高穎 羅小林 廖鵬飛 羅元元

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是最常見的肺癌類型，在肺癌患者中占85%左右[1]。引起肺癌的因素有很多，如長期吸入粉塵、吸煙等，但具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。雖然針對肺癌的治療手段發(fā)展迅速，但其預(yù)后差，治愈率低，死亡率高[2]。目前，化療仍然是治療癌癥的常規(guī)手段，但在治療過程中容易出現(xiàn)耐藥性，導(dǎo)致治療效果越來越差[3]，因此尋找提高肺癌對藥物敏感性的機(jī)制成為治療肺癌的研究方向。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和調(diào)控生物生長代謝過程的參與者，在腫瘤細(xì)胞生長過程中發(fā)揮重要作用[4]。李歡等[5]研究表明lncRNA NORAD在食管鱗狀細(xì)胞EC9706中高表達(dá)，敲低lncRNA NORAD可抑制EC9706細(xì)胞活性。Wang等[6]研究表明lncRNA NORAD在NSCLC組織和細(xì)胞中上調(diào)，通過靶向miRNA-455/CDK14軸增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖能力，進(jìn)而促進(jìn)NSCLC的發(fā)生發(fā)展。miRNA是一類非編碼小RNA，通過與靶基因的堿基互補(bǔ)結(jié)合來調(diào)控基因表達(dá)，參與腫瘤細(xì)胞生長過程[7]。Liu等[8]研究表明miR-199a-3p在NSCLC組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，過表達(dá)miR-199a-3p可顯著抑制體內(nèi)腫瘤生長。Bai等[9]研究表明過表達(dá)miR-199a-3p可下調(diào)ZEB3表達(dá)進(jìn)而抑制小鼠體內(nèi)NSCLC細(xì)胞生長，并促進(jìn)其凋亡。鋅指蛋白217（zinc finger protein 217, ZNF217）屬于鋅指蛋白家族，在多種癌細(xì)胞中高表達(dá)并促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展[10]。張惠麗等[11]研究表明ZNF217在NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)，下調(diào)其表達(dá)可抑制NSCLC細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。miR-199a-3p與NORAD和ZNF217存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，但NORAD是否可以通過調(diào)節(jié)miR-199a-3p/ZNF217影響肺癌細(xì)胞藥物敏感性尚不清楚。因此本研究就lncRNA NORAD通過miR-199a-3p調(diào)控ZNF217對NSCLC細(xì)胞增殖、凋亡及化療敏感性的影響進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B、肺癌H460細(xì)胞和順鉑（Cisplatin, DDP）耐藥細(xì)胞株H460/DDP均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 試劑 DDP購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自河南鯤錦生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自南京森貝生物科技有限公司；胎牛血清購自廈門逸漠生物科技有限公司；Trizol試劑購自南京廣蘭生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒購自福州奧研實(shí)驗(yàn)器材有限責(zé)任公司；實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（realtime quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR）試劑盒購自上海赫澎生物科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自北京力波生物科技有限公司；Ki-67、caspase-9、ZNF217一抗體購自英國Abcam公司；si-NC、si-NORAD、miR-NC、miR-199a-3p mimic、inhibitor NC、miR-199a-3p inhibitor購自上海吉凱基因醫(yī)學(xué)科技有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將BEAS-2B細(xì)胞、肺癌H460細(xì)胞和H460/DDP細(xì)胞分別接種到RPMI-1640培養(yǎng)基，耐藥細(xì)胞培養(yǎng)另外添加0.5 μg/mL的DDP培養(yǎng)（37oC, 5%CO2）。

