謝易 魏杰 龔泰芳

（十堰市太和醫(yī)院骨科，湖北十堰442000）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種典型的與年齡相關(guān)的疾病，最常見于老年人[1]。其臨床特征主要包括關(guān)節(jié)疼痛、壓痛、腫脹及畸形，導(dǎo)致患者運(yùn)動(dòng)受限，嚴(yán)重危害老年人健康[2]。目前關(guān)于OA的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但研究顯示軟骨細(xì)胞數(shù)量的減少以及軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解引起軟骨退變，是導(dǎo)致OA的潛在機(jī)制之一[3，4]。有研究指出，OA的嚴(yán)重程度與軟骨細(xì)胞的凋亡數(shù)量密切相關(guān)[5]，有效減少軟骨細(xì)胞的凋亡對(duì)于OA的治療和預(yù)防尤為重要。MicroRNA（miRNA）通過其靶基因 mRNA 3′非編碼區(qū)（3′untranslated region，3′-UTR）在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)靶基因，參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化等多種生理過程[6]。研究顯示miRNA參與維持軟骨發(fā)育過程中的穩(wěn)態(tài)及OA發(fā)病過程[7]。文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-105在OA患者來源的病理細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)，而在正常細(xì)胞中高表達(dá)[8]。目前研究顯示miR-105常見于各種癌癥，并發(fā)揮抑癌作用[9，10]，而在OA中的研究尚在探索中。miR-105是否參與OA的發(fā)病尚不清楚。因此，研究miR-105對(duì)從OA軟骨中分離的軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響十分必要。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（fucosyltransferases，F(xiàn)UTs）是一種生物合成酶，參與機(jī)體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、組織發(fā)育、炎癥、癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移等多種生物過程[11]。有證據(jù)表明，F(xiàn)UTs控制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[12]。有文獻(xiàn)稱FUT4在OA病理細(xì)胞中的表達(dá)呈現(xiàn)較為顯著的高表達(dá)[13]，推測(cè)FUT4可能參與OA病理過程。本研究研究miR-105通過靶向結(jié)合FUT4對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制，以期為治療OA提供新的作用靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

無菌OA膝關(guān)節(jié)軟骨組織樣品（取自全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)患者，符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)OA診斷標(biāo)準(zhǔn)）和正常關(guān)節(jié)軟骨組織樣品（取自無OA或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的股骨、頸骨骨折全膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)患者）置液氮中冷凍，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。本研究?jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所取樣本的患者及家屬均簽署了知情同意書。

DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶（美國(guó)Hyclone公司提供）；青霉素鈉和慶大霉素（上海生工工程有限公司提供）；胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司提供）；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）和Trizol提取試劑（美國(guó)Invitrogen公司提供）；MTT、Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒（日本TaKaRa公司提供）；miR-105模擬物、miR-105模擬物對(duì)照、miR-105抑制劑、miR-105抑制劑對(duì)照及空質(zhì)粒（廣州銳博生物科技有限公司提供）；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex Taq檢測(cè)試劑盒（大連寶生物工程有限公司提供）；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司提供）；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）、ECL化學(xué)發(fā)光液、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所提供）；SDS-PAGE（本實(shí)驗(yàn)室配制）；FUT4小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）和siRNA對(duì)照（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供）；FUT4互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）過表達(dá)載體（北京傲銳東源生物科技有限公司提供，有效性已由公司驗(yàn)證）；FUT4抗體及二抗（美國(guó)Abcam公司提供）；實(shí)驗(yàn)所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 原代人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離和培養(yǎng)

參照唐新等[14]所述方法分離原代人軟骨細(xì)胞，除去多余的結(jié)締組織，切成約1 mm3切塊，用含雙抗（青霉素鈉和慶大霉素）的PBS清洗數(shù)次，加入0.1%胰蛋白酶于37℃培養(yǎng)箱中消化30 min，然后用0.2%Ⅱ型膠原酶消化16 h，期間每5 h收集1次細(xì)胞。使用200目濾網(wǎng)進(jìn)行分離，收集細(xì)胞以1000 rpm離心5 min，去上清，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基洗滌并重懸細(xì)胞。將細(xì)胞以1×105/ml密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于含有5%CO2飽和濕度的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 Real-time PCR檢測(cè)

