李培培，黃柯銘，申鳳敏，仝昊天，田志強，韓燕來

(河南農業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，河南 鄭州 450002)

砂姜黑土區(qū)是黃淮海平原南部主要的小麥玉米生產基地，該地區(qū)自然條件優(yōu)越，光熱資源豐富。近年來，在種植業(yè)“化肥零增長”的大背景下，我國化肥的大量施用得到了一定程度的遏制，種植業(yè)化肥施用量在2016年首次實現了零增長，化肥減量工作取得重要進展[1]。研究表明，在砂姜黑土區(qū)，長期單純減施氮肥具有一定的減產風險[2]，需要配套相應的氮肥減施增效技術，當前對不同農業(yè)生態(tài)區(qū)適宜的減氮增效及優(yōu)化施肥方案尚不完善，將不利于現代化農業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。

糧肥間作是適合砂姜黑土地區(qū)復種指數提高條件下培肥土壤的土地利用方式[3]。綠肥與作物間作能有效改善土壤理化性狀、增加作物的產量[4-6]，應用潛力巨大。北方普遍實施的間作模式是玉米和豆科作物間作，間作形成的作物復合群體可增加對陽光的截取與吸收，減少光能的浪費；同時，綠肥間作套種還可產生互補作用，但套種時不同作物之間也常存在著對陽光、水分和養(yǎng)分的激烈競爭。盡管前人針對不同生態(tài)區(qū)糧肥間作的增益效果有大量報道[4-8]，但在減氮措施下，不同的豆科綠肥與玉米間作的效果尚缺乏充分的研究。本研究在氮肥減施的條件下，篩選傳統(tǒng)豆科綠肥：當地品種花豇豆(Vignaunguiculata)、毛綠豆(Vignaradiata)和引進牧草拉巴豆(Dolichoslablab，高產牧草)，對其與玉米間作的作物產量，地上干物質收獲量進行比較研究。砂姜黑土區(qū)推廣糧肥間作模式，減氮增效，實現作物穩(wěn)產、減氮和培肥土壤具有重要意義。

土壤微生物在土壤養(yǎng)分周轉及肥力形成過程中扮演重要角色，其數量、多樣性及群落結構是土壤肥力評價的主要指標之一[9]。綠肥間作能顯著提高土壤養(yǎng)分利用效率[6，8]和土壤微生物量，影響微生物群落結構和土壤酶活性[10]。而減氮降低土壤氮素養(yǎng)分輸入，長期減氮將影響土壤氮素營養(yǎng)的積累，進而減少土壤微生物數量和酶活性[11]。減氮措施下，夏玉米生產中增加綠肥間作對土壤微生物的影響如何也是本研究重點探討的問題，為此，在光熱資源較豐富的砂姜黑土區(qū)對3種豆科綠肥與玉米間作產生的土壤微生物生態(tài)效應進行研究，旨在深入探討綠肥間作對土壤微生物量碳、氮及微生物特征的影響，為砂姜黑土區(qū)減氮增效、土壤培肥和農田可持續(xù)利用模式提供研究基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗點設在河南省駐馬店市西平縣師靈鎮(zhèn)白廟村，位于河南省南部，大陸性季風型濕潤氣候，四季分明，年平均氣溫 14.8 ℃，年平均降雨量852 mm。農田土壤為典型砂姜黑土，試驗田經多年培肥地力均勻，冬小麥-夏玉米輪作是該地區(qū)長期的種植制度，供試土壤 pH值6.22，有機質含量10.81 g/kg，全氮含量1.26 g/kg，有效磷含量14.91 mg/kg，速效鉀含量171.6 mg/kg。

1.2 試驗設計與樣品采集

試驗于2018年6-10月的玉米季進行，共設置6個處理，分別為不施肥(CK)、常規(guī)施肥(100%N)、氮肥減施30%(70%N)、氮肥減施30%+拉巴豆(Dolichoslablab)(70%N+LA)、氮肥減施30%+花豇豆(Vignaunguiculata)(70%N+J)、氮肥減施30%+毛綠豆(Vignaradiata)(70%N+LV)。每個處理3次重復，完全隨機排列，小區(qū)面積20 m2，共18個小區(qū)，周圍設有1 m的保護行。玉米種植模式為寬窄行種植，寬90 cm、窄48 cm，寬行內播種綠肥。玉米和豆科綠肥的播種期為2018年6月7日，玉米定植日期為2018年6月18日，收獲日期為9月29日。其中，100%N處理施肥量為N 210 kg/hm2、P2O5和K2O均為 90 kg/hm2，分別于2018年7月5日、7月 29 日開溝施入苗肥、追施尿素，追肥在玉米窄行內進行，比例為6∶4，70%N處理主要在追肥時期減施。試驗田塊的其他水肥、植保等田間管理措施均按照當地高產夏玉米生產技術規(guī)程進行。