1.4 qRT-PCR檢測BEAS-2B、H460和H460/DDP細(xì)胞中NORAD、miR-199a-3p、ZNF217 mRNA表達(dá)水平 用Trizol試劑提取各組細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，熒光定量PCR擴(kuò)增cDNA。NORAD（XM_054323966.1, 177 bp）、ZNF217 mRNA（NR_027451.1, 136 bp）以GAPDH為內(nèi)參，miR-199a-3p（NC_000075.7, 21 bp）以U6為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算NORAD、miR-199a-3p、ZNF217 mRNA的相對表達(dá)量。引物序列：NORAD：F：5?-CTATTTGTAAATACCTTTGTTATTAAT-3?；R：5?-ACATACAGTCCTGAACAAGTAATCCA-3?；miR-199a-3p：F：5?-GCACAGTAGTCTGCACATTGG-3?；R：5?-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3?；ZNF217 mRNA：F：5?-AGTGAGCCACATCCCAAAAGA-3?；R：5?-ACACTGGGTGACTCCACCTC-3?；GAPDH：F：5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'；R：5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'。U6：F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.5 分組及處理 將對數(shù)期H460/DDP細(xì)胞分為control組、si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-NORAD組（轉(zhuǎn)染si-NORAD）、miR-NC組（轉(zhuǎn)染miR-NC）、miR-199a-3p mimic組（轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimic）、si-NORAD+inhibitor NC組（共轉(zhuǎn)染si-NORAD和inhibitor NC）、si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor組（共轉(zhuǎn)染si-NORAD和miR-199a-3p inhibitor），各組加入2 μg/mL的DDP處理24 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 將各組H460/DDP細(xì)胞接種于96孔板中，按照1.5中分組處理，培養(yǎng)48 h，每孔各加入10 μL CCK-8溶液，37oC孵育30 min，酶標(biāo)儀測量各孔的吸光度（波長450 nm），計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 各組H460/DDP細(xì)胞以每孔1×106個(gè)接種在96孔板中培養(yǎng)過夜，PBS緩沖液清洗，離心收集細(xì)胞，根據(jù)凋亡試劑盒說明書要求，加入Annexin V-FITC與PI試劑，反應(yīng)后，上樣用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.8 qRT-PCR檢測各組H460/DDP細(xì)胞中NORAD、miR-199a-3p、ZNF217 mRNA表達(dá)水平 操作步驟同1.4。

1.9 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平 提取各組細(xì)胞總蛋白質(zhì)，并檢測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移到封閉液中封閉之后加入Ki-67、caspase-9、ZNF217一抗（稀釋1:1500）4oC搖床過夜，洗膜后再加入二抗（稀釋1:5000）孵育2 h，使用ECL發(fā)光液顯影，用Image-Pro Plus進(jìn)行定量分析蛋白表達(dá)。

1.10 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-199a-3p與NORAD和ZNF217的靶向關(guān)系 構(gòu)建NORAD野生型載體（NORADWT）和突變型載體（NORAD-MUT），將NORAD-WT和NORAD-MUT分別與miR-NC和miR-199a-3p mimic共轉(zhuǎn)染于H460/DDP細(xì)胞中，48 h后，檢測熒光素酶活性。

構(gòu)建ZNF217野生型載體（ZNF217-WT）和突變型載體（ZNF217-MUT）將ZNF217-WT和ZNF217-MUT分別與miR-NC和miR-199a-3p mimic共轉(zhuǎn)染于H460/DDP細(xì)胞中，48 h后檢測熒光素酶活性。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 26.0軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩相互比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NORAD、miR-199a-3p、ZNF217 mRNA在各種細(xì)胞中表達(dá)水平分析 與BEAS-2B細(xì)胞相比，H460和H460/DDP細(xì)胞中NORAD、ZNF217 mRNA表達(dá)顯著升高，miR-199a-3p表達(dá)顯著降低（P<0.05）；與H460細(xì)胞相比，H460/DDP細(xì)胞中NORAD、ZNF217 mRNA表達(dá)顯著升高，miR-199a-3p表達(dá)顯著降低（P<0.05），見表1。

表1 各種細(xì)胞系中NORAD、miR-199a-3p、ZNF217 mRNA表達(dá)比較（Mean±SD, n=6）Tab 1 Comparison of mRNA expression of NORAD, miR-199a-3p and ZNF217 in each cell line (Mean±SD, n=6)

2.2 抑制NORAD和miR-199a-3p表達(dá)對H460/DDP細(xì)胞增殖率的影響 si-NORAD組H460/DDP細(xì)胞增殖率顯著低于control組和si-NC組（P<0.05）；miR-199a-3p mimic組H460/DDP細(xì)胞增殖率顯著低于miR-NC組（P<0.05）；si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor組H460/DDP細(xì)胞增殖率顯著高于si-NORAD+inhibitor NC組（P<0.05），見表2。

表2 各組H460/DDP細(xì)胞增殖率比較（Mean±SD, n=6）Tab 2 Comparison of proliferation rates of H460/DDP cells in each group (Mean±SD, n=6)

2.3 抑制NORAD和miR-199a-3p表達(dá)對H460/DDP細(xì)胞凋亡率的影響 si-NORAD組H460/DDP細(xì)胞凋亡率顯著高于control組和si-NC組（P<0.05）；miR-199a-3p mimic組H460/DDP細(xì)胞凋亡率顯著高于miR-NC組（P<0.05）；si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor組H460/DDP細(xì)胞凋亡率顯著低于si-NORAD+inhibitor NC組（P<0.05），見圖1和表3。

