柳湘潔,宋彩霞,張群聲,王啟全

(1.貴州省電力醫(yī)院干醫(yī)科,貴陽(yáng) 550002;2.山東省膠南市人民醫(yī)院內(nèi)科 266400;3.海南省?？谑腥嗣襻t(yī)院消化內(nèi)科 517010)

胰腺癌具有隱匿性和高度侵襲性特點(diǎn),因此早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移。傳統(tǒng)的治療方法效果差,且不能控制胰腺癌腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移,也不能顯著延長(zhǎng)患者的中位生存時(shí)間,因此需要探索新的胰腺癌治療方法,而基因治療被寄予厚望。

多個(gè)研究報(bào)道,Slug基因在多種惡性腫瘤中存在明顯上調(diào),Slug上調(diào)的腫瘤容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、較深的腫瘤浸潤(rùn)深度和較差的預(yù)后[1-7]。Hotz等[8]新近發(fā)現(xiàn),胰腺癌組織及高轉(zhuǎn)移潛能的胰腺癌細(xì)胞株存在Slug的明顯上調(diào)。本研究推測(cè)干擾Slug能抗胰腺癌轉(zhuǎn)移作用?；谏鲜隼碚?本課題旨在研究Slug干擾對(duì)胰腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的影響,為抗胰腺癌轉(zhuǎn)移提供新的基因靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑 RPMI1640購(gòu)于Hyclon公司,小牛血清購(gòu)于杭州四季青公司,胰酶為國(guó)產(chǎn)。質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于AXYGEN,連接試劑盒 RNA提取試劑、cDNA合成及 PCR擴(kuò)增試劑、G3PDH購(gòu)于TaKaRa;Lipofectamine購(gòu)于INVITROGEN,質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于AXYGEN,Millicell(小室)由MilliPore公司生產(chǎn),M atrigel和6孔板購(gòu)于美國(guó)BD公司。Slug-shRNA-1和shRNA-1質(zhì)粒由海口市人民醫(yī)院王齊全教授惠送,兔抗人多克隆抗體Slug購(gòu)于SANTACRAUZ公司。

1.2 細(xì)胞株和裸鼠 PANC-1胰腺癌細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生物研究所細(xì)胞庫(kù),細(xì)胞用含 10%胎牛血清的RPM R1640培養(yǎng)基培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)條件為37℃恒溫,飽和濕度為5%CO2,指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。取4周齡健康純種BA LB/c-nu/nu雌性裸鼠,體質(zhì)量 18～22 g,在海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)飼養(yǎng),稱重,編號(hào)。實(shí)驗(yàn)對(duì)象共分為3個(gè)組:pSlug-siRNA組、空白對(duì)照組和pNeg-siRNA組。

1.3 方法

1.3.1 基因轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選 PANC-1細(xì)胞在含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。用0.25%的胰酶消化細(xì)胞后,按每孔4×104個(gè)細(xì)胞均勻加入96孔板中,培養(yǎng)至細(xì)胞85%～90%匯合后,分別轉(zhuǎn)染pSlug-siRNA和pNeg-siRNA質(zhì)粒,具體操作按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說(shuō)明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24 h后將細(xì)胞以1∶10比例傳代,次日開(kāi)始用含有 500 μ g/mL G418的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng),每3天更換一次培養(yǎng)基,連續(xù)篩選3周,然后將獲得的細(xì)胞克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3.2 RT-PCR測(cè)定Slug-shRNA-1作用PANC-1細(xì)胞后Slug mRNA表達(dá) 按 TRizol試劑盒(Invitrogen公司)說(shuō)明書操作提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSlug-siRNA、pNeg-siRNA的細(xì)胞和空白對(duì)照組細(xì)胞總RNA,取1 μ g RNA模按RT試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。引物序列 Slug(156 bp),R:5′-GCA GAC GAC GGG TCA GAT-3′,F:5′-GAC TGA CCC GTC GTG ACG-3′;反應(yīng)條件:50℃30 min,94℃2 min,94℃30 s,55℃30 s,72℃1 min,72℃延伸7 min,28個(gè)循環(huán)。取5 μ L反應(yīng)產(chǎn)物在含 EB的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳,用SYNGENE型凝膠成像系統(tǒng)照像,以目的基因條帶和內(nèi)參G3PDH條帶掃描峰下面積之比作為目的基因的相對(duì)表達(dá)量。試驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以表示。

1.3.3 Western-blot測(cè)定Slug蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western-blot檢測(cè):十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠濃度為12%,積層膠濃度為5%,上樣量為15 μ g/L;SDS電泳:恒流,每塊板20～40 mA,電泳時(shí)間約2 h;轉(zhuǎn)膜:恒流,每張膜42 mA,時(shí)間 3.5 h。