土樣的采集：采用S形取樣法采取0～20 cm耕層土壤樣品，每小區(qū)隨機采集5鉆土樣裝于無菌自封袋中作待測樣品，密封保存帶回實驗室進行后期處理，土壤采集在玉米收獲前7 d進行。

植株樣品采集：在玉米收獲期每個小區(qū)隨機取8株完整玉米植株，從地上莖基部切斷，地上部烘干稱質量，計算干物質質量；隨機選擇2行玉米采集果穗，干燥后脫粒稱質量計算籽粒產量。綠肥地上部植株收獲2行，稱質量后記錄，準確稱取1.0 kg帶回實驗室測定含水量，折算單位面積的綠肥干物質質量。

1.3 土壤樣品分析方法

1.3.1 土壤樣品的采集 采集新鮮土壤樣品保存在4 ℃條件下，14 d內進行微生物量的測定。微生物量碳、氮含量的測定采用氯仿熏蒸浸提法：土壤經氯仿熏蒸，殺死微生物，致使細胞破解后可溶性的碳氮浸提出來，通過計算熏蒸前后浸提液中碳、氮的增量，表征土壤微生物量碳、氮含量[12]。

1.3.2 土壤微生物總DNA的提取 采用MoBio PowerSoil Isolation Kit (MoBio Laboratories，Carlsbad，CA，USA)的試劑盒提取，操作步驟按試劑盒上的說明進行。用核酸檢測儀檢測含量和純度后于-20 ℃保存待用，使用時DNA 稀釋到10 ng/μL用于后續(xù)PCR擴增。

1.3.3 末端限制性片段長度多態(tài)性分析(T-RFLP) PCR擴增：采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)擴增細菌16S rDNA片段，其中正向引物5′端用6-FAM進行熒光標記。擴增體系(25 μL)：12.5 μL 2×TaqMaster Mix，2 μL DNA模板，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O補足至25 μL。 PCR運行程序：細菌為94 ℃ 30 s預變性;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，共26個循環(huán);72 ℃ 延伸10 min。獲取的PCR產物用1%的瓊脂糖電泳檢測片段大小和單一性，冷凍避光保存用于后續(xù)酶切分析。

酶切：PCR產物純化后，分別用限制性內切酶HaeⅢ和MspⅠ對純化后的1 500 bp左右的細菌PCR產物進行酶切，酶切體系均為25 μL。反應條件：1 μL 內切酶，2 μL 10×Buffer，10 μL PCR產物，dd H2O補齊至25 μL，將體系混勻后，37 ℃消化4 h， 然后，在95 ℃條件下水浴15 min，使限制性內切酶失活，終止酶切反應。酶切產物片段在 ABI3730xl DNA analyzer (Applied Biosystems，Foster City，CA)上進行測定。

1.4 數據分析

所得試驗數據采用Microsoft Excel 2016軟件進行作表、作圖，不同處理之間的差異顯著性用單因素方差分析進行計算。FRFs片段相對的豐度使用GeneMarkerV2.2 (ABI，USA)軟件進行處理，分析電泳圖譜中各峰的片段長度和峰面積，每個樣品中低于最高峰高值2%的峰從后續(xù)分析中剔除，片段長度差異小于等于1 bp的2個峰作為1個峰進行分析。依據圖譜中T-RFs的數目及其相對豐度進多樣性指數(Shannon指數、Pielou均勻度和Simpson指數)的計算，計算方法參考文獻[13]進行。所有統(tǒng)計分析使用 SPSS 19.0 軟件(IBM Co，Armonk，NY，USA)實現，P<0.05 被認為具有顯著性差異。使用R語言中的vegan數據包對基于不同T-RFs相對豐度的細菌群落結構的關系進行主成分分析(PCA)。

2 結果與分析

2.1 綠肥間作和減氮處理對土壤微生物量碳、氮含量的影響

各處理土壤微生物量碳含量在247.3～318.5 mg/kg(圖1)，綠肥間作減氮處理高于CK和100%N處理，其中，70%N+LA處理最高，70%N+J處理次之，二者顯著高于100%N處理，而70%N+LV處理的微生物量碳含量與100%N處理之間無顯著差異。減氮措施分別配合拉巴豆和豇豆間作均能有效提高砂姜黑土微生物量碳含量。

微生物量氮含量以70%N+J處理最高，為62.9 mg/kg，顯著高于100%N處理(49.8 mg/kg)和70%N處理(47.3 mg/kg)，70%N+LA、70%N+LV處理微生物量氮含量分別為56.8，52.7 mg/kg，與上述兩處理無顯著差異。

不同小寫字母表示不同處理間差異顯著性(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant differences between different treatments(P<0.05).