采用Trizol法提取軟骨細(xì)胞總RNA，采用MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)驗(yàn)SYBR Premix Ex Tap試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。以U6為內(nèi)參計(jì)算miR-105相對(duì)表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算FUT4相對(duì)表達(dá)水平，采用相對(duì)定量2-△△CT法計(jì)算細(xì)胞中miR-105和FUT4的相對(duì)表達(dá)水平。各引物的引物序列詳見表1。

表1 各引物的引物序列

1.4 蛋白質(zhì)免疫印跡（western blot，WB）檢測(cè)

收集軟骨細(xì)胞，提取細(xì)胞中總蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取等量蛋白行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），分離蛋白后采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入FUT4一抗（1∶1000稀釋），在4℃條件下孵育過夜，再加入二抗（1∶1500稀釋），室溫孵育2 h。采用電化學(xué)發(fā)光（electro chemi luminescence，ECL）液進(jìn)行顯影，在掃描儀中成像，以GAPDH灰度值為參照，分析FUT4蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的OA軟骨細(xì)胞接種于6孔板中，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞匯合度達(dá)50%～60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作步驟參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。將轉(zhuǎn)染miR-105模擬物的細(xì)胞記為miR-105 mimic組，轉(zhuǎn)染miR-105模擬物對(duì)照的細(xì)胞記為NC-mimic組；轉(zhuǎn)染miR-105抑制劑的細(xì)胞記為miR-105 inhibitor組，轉(zhuǎn)染miR-105抑制劑對(duì)照的細(xì)胞記為NC inhibitor組；轉(zhuǎn)染FUT4 cDNA過表達(dá)載體的細(xì)胞記為pc-FUT4組，轉(zhuǎn)染FUT4 cDNA過表達(dá)載體對(duì)照的細(xì)胞記為pc-NC組；轉(zhuǎn)染FUT4 siRNA的細(xì)胞記為si-FUT4組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞記為si-NC組；共轉(zhuǎn)染miR-105模擬物和FUT4 cDNA的細(xì)胞記為miR-105 mimic+pc-FUT4組，共轉(zhuǎn)染miR-105模擬物和FUT4 cDNA對(duì)照的細(xì)胞記為miR-105 mimic+pc-NC組；共轉(zhuǎn)染miR-105抑制劑和FUT4 siRNA的細(xì)胞記為miR-105 inhibitor+si-FUT4組，共轉(zhuǎn)染miR-105抑制劑和FUT4 siRNA對(duì)照的細(xì)胞記為miR-105 inhibitor+si-NC組。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

使用數(shù)據(jù)庫TargetScan進(jìn)行預(yù)測(cè)分析miR-105靶基因結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-105和FUT4 3′-UTR存在靶向結(jié)合位點(diǎn)。擴(kuò)增miR-105和FUT4 3′-UTR結(jié)合片段及突變序列，分別構(gòu)建包含分別構(gòu)建包含miR-105結(jié)合位點(diǎn)的FUT4 3′-UTR野生型質(zhì)粒（FUT4 WT）和突變型質(zhì)粒（FUT4 MUT）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OA軟骨細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度為4×103/孔，待細(xì)胞匯合度達(dá)50%～60%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作步驟參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。共轉(zhuǎn)染FUT4 WT與miR-105模擬物的細(xì)胞記為FUT4 WT+miR-105 mimic組，共轉(zhuǎn)染FUT4 WT與miR-105模擬物對(duì)照的細(xì)胞記為FUT4 WT+NC mimic組；共轉(zhuǎn)染FUT4 MUT與miR-105模擬物的細(xì)胞記為FUT4 MUT+miR-105 mimic組，共轉(zhuǎn)染FUT4 MUT與miR-105模擬物對(duì)照的細(xì)胞記為FUT4 MUT+NC mimic組。轉(zhuǎn)染24 h后，參照熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)螢火蟲熒光素酶熒光強(qiáng)度及海腎熒光素酶熒光強(qiáng)度，兩者的比值表示熒光素酶相對(duì)活性。

1.7 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

轉(zhuǎn)染1～5 d后各組OA軟骨細(xì)胞分別通過MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，在每孔細(xì)胞中加入50 μl MTT溶液，于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后每孔細(xì)胞中再加入200 μl DMSO，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定每組細(xì)胞光密度值，以表示各組細(xì)胞增殖能力。