1.3.4 體外侵襲實(shí)驗(yàn) 將matrigel按每孔 40 μ L均勻地鋪在millicell膜上,37℃成膠30 min,置紫外燈照射過(guò)夜,實(shí)驗(yàn)前再次成膠30 min。待培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞達(dá)80%飽和度時(shí),消化、計(jì)數(shù),取不同處理組細(xì)胞2.0×10個(gè),分別接種到成膠的millicell內(nèi),將millicell小室置于24孔板內(nèi),用含10%BS的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)48 h后,取出millicell用棉頭擦掉matrigel,少量磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次,95%的乙醇固定15 min,HE染色,揭下 millicell膜反貼在載玻片上。結(jié)果判定:在200倍光鏡下,每個(gè)濾膜分別計(jì)數(shù)5個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù),并計(jì)算每個(gè)視野的平均穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3.5 建立模型 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 3個(gè)組細(xì)胞,經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化,離心去上清液后用 PBS重懸細(xì)胞,以MTT測(cè)定細(xì)胞活力在95%以上,調(diào)整細(xì)胞濃度為 5×106/mL。用帶有6號(hào)針頭的注射器吸取100 μ L細(xì)胞懸液,接種于裸鼠右背皮下,常規(guī)飼養(yǎng)。待3周后腫瘤形成并長(zhǎng)至一定體積時(shí),無(wú)菌條件下切取腫瘤組織,剪成10 mm3大小的組織塊,生理鹽水漂洗后接種在裸鼠脾窩或胰腺表面,固定。每只3塊,觀察8周,每組10只。

1.3.6 觀察指標(biāo) 觀察裸鼠的一般情況,攝食,活動(dòng)能力。8周后CO2吸入法處死裸鼠,觀察腹腔腫瘤的轉(zhuǎn)移情況以及腫瘤的生長(zhǎng)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS10.10軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果用表示,采用 t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Slug mRNA表達(dá)的變化 空白對(duì)照組、pNeg-siRNA、pSlug-siRNA組細(xì)胞Slug mRNA表達(dá)水平分別為0.826±0.040、0.812 ±0.042、0.147±0.010,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),說(shuō)明 pSlug-siRNA組細(xì)胞Slug mRNA表達(dá)被有效沉默,見(jiàn)圖 1。

2.2 Western-blot檢測(cè) 空白對(duì)照、pNeg-siRNA、pSlug-siRNA組細(xì)胞Slug蛋白表達(dá)水平分別為 0.742±0.035、0.710±0.038、0.103±0.000,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),說(shuō)明pSlug-siRNA組細(xì)胞Slug表達(dá)被有效沉默(圖2)。

圖1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后不同組細(xì)胞中Slug mRNA表達(dá)的變化

圖2 Western-blot檢測(cè)Slug表達(dá)

2.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè) pSlug-siRNA組穿透基底膜細(xì)胞數(shù)(35±10)明顯少于空白對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)(228±71)及pNegsiRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)(219±72),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),空白對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)與pNeg-siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見(jiàn)封2圖 3。

2.4 Slug干擾抑制腹腔種植瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移 3個(gè)組裸鼠建立自發(fā)轉(zhuǎn)移模型后2周,可以在裸鼠腹部逐漸捫及腫塊,開(kāi)始時(shí)腫塊小、約1 mm大小,質(zhì)地硬,活動(dòng)度大。隨著時(shí)間延長(zhǎng),pNeg-siRNA組和空白對(duì)照組裸鼠腹部腫塊逐漸增大增多,部分腫塊融合成塊而固定不動(dòng),向腹腔外突出。從第5周開(kāi)始,腹腔逐漸出現(xiàn)腹水,并逐漸增多,晚期表現(xiàn)為大量腹水。第8周開(kāi)始,裸鼠出現(xiàn)攝食減少、進(jìn)行性消瘦、行動(dòng)遲緩、反應(yīng)遲鈍及嗜睡的表現(xiàn)。相對(duì)而言,pSlug-siRNA組裸鼠腹部腫塊增長(zhǎng)速度緩于空白對(duì)照組和pNeg-siRNA組,腹部觸摸腫塊數(shù)目較少,融合腫塊較少,部分裸鼠處死時(shí)沒(méi)有出現(xiàn)腹水,消瘦程度也較輕。開(kāi)腹后可見(jiàn)pNeg-siRNA組有4只裸鼠發(fā)生肝轉(zhuǎn)移,空白對(duì)照組有3只裸鼠發(fā)生肝轉(zhuǎn)移,pSlug-siRNA組裸鼠無(wú)肝轉(zhuǎn)移發(fā)生。在腹膜、網(wǎng)膜、腸系膜、腸管、胃壁上有大小不一的灰白色結(jié)節(jié),質(zhì)硬,小于2 mm的結(jié)節(jié)為圓形,大于3 mm的結(jié)節(jié)形狀不規(guī)則,或呈融合狀,與周圍的組織器官浸潤(rùn)粘連固定,并可見(jiàn)腹水,量不等。3組裸鼠腹腔種植瘤的數(shù)目(圖4),pSlug

