劉長高，何忠平，張玉蒼，席小勇

?

香蕉假莖中產(chǎn)堿性果膠酶細(xì)菌的篩選發(fā)酵優(yōu)化與酶學(xué)性質(zhì)

劉長高，何忠平，張玉蒼，席小勇

（海南大學(xué)材料與化工學(xué)院，海南海口 570228）

利用果膠酶處理天然纖維對環(huán)境污染小，然而篩選高產(chǎn)量的菌株仍是降低成本獲得果膠酶的關(guān)鍵。本文利用以果膠為唯一碳源的培養(yǎng)基，從香蕉假莖中分離篩選出了一株具有較高果膠酶活性的菌株。經(jīng)16S rDNA序列分析表明，該菌株與枯草芽孢桿菌（）具有99%的相似性，將該菌株命名為sp. ZLXH-5。該菌株最佳發(fā)酵時(shí)間為2天，最佳發(fā)酵溫度是37℃，最佳初始pH值是5，最佳轉(zhuǎn)速是180r/min，最佳葡萄糖濃度為15g/L。通過發(fā)酵條件優(yōu)化，果膠酶產(chǎn)量提高了56.6%。對粗酶液的性質(zhì)進(jìn)行分析，其在55℃下達(dá)到最佳反應(yīng)速率，最適催化pH值是8.5，不同的離子對于果膠酶的活性起到不同的效果。由于該菌株具有較高的果膠酶活性，可以利用該菌株對香蕉假莖進(jìn)行生物脫膠。

果膠酶；發(fā)酵優(yōu)化；生物脫膠；香蕉假莖

海南島是我國香蕉主產(chǎn)區(qū)之一，每年有大量的香蕉假莖遭到廢棄，造成資源的極大浪費(fèi)，同時(shí)對當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境產(chǎn)生一定的破壞。香蕉假莖作為生物質(zhì)廢棄物，可以從中提取出香蕉纖維。香蕉纖維可以用于紡織和造紙，具有優(yōu)異的性能，如密度低、柔韌性和力學(xué)性能良好。此外，香蕉纖維具有可再生性，成本低廉等特點(diǎn)[1-2]。印度、日本已有利用香蕉纖維作為紡織原料的報(bào)道，國內(nèi)對于香蕉纖維的研究起步較晚。提取香蕉纖維的方法主要包括機(jī)械法，化學(xué)法和生物法。機(jī)械法效率較低，而化學(xué)法造成的污染大，同時(shí)可能對纖維造成損傷，對比而言，生物法不存在上述缺點(diǎn)，因此越來越受到人們的重視[3-5]。果膠是一種植物多糖，是胞間層和初生細(xì)胞壁的組成成分，其主鏈由D-半乳糖醛酸殘基組成，主鏈上也包含鼠李糖殘基[6]。生物法主要是利用產(chǎn)堿性果膠酶細(xì)菌或者直接用堿性果膠酶處理香蕉假莖，從而得到香蕉纖維。

果膠酶是一類水解酶的總稱，用于造紙?jiān)瓭{處理、紡織行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、食品加工、環(huán)境保護(hù)、飼料生產(chǎn)等，在工業(yè)上用途非常廣泛。用于紡織和造紙的果膠酶多為堿性果膠酶，其最主要的一種是聚半乳糖醛酸裂解酶（polygalacturonate lyase，PGL），該酶作用于多聚半乳糖醛酸上的糖苷鏈，通過反式消除催化果膠反應(yīng)，生成不飽和的產(chǎn)物。PGL必須在有Ca2+的存在才具有催化活性，在EDTA存在的情況下，其活性消失[7-9]。主要的產(chǎn)生菌包括：芽孢桿菌、歐文氏菌、假單胞菌、鏈霉菌和一些腐生菌[10]。使用堿性果膠酶處理香蕉纖維可以大大減少化學(xué)試劑的使用，減少污染、降低能耗、減少工業(yè)用水，此外纖維柔軟度和強(qiáng)度也能夠得到提高，因此果膠酶的應(yīng)用將會是紡織工業(yè)未來的發(fā)展方向。目前工業(yè)上使用的堿性果膠酶主要來源于枯草芽孢桿菌?，F(xiàn)在尚未檢索到高效脫膠方法的報(bào)道，因此，通過篩選得到高產(chǎn)量的菌株仍是降低生產(chǎn)成本獲得果膠酶的關(guān)鍵[8，11]。本研究從香蕉假莖中篩選出了一株具有較高果膠酶活性的芽孢桿菌屬菌株，對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行初步優(yōu)化，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，為該菌株在香蕉纖維生物脫膠方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉假莖，取自海南省瓊海市潭門鎮(zhèn)。