圖1 各組H460/DDP細(xì)胞凋亡率圖Fig 1 Apoptosis rate of H460/DDP cells in each group

表3 各組H460/DDP細(xì)胞凋亡率比較（Mean±SD, n=6）Tab 3 Comparison of apoptosis rate of H460/DDP cells in each group (Mean±SD, n=6)

2.4 抑制NORAD和miR-199a-3p表達(dá)對NORAD、miR-199a-3p、ZNF217 mRNA表達(dá)的影響 與control組和si-NC組相比，si-NORAD組H460/DDP細(xì)胞NORAD、ZNF217 mRNA表達(dá)顯著降低，miR-199a-3p表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與miR-NC組相比，miR-199a-3p mimic組H460/DDP細(xì)胞NORAD、ZNF217 mRNA表達(dá)顯著降低，miR-199a-3p表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與si-NORAD+inhibitor NC組相比，si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor組H460/DDP細(xì)胞ZNF217 mRNA表達(dá)顯著升高，miR-199a-3p mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05），NORAD mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），見表4。

表4 各組H460/DDP細(xì)胞中NORAD、miR-199a-3p、ZNF217 mRNA表達(dá)比較（Mean±SD, n=6）Tab 4 Comparison of mRNA expressions of NORAD, miR-199a-3p and ZNF217 in H460/DDP cells of each group (Mean±SD, n=6)

2.5 抑制NORAD和miR-199a-3p表達(dá)對H460/DDP細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 與control組和si-NC組相比，si-NORAD組H460/DDP細(xì)胞Ki-67、ZNF217表達(dá)顯著降低，caspase-9表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與miR-NC組相比，miR-199a-3p mimic組H460/DDP細(xì)胞Ki-67、ZNF217表達(dá)顯著降低，caspase-9表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與si-NORAD+inhibitor NC組相比，si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor組H460/DDP細(xì)胞Ki-67、ZNF217表達(dá)顯著升高，caspase-9表達(dá)顯著降低（P<0.05），見圖2和表5。

圖2 各組H460/DDP細(xì)胞中Ki-67、caspase-9、ZNF217蛋白表達(dá)Fig 2 Protein expressions of Ki-67, caspase-9 and ZNF217 in H460/DDP cells of each group.A: control; B: si-NC; C: si-NORAD;D: miR-NC; E: miR-199a-3p mimic; F: si-NORAD+inhibitor NC; G:si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor.

表5 各組H460/DDP細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（Mean±SD, n=6）Tab 5 Comparison of expression levels of related proteins in H460/DDP cells of each group (Mean±SD, n=6)

2.6 驗(yàn)證miR-199a-3p與NORAD和ZNF217的靶向關(guān)系 利用Starbase網(wǎng)站預(yù)測miR-199a-3p與NORAD和ZNF217結(jié)合位點(diǎn)，見圖3。與miR-NC和NORAD-WT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-199a-3p mimic與NORAD-WT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）；與NORAD-MUT和miR-NC組相比，NORAD-MUT和miR-199a-3p mimic共轉(zhuǎn)染組光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖4。與miR-NC和ZNF217-WT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-199a-3p mimic和ZNF217-WT共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）；與miRNC和ZNF217-MUT共轉(zhuǎn)染組比較，miR-199a-3p mimic和ZNF217-MUT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），見圖5。

圖3 miR-199a-3p與NORAD和ZNF217結(jié)合位點(diǎn)Fig 3 Binding sites of miR-199a-3p to NORAD and ZNF217

圖4 miR-199a-3p與NORAD的靶向關(guān)系驗(yàn)證Fig 4 Verification of the targeting relationship between miR-199a-3p and NORAD.a: Compared with miR-NC+NORAD-WT, P<0.05.

圖5 miR-199a-3p與ZNF217的靶向關(guān)系驗(yàn)證Fig 5 Verification of the targeting relationship between miR-199a-3p and ZNF217.a: Compared with miR-NC+ZNF217-WT, P<0.05.

3 討論

肺癌的發(fā)病率和死亡率在所有癌癥中居于首位，而以NSCLC患者最多[12]。個(gè)人生活習(xí)慣和所處外界環(huán)境因素是導(dǎo)致肺癌的主要因素，且隨著年紀(jì)的增加肺癌發(fā)病率也隨之升高[13]。目前針對NSCLC的治療已經(jīng)取得一定進(jìn)展，但治療效果仍不盡人意。晚期肺癌的治療以化療為主，但內(nèi)源性和獲得性化療抵抗導(dǎo)致化療效果大打折扣[14]，因此探究尋找提高肺癌細(xì)胞化療敏感性的機(jī)制對治療肺癌具有重要意義。