2.2 綠肥間作和減氮處理對玉米、綠肥產量和地上部干物質積累量的影響

與100%N處理相比，綠肥間作和減氮處理沒有顯著提高或降低玉米籽粒產量(表1)，其中，100%N和70%N+J處理產量最高，分別達到7 918.1，7 905.3 kg/hm2，相應的其玉米地上部干物質質量也最高，分別為17 927.6，16 978.9 kg/hm2，二者無顯著差異，與70%N+LV處理無顯著差異，其中，100%N處理玉米地上部干物質量顯著高于70%N+LA。拉巴豆的生物量較大，尤其在后期使玉米田間郁閉，和玉米爭奪光熱資源嚴重，而豇豆生物量相對較小、毛綠豆最小，對玉米光熱的競爭較小，因此，70%N+LA處理較100%N處理玉米地上部干物質質量顯著降低。

70%N+LA處理綠肥干物質質量最高達到3 293.3 kg/hm2，其次是70%N+J處理，綠肥干物質質量為1 427.4 kg/hm2，70%N+LV綠肥干物質質量最小，為1 003.8 kg/hm2，3個處理之間差異顯著。盡管玉米地上部干物質質量100%N處理最高，但是總干物質質量以70%N+LA、70%N+J處理最高，顯著高于70%N處理，與100%N處理無顯著差異。

表1 不同處理的玉米、綠肥產量及地上部干物質質量Tab.1 Maize and green manure yield and dry matter mass above ground under different treatments kg/hm2

2.3 細菌群落結構的T-RFLP分析

選擇代表性處理CK、100%N和2個綠肥間作處理(70%N+LA和70%N+J)，對其土壤樣品DNA中的細菌16S rDNA擴增基因片段進行MspⅠ、HaeⅢ的酶切分析，分別獲得31，33個特異的RFs片段，分別挑出10個優(yōu)勢片段對其T-RFLP結果進行分析，見圖2。MspⅠ酶切獲得的10個優(yōu)勢T-RFs片段長度分別為69，137，148，400，423，433，436，483，486，491 bp，在各個處理中都能檢測到，各處理相對豐度存在差別，其中優(yōu)勢片段69 bp占到總片段的8.6%～17.2%，優(yōu)勢片段400 bp占比3.6%～9.2%，2個片段在處理70%N+LA和70%N+J比例均增加，而483 bp在處理70%N+LA和70%N+J中比例均下降。HaeⅢ酶切獲得的10個優(yōu)勢片段，包括60，69，131，194，213，216，218，227，260，291 bp，在70%N+LA和70%N+J處理中，沒有檢測到260 bp，而在CK和100%N處理中，260 bp相對豐度在5.5%～6.8%。69，291 bp在各處理相對豐度分別在14.1%～30.6%和11.6%～30.4%，其中70%N+LA和70%N+J處理的相對豐度比CK和100%N處理均增加。216 bp的相對豐度在7.9%～22.3%，綠肥間作處理的相對豐度均明顯降低。

圖2 基于HaeⅢ和MspⅠ酶切的細菌T-RFs相對豐度Fig.2 Relative abundance of bacterial T-RFs based on restriction endonuclease of HaeⅢ and MspⅠ

2.4 基于酶切的細菌群落結構多樣性分析

不同處理砂姜黑土中基于細菌T-RFs片段的Shannon指數、Pielou均勻度指數和Simpson指數見表2。2種酶切70%N+LA和70%N+J處理均降低了細菌Shannon指數和Pielou均勻度指數，說明減氮間作綠肥處理Shannon多樣性指數和Pielou均勻度指數均呈現下降趨勢。Simpson 指數在用HaeⅢ酶切條件下，與其他處理相比，70%N+LA、70%N+J處理是增加的，其中，70%N+LA處理顯著增加，用MspⅠ酶切處理下，70%N+LA、70%N+J處理的Simpson 指數是降低的，顯著低于100%N處理。

表2 不同處理土壤細菌多樣性指數Tab.2 Diversity indexes of bacterial communities under different treatments

2.5 細菌群落主成分分析

不同處理間微生物群落結構組成有很大差別。通過主成分分析(圖 3)發(fā)現，基于HaeⅢ酶切的RFs分析前 2 個主成分的解釋度達到了84.1%，其中第一主成分和第二主成分的貢獻值分別為53.9%和30.2%。70%N+LA和70%N+J處理的樣品與CK和100%N分開，表現較大的群落組成差異，70%N+LA和70%N+J處理間相似度高；基于MspⅠ酶切的T-RFs分析，第一主成分和第二主成分的貢獻值分別為 42.8% 和 31.2%，累計解釋量達到74.0%，70%N+LA和70%N+J處理相似度高，與100%N和CK分開。