1.2 試劑

果膠購自Sigma公司；D-半乳糖醛酸來自Fluka；其他試劑均為國產(chǎn)試劑，分析純。

1.3 各培養(yǎng)基配方

初篩和復(fù)篩培養(yǎng)基[12]：果膠5g，NH4NO33g，KH2PO41g，MgSO4?7H2O 0.5g，CaCl20.2g，NaCl 0.5g，F(xiàn)eSO40.01g，吐溫2g，瓊脂15g，加入去離子水至體積為1L，pH值自然。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基[12]：果膠5g，NH4NO33g，KH2PO41g，MgSO4?7H2O 0.5g，CaCl20.2g，NaCl 0.5g，F(xiàn)eSO40.01g，吐溫2g，加入去離子水至體積為1L，pH值自然。

細(xì)菌保存培養(yǎng)基[13]：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂15g，加入去離子水至體積為1L，pH自然。

種子培養(yǎng)基[13]：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，加入去離子水至體積為1L，pH值自然。

1.4 DNS試劑的配制

稱取3,5-二硝基水楊酸 6.3g，加入2mol/L的NaOH溶液262mL，加入185g酒石酸鉀鈉，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，加蒸餾水定容至1000mL。貯于棕色試劑瓶中，放置1周后 備用[14]。

1.5 篩選方法

1.5.1 細(xì)菌的初步篩選

將取得的香蕉假莖切成1cm×1cm的正方形，接種于初篩培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，待香蕉假莖周圍長出菌落，選取相應(yīng)的細(xì)菌于平板（保存培養(yǎng)基）劃線，培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)1天，挑選單菌落，接種于細(xì)菌保存培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1天。將培養(yǎng)皿密封，置于4℃冰箱保存。

1.5.2 細(xì)菌復(fù)篩

將初步篩選得到的細(xì)菌接種于復(fù)篩培養(yǎng)基中，以點(diǎn)種的方式接種，每個(gè)培養(yǎng)皿點(diǎn)種3次。接種后，將其置于培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)2天，然后利用碘液進(jìn)行染色，測定菌落的大小以及水解圈的大小[15]，選取水解圈較大的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2天，進(jìn)行果膠酶活性測定，選取果膠酶活性較高的菌株作為目標(biāo)菌株。

1.6 果膠酶活性的測定

采用DNS法測定果膠酶活性[16]，底物pH值調(diào)節(jié)至9。酶活力單位的定義：在50℃下，每分鐘催化得到1μg還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

發(fā)酵優(yōu)化過程中粗酶液的制備：接一環(huán)菌種于種子培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)1天，再取100μL菌液接種于100mL的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，在搖床上37℃，培養(yǎng)2天。4℃下5000r/min離心10min，取上清液，得到粗酶液，置于冰箱中4℃保存。

1.7 產(chǎn)果膠酶細(xì)菌的16S rDNA測序及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

產(chǎn)果膠酶細(xì)菌的測序委托深圳華大基因科技有限公司完成，采用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物F27，序列為5'- d(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)-3'，下游引物R1492，序列為 5'-d(GGTTACCTTGTTACGACTT)- 3'。然后進(jìn)行16S rDNA測序，將測序獲得的16S rDNA序列提交到GenBank并獲得收錄號，與美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫收錄的細(xì)菌16S rDNAs進(jìn)行BLAST比對，選擇與spZLXH-5同源性較高的代表菌株，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.8 產(chǎn)酶條件優(yōu)化及數(shù)據(jù)分析

對影響菌種產(chǎn)酶條件的發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、初始pH值、轉(zhuǎn)速和葡萄糖濃度進(jìn)行了優(yōu)化，分別選取發(fā)酵時(shí)間梯度：1天、2天、3天、4天、5天；發(fā)酵溫度梯度：28℃、31℃、34℃、37℃、40℃；初始pH值梯度：3、4、5、6、7。轉(zhuǎn)速梯度：90r/min、120r/min、150r/min、180r/min、210r/min。葡萄糖濃度：0、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L。每一個(gè)因素的同一個(gè)水平做3個(gè)重復(fù)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2013和SPSS 19.0對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行處理和分析，顯著性水平為0.05，所有數(shù)據(jù)在分析之前進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。對各因素中的水平進(jìn)行單因素方差分析，采用最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行兩兩對比，利用Origin 9.0作圖。