1.8 Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

轉(zhuǎn)染后48 h的各組OA軟骨細(xì)胞，以胰蛋白酶消化，PBS清洗，離心收集細(xì)胞，以結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，在細(xì)胞中依次加入5 μl Annexin VFITC和5 μl PI，避光孵育15 min后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，使用Cell Quest軟件分析各組細(xì)胞凋亡率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以單因素方差分析比較多組間差異，以SNK-q檢驗(yàn)比較兩兩組間差異，每組數(shù)據(jù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次取均值，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-105和FUT4在OA軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞中的表達(dá)情況

為研究miR-105和FUT4在OA軟骨細(xì)胞中的作用，通過Real-time PCR檢測(cè)人OA軟骨細(xì)胞和人正常軟骨細(xì)胞中miR-105和FUT4的表達(dá)水平，與正常軟骨細(xì)胞相比較，OA軟骨細(xì)胞中miR-105的表達(dá)量顯著升高（圖1A），F(xiàn)UT4 mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著下降（圖1B、C），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Pearson相關(guān)性分析顯示miR-105和FUT4的在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞和正常軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（圖1D）。

圖1 人OA軟骨細(xì)胞和人正常軟骨細(xì)胞中miR-105和FUT4的表達(dá)水平

2.2 上調(diào)或下調(diào)miR-105對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響

為研究miR-105對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響，分別將miR-105模擬物及miR-105抑制劑轉(zhuǎn)染到OA軟骨細(xì)胞中，經(jīng)Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-105的表達(dá)量顯示轉(zhuǎn)染miR-105模擬物后細(xì)胞中miR-105的表達(dá)量顯著升高，轉(zhuǎn)染miR-105抑制劑后細(xì)胞中miR-105的表達(dá)量顯著降低，與各自對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2A），提示轉(zhuǎn)染miR-105模擬物或miR-105抑制劑能夠上調(diào)或下調(diào)miR-105的表達(dá)。MTT法和Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示與NC mimic組比較，miR-105 mimic組細(xì)胞增殖能力顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2B、C）；與NC inhibitor組比較，miR-105 inhibitor組細(xì)胞增殖能力顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2B、C），提示miR-105對(duì)OA軟骨細(xì)胞具有促進(jìn)增殖、抑制凋亡的作用。

圖2 轉(zhuǎn)染后對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.3 FUT4是miR-105的靶基因

在線數(shù)據(jù)庫TargetScan預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)UT4 mRNA的3′UTR與miR-105核苷酸序列存在結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-105模擬物可顯著降低含有FUT4 mRNA的3′UTR結(jié)合序列細(xì)胞的熒光素酶活性（P＜0.05），而對(duì)含有FUT4 mRNA的3′UTR突變序列細(xì)胞的熒光素酶活性無顯著影響（P＞0.05）（圖3B），表明miR-105可與FUT4 mRNA的3′UTR結(jié)合，提示FUT4是miR-105的靶基因。

2.4 miR-105靶向調(diào)控FUT4

為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-105與FUT4的靶向關(guān)系，本研究構(gòu)建了共轉(zhuǎn)染miR-105模擬物和FUT4 cDNA以及共轉(zhuǎn)染miR-105抑制劑和FUT4 siRNA的OA軟骨細(xì)胞，檢測(cè)對(duì)FUT4表達(dá)的影響，與miR組相比較，miR+FUT4 cDNA組細(xì)胞中FUT4的表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4A）；與anti-miR組相比較，anti-miR+FUT4 siRNA組細(xì)胞中FUT4的表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4B）。通過共轉(zhuǎn)染能夠回調(diào)由上調(diào)或下調(diào)miR-105對(duì)FUT4表達(dá)的影響。進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-105能夠負(fù)向調(diào)控FUT4的表達(dá)。

2.5 miR-105通過靶向調(diào)控FUT4影響OA軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡

通過MTT法和Annexin V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)共轉(zhuǎn)染的OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的結(jié)果顯示，與miR-105 mimic+pc-NC組相比，miR-105 mimic+pc-FUT4組細(xì)胞增殖能力升高，凋亡率降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5A、B），表明過表達(dá)FUT4部分逆轉(zhuǎn)了上調(diào)miR-105表達(dá)對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響；與miR-105 inhibitor+si-NC組相比，miR-105 inhibitor+si-FUT4組細(xì)胞增殖能力升高，凋亡率降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5C、D），表明下調(diào)FUT4部分逆轉(zhuǎn)了下調(diào)miR-105表達(dá)對(duì)OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響。提示miR-105能夠通過負(fù)向調(diào)控FUT4表達(dá)影響人OA軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡。

圖3 miR-105與FUT4 mRNA的3’UTR靶向結(jié)合

圖4 miR-105靶向調(diào)控FUT4的表達(dá)

圖5 共轉(zhuǎn)染對(duì)人OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響

3 討論

OA是一種以軟骨退變?yōu)橹饕卣鞯穆酝诵行怨顷P(guān)節(jié)疾病，病情嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙[15，16]。OA的病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，近年來的研究報(bào)道m(xù)iRNA與該疾病的發(fā)病密切相關(guān)，參與OA的炎性反應(yīng)等多項(xiàng)進(jìn)程[17-19]，如miR-15a通過抑制其靶基因的表達(dá)誘導(dǎo)OA軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，參與OA的進(jìn)展[20]。目前研究表明，miR-105能夠顯著抑制胃癌、肝癌、腦膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌等癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌作用[21-25]。然而，miR-105在OA中的研究仍較少。本研究通過Real-time PCR檢測(cè)人OA軟骨細(xì)胞和人正常軟骨細(xì)胞中miR-105的表達(dá)量，顯示miR-105在人OA軟骨細(xì)胞中呈低表達(dá)，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染上調(diào)OA軟骨細(xì)胞中miR-105的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OA軟骨細(xì)胞的增殖能力升高，細(xì)胞凋亡率降低。與Ji等[8]的研究結(jié)果類似，miR-105在OA患者中表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)GF2/miR-105在OA發(fā)病機(jī)制中起重要作用。上述結(jié)果說明miR-105對(duì)OA軟骨細(xì)胞起保護(hù)作用。

FUTs家族是一組巖藻糖基化合酶。目前認(rèn)為人血清中一些FUTs活性升高，可作為惡性腫瘤的指征，F(xiàn)UTs活性與疾病發(fā)展過程（如炎癥）關(guān)系密切[26-29]。目前多項(xiàng)研究表明FUTs家族可能在某些關(guān)節(jié)炎中起重要作用，但FUTs對(duì)OA影響的研究仍較少。本研究分析了人OA軟骨細(xì)胞和人正常軟骨細(xì)胞中FUT4基因和蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)人OA軟骨細(xì)胞中FUT4 mRNA和蛋白水平顯著增加。因此，有必要進(jìn)一步研究闡明FUT4在OA中的作用機(jī)制。本研究通過生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)并通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證，F(xiàn)UT4是miR-105的直接靶基因，且FUT4表達(dá)受軟骨細(xì)胞中內(nèi)源性miR-105的調(diào)節(jié)。此外，miR-105的過表達(dá)顯著促進(jìn)了OA軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)并抑制細(xì)胞凋亡，而這種效應(yīng)可以通過與FUT4 cDNA的共轉(zhuǎn)染來逆轉(zhuǎn)。FUT4的敲除逆轉(zhuǎn)了miR-105的敲除導(dǎo)致OA軟骨細(xì)胞凋亡抑制作用。這與Isozaki等[30]的報(bào)道類似，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞裂解物中α(1，2)-連接的巖藻糖基化蛋白顯著高于正?；こ衫w維細(xì)胞裂解物。Benedetti等[31]關(guān)于青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的研究發(fā)現(xiàn)，與患者外周血T細(xì)胞相比，滑液中FUT7 mRNA水平上調(diào)。

本研究首先檢測(cè)了miR-105和FUT4基因在人OA軟骨細(xì)胞和人正常軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)FUT4在OA軟骨細(xì)胞中異常上調(diào)。通過生物信息學(xué)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了FUT4是miR-105的直接靶基因，并鑒定了miR-105在OA中通過負(fù)向調(diào)控FUT4影響OA軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡。因此，miR-105-FUT4信號(hào)軸可作為OA治療中的潛在治療靶點(diǎn)。