對照(圖4-A)。說明在02428中NAL11的表達受高溫的正向誘導。低溫處理時，NAL11在24 h時表達量顯著低于對照，而在6，72 h表達量顯著高于對照(圖4-B)。在100 mmol/L NaCl處理的4，8 h，NAL11的表達量均顯著高于對照(圖4-C)，說明NAL11的表達在短時間內受鹽脅迫的正向誘導，但在24 h時則相反。在15% PEG-6000模擬干旱處理的4，6 h時，NAL11的表達量均顯著高于對照，在8 h則顯著低于對照(圖4-D)?？梢?，在不同逆境處理下，NAL11的表達量在較短時間內會迅速升高，隨后隨著逆境處理的持續(xù)，NAL11的表達呈現出動態(tài)的變化，說明不同的逆境處理均可以快速誘導基因NAL11的表達。

表3 不同脅迫處理下02428和NIL-8葉片的CAT活性Tab.3 The CAT activity in the leaves of 02428 and NIL-8 under different stress treatments U/mg

圖4 不同逆境處理時02428中基因NAL11的表達動態(tài)Fig.4 Dynamic expression of NAL11 in 02428 under treatments of different stress

3 結論與討論

熱激蛋白廣泛存在于各種生物中，能夠響應多種生物和非生物脅迫[21]。研究發(fā)現，熱激蛋白基因OsHsp18.0-CI能夠受到白葉枯病菌的誘導表達，超表達OsHsp18.0-CI的轉基因水稻增強了對多個白葉枯病致病菌株的抗性[13]。OsHsp18.0過表達和沉默系分別對熱處理和鹽處理表現出增強和降低的耐受性[22-23]。許錦彪等[24]利用熒光定量PCR技術研究了一個編碼DnaJ結構域的熱激蛋白基因Os07g0620200在不同逆境脅迫下的表達模式，結果表明，高溫、干旱、鹽處理以及外源精胺的處理均促進了該基因的表達；該基因在黃華占中的表達量始終高于雙桂1號，表明黃華占在逆境條件下具有更好的耐受性。通常情況下，熱激和其他逆境條件下會影響熱激蛋白基因的表達，但是這種表達模式并不是單一的。本研究中，基因NAL11的表達量在高溫、低溫、鹽及模擬干旱脅迫處理的短時間內迅速升高，尤其在高溫和鹽處理4 h時及低溫處理6 h時，02428中NAL11的表達量顯著高于對照組，該結果反映了該基因在受到逆境脅迫時迅速響應的特點。但是隨著不同脅迫處理時間的延長，NAL11的表達模式發(fā)生了動態(tài)變化。在高溫處理下，NAL11的表達量始終高于對照，在處理72 h時其表達量已經顯著高于對照組，說明在水稻苗期NAL11受高溫的持續(xù)正向誘導。而在低溫和模擬干旱脅迫下，NAL11的表達趨勢較為復雜。在本研究中，基因NAL11在不同的脅迫以及在同一脅迫的不同時期呈現出不同的表達水平，原因可能是由于NAL11在生育期內本身會發(fā)生動態(tài)變化影響其表達水平。

逆境脅迫能夠影響植物相關的生理代謝過程，因此可以通過相關生理指標來反映逆境對植物的傷害程度及其抗逆能力。在逆境脅迫下，綠色植物葉綠素合成降低，光合作用減弱[25]。在本研究中，02428與NIL-8苗期葉片的SPAD隨著不同逆境處理時間的延長均逐漸下降，說明逆境影響了兩者苗期的葉綠素合成，且對植物造成了不同程度的傷害。尤其是在模擬干旱下，02428的SPAD下降幅度高于NIL-8，說明NIL-8在干旱脅迫下仍能保持較高的葉綠素含量。盡管4種脅迫處理使兩者的葉片含水量均降低，但在鹽脅迫和模擬干旱脅迫下NIL-8相比02428能維持更高的葉片含水量。相對電導率能夠反映逆境脅迫下細胞內電解質滲漏的情況，因此，可作為反映植物抗逆強弱的一個指標[26-27]。在本研究中，4 種脅迫處理下的水稻葉片電導率均隨著處理時間的延長而逐漸升高，說明了細胞內電解質滲漏逐漸加大，細胞膜的傷害隨脅迫處理時間的延長而加重。但是在高溫和模擬干旱條件下，無論是在48 h、還是72 h，02428的相對電導率均顯著高于NIL-8，說明NIL-8在高溫和干旱脅迫下仍能維持較低的電解質滲漏水平，其耐高溫和耐旱能力可能優(yōu)于02428。

水稻在遭受逆境脅迫時，會導致細胞內氧代謝平衡失調而產生活性氧對細胞膜系統(tǒng)造成損傷[28]。而超氧化物歧化酶(SOD)與過氧化氫酶(CAT)作為2種最有效的抗氧化酶，能夠減輕活性氧對細胞的傷害[29]。郭培國等[30]研究發(fā)現，高溫處理水稻2～3 d會引起植株體內SOD和CAT活性增加，但是時間延長會導致酶活性降低從而對植株產生過氧化作用。施大偉等[31]研究發(fā)現，隨著低溫處理時間的延長，雜交水稻幼苗體內SOD活性逐漸升高，而POD、CAT活性逐漸下降。馬廷臣等[32]利用PEG-6000模擬干旱處理，對不同耐旱品種苗期根系酶類活性進行測定，結果發(fā)現，抗旱能力強的品種較抗旱性弱的品種，其SOD活性、POD活性均增加。在本研究中，不同的脅迫處理并未導致兩者SOD酶活性的顯著差異，說明基因NAL11可能并不影響SOD活性。02428與NIL-8的CAT活性在高溫處理下均顯著下降，說明高溫嚴重抑制兩者體內CAT的產生，過氧化氫的清除能力受到影響，植株均受到一定程度的傷害，與高溫下兩者均表現出一定程度的黃化表型基本吻合。相反地，鹽脅迫和模擬干旱脅迫均使兩者的CAT活性提高，但在鹽脅迫下02428顯著高于NIL-8，在模擬干旱脅迫下NIL-8卻顯著高于02428。不同的脅迫處理導致兩者的CAT活性也有所不同，說明基因NAL11可能通過影響CAT活性在不同脅迫中發(fā)揮作用?？梢?，02428與NIL-8在4種不同脅迫下表現出了表型及生理指標上的差異，可能與基因NAL11的表達差異有關。

總體而言，在干旱脅迫下，NIL-8能保持較輕的萎蔫程度、較高的葉綠素含量、較高的葉片含水量、較低的電解質滲漏水平、較高的CAT活性，說明NIL-8可能具有更好的耐旱性，推測NAL11可能作為一種負調控基因參與了水稻幼苗的耐旱性，具體調控機制有待進一步研究。