1.10 果膠酶的性質(zhì)

確定了菌株產(chǎn)果膠酶的最佳發(fā)酵時(shí)間、溫度、pH值和轉(zhuǎn)速后，利用上述最佳條件發(fā)酵獲取粗酶液，測定粗酶液的最佳催化溫度，最佳催化pH值，測定果膠酶隨時(shí)間變化的曲線。通過加入不同種類的鹽如KCl、MnCl2、CuCl2、FeCl2、CaCl2、ZnCl2、MgCl2，檢測離子對果膠酶的促進(jìn)或抑制作用。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種Bacillus sp. ZLXH-5水解圈

圖1為菌株spZLXH-5形成的水解圈照片。該菌株菌落呈白色，菌落較大，周圍有較大的水解圈出現(xiàn)。經(jīng)革蘭氏染色后，菌株呈紫色，因此為革蘭氏陽性細(xì)菌。

2.2 16S rDNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

通過測序，得到該菌株的16S rDNA序列，該序列在GenBank的序列登錄號為KM823927。用MEGA 5.0軟件的鄰位相連法（Neighbor-Joining）將該菌株的16S rDNA序列和從GenBank選擇的與其同源性較高的菌株一起來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1000次Bootstrap自舉法檢驗(yàn)，其結(jié)果如圖2所示。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹，spZLXH-5與芽胞桿菌屬（）處于同一分支，支持度高達(dá)99%。綜合革蘭氏染色結(jié)果以及16S rDNA序列的相似性，鑒定該菌株為芽胞桿菌屬（）。

2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 最佳發(fā)酵時(shí)間的確定

如圖3所示，菌種在發(fā)酵開始后產(chǎn)酶量迅速增長，2天后趨于最高值，2天和3天產(chǎn)量沒有顯著差異，因此本研究選擇2天為最佳發(fā)酵時(shí)間。芽胞桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)酶的最佳時(shí)間多為1天[17]，本文選擇的發(fā)酵時(shí)間較長，可能原因是發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源含量較低，僅為0.5%，微生物生長受到抑制，導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間延長。

2.3.2 最佳發(fā)酵溫度的確定

如圖4所示，該菌種在31～37℃內(nèi)能夠穩(wěn)定產(chǎn)酶，在溫度低于31℃或是高于37℃時(shí)，果膠酶產(chǎn)量降低，最佳發(fā)酵溫度選擇為37℃。該菌株在較大的溫度范圍內(nèi)能夠穩(wěn)定產(chǎn)酶，31～37℃果膠酶產(chǎn)量差異較小。

2.3.3 最佳初始pH值的確定

初始pH值對于菌種產(chǎn)果膠酶有很大的影響，pH值能夠改變底物的帶電性，也可以使細(xì)菌原生質(zhì)體膜的電荷發(fā)生改變，從而影響細(xì)菌對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。從圖5可以看出，初始pH值低于5或是高于6時(shí)，果膠酶產(chǎn)量急劇降低，因此，該果膠酶初始pH值范圍限定在5～6之間，本研究選擇最佳初始pH值為5。

2.3.4 最佳轉(zhuǎn)速的確定

轉(zhuǎn)速對于搖瓶中的溶氧量有影響，轉(zhuǎn)速越快，培養(yǎng)基中溶解的氧越多，如圖6所示，菌種在180～210r/min內(nèi)果膠酶產(chǎn)量達(dá)到最大，從能耗和酶產(chǎn)量兩個(gè)因素綜合考慮，選擇180r/min作為最佳轉(zhuǎn)速。