圖3 不同處理土壤細菌群落結構的主成分分析Fig.3 The principal component analysis of soil bacterial community structure under different treatments

3 結論與討論

豆科與禾本科間作體系具有間種優(yōu)勢，二者的相互作用在間作產量優(yōu)勢中起重要作用[12]。綠肥與化肥能顯著改善土壤理化性質、提高作物產量[5，14-16]，本研究結果與前人研究類似，70%N+LA、70%N+J處理顯著提高了土壤微生物量碳、氮的含量。在玉米生產上，與豆科綠肥間作取得較好的經濟效益，在河西綠洲灌區(qū)進行玉米種植時，間作收獲籽粒為主的針葉豌豆能減少10%的化學氮肥用量[4]。以玉米和紫花苜蓿間作系統(tǒng)的研究表明，減氮均不同程度地造成了玉米減產，但隨著間作時間的延長，減氮所造成的減產幅度逐漸降低，到試驗第3 年單位面積純收益均高于對照[5]。本研究中，70%N條件下的4個處理玉米減產并不顯著，本研究選用的70%N+LA、70%N+J和70%N+LV處理沒有顯著降低玉米籽粒產量，前2種綠肥間作取得了較高的地上部總干物質質量，能增加經濟效益。拉巴豆是一種國外引種的高產量豆科牧草，其與青貯玉米間作或混播顯著提高地上干草產量[17]，但對于收獲籽粒為主的玉米間作，因其后期生物量過大，造成田間郁閉，蟲害嚴重，玉米籽粒產量較低。本研究中，玉米間作的綠肥品種毛綠豆因其生物量過小，地上干物質積累不夠，對比來看，3種豆科綠肥以花豇豆最佳。

研究表明，綠肥間作能顯著影響土壤微生物數量和群落結構[15，18-19]，間作之所以能提高作物產量和土壤微生物群落功能的關系密切[15]。本研究中，減氮條件下豆科綠肥拉巴豆或豇豆和玉米間作產生的互作效應均使土壤微生物量碳增加，但在一定程度降低了Shannon指數和Pielou均勻度指數。有研究者認為，豆科作物會向根際產生和分泌大量有機酸類物質，提高難溶營養(yǎng)物質的溶解度[20]，進而影響微生物量和群落[21]，豆科綠肥間作或混播還能有效改善土壤的通氣狀況，也是造成微生物群落結構變化的原因之一[22-23]。因此，間作有降低土壤細菌豐富度和多樣性指數的趨勢[23-24]。有學者認為，小麥和蠶豆間作與小麥單作相比，土壤細菌多樣性并無顯著的降低或增加[25]，另有其他研究認為，間作對土壤微生物多樣性指數是增加的[26-27]，可見間套作對于土壤微生物多樣性變化的研究結果并不一致。采土方式、套種間距和間作套種植物的差異可能是產生不同結論的原因。根系分泌物對根際微生物群落結構具有選擇塑造作用，不同植物的根際某些微生物群落適應性強，具有獨特性與代表性，此外，研究者還普遍認為，根際土壤中微生物量遠高于非根際土壤，但根際土壤微生物的多樣性一般小于非根際土壤[28-29]。本研究間作綠肥處理之所以降低了細菌群落Shannon指數，可能和采土方式和采樣時期有一定關系，本研究在植物生育后期采耕層樣品，根系在耕層土壤分布發(fā)達，玉米行間套種豆科植株增加了耕層土壤根系的分布數量和密度，對細菌群落的選擇作用較大。本研究僅基于一季大田試驗，在未來的研究中將繼續(xù)進行大田試驗，通過對玉米或豆科綠肥的根際和非根際的土壤區(qū)分，采樣高通量測序等現代分子生物學技術深入認識不同區(qū)域微生物結構與功能。

綜上，70%N+LA、70%N+J處理與70%N相比，能顯著提高總干物質質量，對玉米籽粒產量無減產影響，能顯著提高砂姜黑土微生物量碳含量，70%N+LA和70%N+J處理土壤微生物量碳含量均顯著高于100%N和70%N；與100%N處理相比，70%N+LA和70%N+J處理減小Shannon指數，影響細菌群落結構，其中HaeⅢ酶切條件下的70%N+LA和MspⅠ酶切條件下的70%N+J處理降低顯著。

因此，在華北小麥、玉米輪作體系的該類型土壤上，綠肥與夏玉米間作是有效的減氮增效推薦措施，綜合生長狀況和土壤生態(tài)效益最佳的間作綠肥品種為花豇豆。但本研究僅關注微生物群落變化，缺乏對特定微生物種群的認識，在進一步的研究中需要增加間作試驗年限，深入挖掘相關功能微生物。