LncRNA是指長度超過200個(gè)核苷酸但沒有蛋白質(zhì)編碼能力的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但其可以在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因表達(dá)[15]，其在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，還具有調(diào)節(jié)化療耐藥性的作用。郭盛虎[16]研究表明lncRNA TUG1可以抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移，提高其對DDP的敏感性，促進(jìn)其自噬和凋亡。李正雄等[17]研究表明FTH1P3通過下調(diào)miR-218，可以降低A549/DDP細(xì)胞對DDP的敏感性，敲低FTH1P3可以提高A549/DDP細(xì)胞對DDP的敏感性。Caspase-9是線粒體凋亡通路的重要啟動子和關(guān)鍵蛋白酶，具有啟動凋亡和調(diào)節(jié)效應(yīng)型caspase的活性。本研究結(jié)果表明，NORAD在H460和H460/DDP細(xì)胞中高表達(dá)，推測NORAD可能與H460細(xì)胞耐藥性有關(guān)。下調(diào)NORAD表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，H460/DDP細(xì)胞增殖率、Ki-67蛋白表達(dá)顯著降低，凋亡率、caspase-9表達(dá)顯著升高。提示干擾NORAD后可以抑制H460/DDP細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，增強(qiáng)其對DDP的敏感性。

有研究[18]表明，miRNA在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后可調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞的生物學(xué)過程。Dong等[19]研究表明過表達(dá)miR-199-3p可抑制CHML與Rab5A結(jié)合進(jìn)而抑制NSCLC細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。熊偉杰等[20]研究表明過表達(dá)miR-199a-3p可抑制肺癌A549細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。本研究結(jié)果表明，miR-199a-3p在H460和H460/DDP細(xì)胞中低表達(dá)，上調(diào)miR-199a-3p表達(dá)后，H460/DDP細(xì)胞增殖率、Ki-67表達(dá)顯著降低，凋亡率、caspase-9表達(dá)顯著升高。提示過表達(dá)miR-199a-3p也可以抑制H460/DDP細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，增強(qiáng)其對DDP敏感性。

研究[21,22]證實(shí)，lncRNA與miRNA存在結(jié)合位點(diǎn)，可以調(diào)控miRNA表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程。Huang等[21]研究表明lncRNA NORAD通過靶向miR-129-1-3p/SOX4軸可以增強(qiáng)肺癌A549/DDP和H446/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性，促進(jìn)細(xì)胞增殖，敲低NORAD可增強(qiáng)其對DDP的敏感性，抑制細(xì)胞增殖。Shen等[22]研究表明NORAD通過海綿化miR-549-1-202p可以增強(qiáng)A549/DDP細(xì)胞對DDP的耐藥性，促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究通過生物信息學(xué)顯示miR-199a-3p與NORAD存在結(jié)合位點(diǎn)，敲除NORAD后miR-199a-3p表達(dá)顯著升高，ZNF217表達(dá)顯著降低，同時(shí)可以抑制H446/DDP細(xì)胞增殖。在敲除NORAD的基礎(chǔ)上，下調(diào)miR-199a-3p表達(dá)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-199a-3p可以部分逆轉(zhuǎn)敲除NORAD對A549/DDP細(xì)胞增殖的抑制作用。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)也證明兩者的靶向關(guān)系，證實(shí)miR-199a-3p是NORAD的靶標(biāo)。提示NORAD可以調(diào)控miR-199a-3p表達(dá)進(jìn)而影響A549/DDP細(xì)胞的增殖、凋亡和化療敏感性。為驗(yàn)證miR-199a-3p和ZNF217的關(guān)系，本研究通過過表達(dá)miR-199a-3p，發(fā)現(xiàn)ZNF217表達(dá)顯著降低，A549/DDP細(xì)胞增殖率顯著降低，凋亡率顯著升高。提示miR-199a-3p可下調(diào)ZNF217的表達(dá)，進(jìn)而抑制H460/DDP細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，增強(qiáng)其對DDP的敏感性。

綜上所述，干擾NORAD可以上調(diào)miR-199a-3p表達(dá)，下調(diào)ZNF217表達(dá)，抑制H460/DDP細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，增強(qiáng)其DDP化療敏感性。本實(shí)驗(yàn)僅在細(xì)胞水平進(jìn)行探究，后續(xù)還需進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)水平進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Auhtors contributions

Gao Y and Luo YY conceived and designed the study.Gao Y,Luo XL, Liao PF performed the experiments.Gao Y analyzed the data.Luo XL and Liao PF contributed analysis tools.Luo YY and Gao Y provided critical inputs on design, analysis and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.