2.3.5 葡萄糖濃度對果膠酶產(chǎn)量的影響

從圖7可以看出，加入葡萄糖能夠提高果膠酶的產(chǎn)量?？赡艿脑蚴窃跊]有加入葡萄糖時(shí)，培養(yǎng)液中單糖含量較低，不利于菌體的生長，加入適量葡萄糖后，促進(jìn)了菌體生長，從而使果膠酶產(chǎn)量提高。但是，從圖7中的結(jié)果可以看出，當(dāng)葡萄糖濃度超過15g/L后，果膠酶的產(chǎn)量隨著葡萄糖濃度的增加不再增長，而pH值減小，很有可能是當(dāng)葡萄糖濃度進(jìn)一步增加時(shí)，細(xì)菌開始產(chǎn)酸，造成pH值下降，果膠酶產(chǎn)量不再增長。通過發(fā)酵條件優(yōu)化，果膠酶產(chǎn)量提高了56.6%，達(dá)到了3401.8U/mL（優(yōu)化之前，果膠酶的產(chǎn)量為2172.6U/mL）。一般認(rèn)為野生菌經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化后產(chǎn)堿性果膠酶的水平為2.12～2121U/mL[11]，本研究的果膠酶產(chǎn)量明顯高于該范圍，因此具有可開發(fā)的前景。

2.4 果膠酶的活性

2.4.1 溫度對于果膠酶活性的影響

溫度對于果膠酶活性具有較大的影響，溫度過高容易使酶變性，溫度過低，酶促反應(yīng)速率較低。從圖8可以看出，果膠酶的活性在55℃時(shí)達(dá)到最大，在50～60℃時(shí)，果膠酶的活性比較穩(wěn)定。

2.4.2 pH值對于果膠酶活性的影響

pH值對于果膠酶活性影響較大，pH值過大或是過小都會引起酶失活。如圖9，在pH值為8.5時(shí)果膠酶活性達(dá)到最大，當(dāng)?shù)陀?.5或者高于10時(shí)，果膠酶活性急劇下降。

2.4.3 果膠酶活力隨時(shí)間的變化

如圖10所示，在5～40min內(nèi)，果膠酶的活力急劇降低，40min后，果膠酶活力降低速度減小。這是由于在反應(yīng)初期，底物濃度極高，正向的催化反應(yīng)速率較高，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，產(chǎn)物的濃度增加，從而加速了逆反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致酶促反應(yīng)速率減小。

2.4.4 不同金屬離子對果膠酶活性的影響

從表1可以看出，各種離子對果膠酶活性的影響不相同。K+對果膠酶活性起到輕微的抑制作用，Mn2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+對酶的抑制作用非常明顯，Ca2+能夠明顯地促進(jìn)果膠酶的活性，其原理是Ca2+與堿性果膠酶的活性中心結(jié)合，具體與Ca2+結(jié)合的是催化中心的賴氨酸殘基，從而提高了果膠酶的催化活性。此外，Ca2+能夠在聚半乳糖醛酸之間形成鹽橋[19-20]，而Mg2+對果膠酶活性的影響不明顯。

表1 金屬離子對果膠酶穩(wěn)定性的影響

3 結(jié) 論

通過利用以果膠為唯一碳源的培養(yǎng)基，從香蕉假莖中分離篩選出了一株具有較高果膠酶活性的菌株，該菌株屬于芽胞桿菌屬。經(jīng)過發(fā)酵條件優(yōu)化，得到該菌株的最佳發(fā)酵時(shí)間是2天，最佳發(fā)酵溫度是37℃，最佳初始pH值是5，最佳轉(zhuǎn)速是180r/min，最佳葡萄糖濃度為15g/L。通過對酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，得到粗酶液的最佳催化溫度是55℃，最佳催化pH值是8.5，Mn2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+抑制果膠酶的活性，Ca2+能夠增強(qiáng)果膠酶活性。本文中的菌株具有較高的果膠酶活性，將進(jìn)一步利用該菌株對香蕉假莖進(jìn)行脫膠處理，以期提取出香蕉纖維。

致謝：大連工業(yè)大學(xué)的何連芳教授級工程師對本論文實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了悉心指導(dǎo)，對此表示衷心的感謝。

[1] Jacob P，Prema P. Novel process for the simultaneous extraction and degumming of banana fibers under solid-state cultivation[J].，2008，39（1）：115-121.

[2] Paul S A，Boudenne A，Ibos L，et al. Effect of fiber loading and chemical treatments on thermophysical properties of banana fiber/polypropylene commingled composite materials[J].：，2008，39（9）：1582-1588.

[3] 黃雅婷，何葉麗. 新穎的紡織纖維——香蕉纖維[J]. 印染，2013（21）：54-55.

[4] 蔡勇，韋仕巖，吳圣進(jìn)，等. 香蕉假莖生物脫膠菌株篩選及其應(yīng)用效果初探[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，42（08）：944-947.