siRNA組裸鼠腹腔種植瘤數(shù)目明顯少于pNeg-siRNA組和空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),而pNeg-siRNA組和空白對(duì)照組裸鼠腹腔種植瘤數(shù)目差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。3個(gè)組裸鼠腹腔種植瘤的腹部外觀、肝臟標(biāo)本、肝轉(zhuǎn)移及消化道標(biāo)本(封2圖5～7,封3圖8～9)。3個(gè)組裸鼠原位移植瘤重量比較,見(jiàn)圖10。

圖4 3個(gè)組裸鼠自發(fā)轉(zhuǎn)移型腹腔種植瘤數(shù)目對(duì)比

圖10 3個(gè)組裸鼠原位移植瘤重量對(duì)比

3 討 論

胰腺癌具有隱匿性和高度侵襲性特點(diǎn),因此早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移,而胰腺癌早期癥狀不典型,確診時(shí)大多已處于晚期,且大多數(shù)患者是外科手術(shù)不能治愈的,3年生存率不足10%,5年生存率低于5%,迄今為止,胰腺癌仍然是臨床治療最為困難的消化道惡性腫瘤之一。胰腺癌對(duì)目前使用的化療和放療等治療方法具有高度的抵抗性,新的藥物如Gemcitabine,雖然已經(jīng)成為中晚期胰腺癌治療的首選用藥,但最終會(huì)產(chǎn)生耐藥性,上述方法除了能達(dá)到減壓和減輕疼痛癥狀的目的外,卻不能控制胰腺癌腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移,也不能顯著延長(zhǎng)患者的中位生存時(shí)間,因此需要探索新的胰腺癌治療方法。

腫瘤的基因治療是針對(duì)腫瘤發(fā)生的遺傳學(xué)背景,將外源性目的基因引入腫瘤細(xì)胞或其他體細(xì)胞內(nèi)以糾正過(guò)度活化或補(bǔ)償缺陷的基因,從而達(dá)到治療腫瘤的目的,因此,尋找理想的靶基因是腫瘤基因治療的前提。Slug是轉(zhuǎn)錄因子SNAIL家族中編碼鋅指蛋白的基因,Slug既能下調(diào)腫瘤細(xì)胞內(nèi)E-cadherin表達(dá),又能上調(diào)細(xì)胞內(nèi)VEGF蛋白表達(dá),因此,Slug與惡性腫瘤血管生成有關(guān)。多個(gè)研究報(bào)道,Slug在多種惡性腫瘤中存在明顯上調(diào),Slug上調(diào)的腫瘤容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、較深的腫瘤浸潤(rùn)深度和較差的預(yù)后[1-8]。盡管某些腫瘤Slug上調(diào)不顯著,如結(jié)直腸癌,但Slug陽(yáng)性表達(dá)與 Dukes分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后明顯相關(guān)[9]。因此,干擾Slug可能具有抗胰腺癌血管生成和轉(zhuǎn)移作用。

本研究將pSlug-siRNA作用于PANC-1細(xì)胞后,Slug的蛋白水平和基因水平都受到明顯的抑制,說(shuō)明Slug基因被有效沉默。本研究用Matrigel模擬基底膜建立體外侵襲模型,通過(guò)pSlug-siRNA干擾PANC-1細(xì)胞Slug基因后,研究其侵襲和轉(zhuǎn)移能力影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),pSlug-siRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于空白對(duì)照組及pNeg-siRNA組,而空白對(duì)照組及pNegsiRNA組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),提示 RNA干擾Slug基因可降低胰腺癌細(xì)胞的侵襲潛力。

通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí),pSlug-siRNA干擾PANC-1細(xì)胞Slug基因表達(dá)后,實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移被明顯抑制。因此認(rèn)為Slug與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。通過(guò)RNA干擾抑制Slug基因的表達(dá)可降低人胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移潛能,抑制胰腺癌腫瘤生長(zhǎng),為胰腺癌基因治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

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