[5] Mei Y Z，Chen Y R，Zhai R Y，et al. Cloning，purification and biochemical properties of a thermostable pectinase fromM29[J].：，2013，33：77-81.

[6] Soriano M，Diaz P，Pasto F. Pectate lyase C from：A novel endo-cleaving enzyme with activity on highly methylated pectin[J].，2006，152（3）：617-625.

[7] 朱珣之，李強(qiáng)，華楠，等. 磁性氧化石墨烯固定化果膠酶[J]. 化工進(jìn)展，2014，33（12）：3324-3328.

[8] 張健紅，李寅，劉和，等. 一株堿性果膠酶高產(chǎn)細(xì)菌的分離、系統(tǒng)發(fā)育分析和產(chǎn)酶條件的初步優(yōu)化[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2005（3）：354-358.

[9] Kashyap D R，Vohra P K，Chopra S，et al. Applications of pectinases in the commercial sector：A review[J].，2001，77（3）：215-227.

[10] Gummadi S N，Kumar D S. Microbial pectic transeliminases[J].，2005，27（7）：451-458.

[11] 劉龍，汪志浩，張東旭，等. 堿性果膠酶的生物制造及其在紡織工業(yè)清潔生產(chǎn)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，2009，25（12）：1819-1828.

[12] 黃小龍，孫煥良，謝達(dá)平，等. 亞麻微生物脫膠菌種的篩選與鑒定[J]. 生物學(xué)雜志，2004，21（1）：20-22.

[13] 熊元林. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 武漢：華中師范大學(xué)出版社，2008：130-131.

[14] 王俊剛，張樹珍，楊本鵬，等. 3,5-二硝基水楊酸（DNS）法測定甘蔗莖節(jié)總糖和還原糖含量[J]. 甘蔗糖業(yè)，2008（5）：45-49.

[15] 林靜，譚曉明，王臻，等. 亞麻纖維脫膠菌的篩選及脫膠效果研究[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，2011（5）：132-136.

[16] Miller G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J].，1959，31（3）：426-428.

[17] 翟秋梅，薛衛(wèi)巍，薛永常，等. 枯草芽孢桿菌FM208849產(chǎn)果膠酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（2）：93-97.

[18] Payasi A，Sanwal R，Sanwal G G. Microbial pectate lyases：Characterization and enzymological properties[J].，2009，25：1-14.

[19] 陳麗娜，應(yīng)向賢，薛群，等. 細(xì)菌堿性果膠酶的酶學(xué)特性及其應(yīng)用研究[J]. 中國生物工程雜志，2010，30（4）：125-130.

[20] Basu S，Roy A，Ghosh A，et al. Arg235 is an essential catalytic residue ofDKS1 pectate lyase to degum ramie fibre[J].，2011，22（1）：153-161.

Isolation，fermentation optimization and enzymatic properties of a pectinase producing strain from banana pesudostem

，，，

（College of Materials and Chemical Engineering，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

The use of pectianase in natural fiber processing causes less pollution to environment. The key to get pectinase is to isolate a highly producing pectinase strain. A bacterial strain with high production of pectinase had been isolated and screened from banana pesudostem with a selective medium. The phylogenetic analysis based on 16S rDNA showed thatspZLXH-5 was close towith 99% sequence identityIt was named asspZLXH-5. The optimal fermentation condition was as follows，time of 2d，temperature of 37℃，pH value of 5，rotary speed of 180r/min，and glucose concentration of 15g/L. Studies on enzymatic properties showed that optimal temperature for pectinase was 55℃，and optimal pH value for pectinase was 8.5. Different ions showed different impacts on pectinase activity. This strain can be used to process banana pesudostem because of its high pectinase production.

pectinase；fermentation optimation；bio-degumming；banana pesudostem

Q 939.9

A

1000–6613（2015）09–3415–06

10.16085/j.issn.1000-6613.2015.09.033

2015-01-12；修改稿日期：2015-02-21。

國家自然科學(xué)基金（51263006）、教育部博導(dǎo)類專項(xiàng)基金（20134601110004）、海南省國際科技合作專項(xiàng)（KJHZ2014-02）及海南省自然科學(xué)基金（314074）項(xiàng)目。

劉長高（1990—），男，碩士研究生。聯(lián)系人：張玉蒼，教授，博士生導(dǎo)師，從事生物質(zhì)廢棄物資源化利用的研究。E-mail yczhang@hainu.edu。