鄧嘉虹,蔡春春,梁傳余,姜鶴群,張 林

(1.云南省第一人民醫(yī)院耳鼻喉科,昆明 650032;2.四川大學(xué)華西醫(yī)院耳鼻喉科,成都 610041)

耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(spiral ganglion neuron,SGN)的體外機(jī)械分離及酶解是在體外實(shí)驗(yàn)條件下研究聽覺傳導(dǎo)通路中神經(jīng)元的形態(tài)功能和特性的重要方法。由于耳蝸骨化常發(fā)生于哺乳動物生后極短時間內(nèi),使SGN的體外分離和酶解尤為困難。國內(nèi)能進(jìn)行SGN研究的實(shí)驗(yàn)室通常采用直接酶解的方法,而比較直接酶解和機(jī)械分離后酶解,前者因應(yīng)用蛋白酶濃度高較后者對神經(jīng)細(xì)胞突起的損傷更大,因此本研究選用出生1～6 d的乳小鼠進(jìn)行SGN的機(jī)械分離、酶解、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。SGN的A型鉀通道具有激活迅速、失活迅速的特點(diǎn),利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)對通道電生理特性進(jìn)行記錄和分析,可以進(jìn)一步研究聽覺傳導(dǎo)通路的機(jī)理?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 SGN細(xì)胞分離、酶解與鑒定

1.1.1 SGN的體外分離 選用出生1～6 d發(fā)育正常的昆明種乳小鼠,共10只(20耳),在解剖顯微鏡(Laica公司生產(chǎn))下沿小鼠頭顱矢狀面正中剖開,分別去除大腦和小腦組織,在枕骨大孔正上方找到并取出耳蝸組織,置入盛有 pH 7.4的Hank′s平衡鹽溶液中。高倍鏡下分離并去除骨性耳蝸。同樣方法分離對側(cè)。將分下之膜性耳蝸沿螺旋緣處將外側(cè)血管紋、Corti′s器去除,僅剩余內(nèi)側(cè)螺旋神經(jīng)節(jié)組織部分,將神經(jīng)組織輕柔的分離并切割,避免損傷神經(jīng)元細(xì)胞。

1.1.2 SGN的酶解 將SGN組織塊仔細(xì)吸入小瓶中,靜置后吸去上層Hank′s平衡鹽溶液,并用 D-Hank′s平衡鹽溶液洗滌組織塊。將解凍的2%的胰蛋白酶原液1 mL加入盛有SGN組織塊的小瓶中孵育,并間或輕柔搖晃。酶解完畢后加入含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液終止酶解,并進(jìn)行機(jī)械吹打。將細(xì)胞懸液離心后吸出細(xì)胞懸液,靜置在經(jīng)多聚賴氨酸處理過的培養(yǎng)皿中的蓋玻片上貼片,隨時在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況,并用細(xì)胞外液小心置換含血清的培養(yǎng)液,直至細(xì)胞外液清澈。

1.1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 采用1∶100小鼠源神經(jīng)微絲200單克隆抗體(Sigma,N-0142)作為一抗,1∶100異硫氰酸鹽熒光素標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(北京中山公司生產(chǎn))作為二抗對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色鑒定,陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)或山羊血清替代一抗反應(yīng)。熒光顯微鏡下顯亮綠色的細(xì)胞即陽性細(xì)胞,即SGN細(xì)胞。

1.2 溶液成分

1.2.1 電極內(nèi)液 成分(mmol/L):KCl 112,MgCl22,CaCl20.1,EGTA 11,Hepes 10,用KOH調(diào)節(jié) pH值為 7.4,調(diào)節(jié)滲透壓為310 mOsm/L。

1.2.2 細(xì)胞外液 成分(mmol/L):NaCl 137,KCl 5,CaCl21.7,MgCl21,葡萄糖 17,蔗糖 50,Hepes 10,用 NaOH 調(diào)節(jié)pH值為7.5,調(diào)節(jié)滲透壓為300 mOsm/L。

1.2.3 終止酶解用細(xì)胞培養(yǎng)液 90%杜伯科改良的伊格爾培養(yǎng)基,10%胎牛血清,pH值為7.3～7.4。

1.2.4 A型鉀通道阻滯劑 4-氨基吡啶(4-AP)的濃度為0.15 mmol/L,為了更好地觀察外向A型鉀通道電流,應(yīng)用0.05 μ mol/L的 TTX(河豚毒素)在細(xì)胞外阻滯內(nèi)向鈉電流。

1.3 SGN細(xì)胞A型鉀通道的電生理特性

1.3.1 全細(xì)胞電壓鉗模式的形成和細(xì)胞外給藥 采用三步拉制儀拉制硅硼玻璃微電極,并在電極尖端涂布硅酮樹脂和進(jìn)行熱拋光,使玻璃微電極尖端直徑小于 1 μ m,阻抗為 3～7 mΩ。在微操縱儀的推動下,讓玻璃微電極尖端接觸SGN細(xì)胞膜,并應(yīng)用負(fù)壓抽吸使電極尖端和細(xì)胞膜形成高阻封接,封接電阻在10 gΩ以上,對膜片造成電化學(xué)隔離。高阻封接穩(wěn)定后,通過負(fù)壓抽吸使吸附于電極尖端的一小片細(xì)胞膜破裂,從而形成全細(xì)胞的膜片鉗記錄模式。實(shí)驗(yàn)使用“Y管”胞外給藥裝置進(jìn)行局部細(xì)胞外微灌流給藥。Y管給藥尖端距目標(biāo)細(xì)胞100～200 μ m,藥液高于 Y管20～40 cm以便其能有足夠的重力流出Y管,該給藥系統(tǒng)能在20 ms內(nèi)使目標(biāo)細(xì)胞周邊的外液完全被交換。

1.3.2 A型鉀通道電流記錄參數(shù)的設(shè)定 激活刺激參數(shù),鉗制電壓(VH):-100 mV(VH1),-60 mV(VH2);命令電壓:由-120 mV至+40 mV,步長10 mV,時程500 ms。失活刺激參數(shù),VH:-100 mV,給予-120 mV至+30 mV的預(yù)脈沖,步長10 mV,再給予+40 mV的實(shí)驗(yàn)脈沖,兩脈沖時程均為500 ms?；謴?fù)刺激參數(shù),VH:-100 mV,給予+40 mV的雙脈沖刺激,間隔10 ms,并以5 ms增益逐漸增大。

2 結(jié) 果

2.1 SGN的分離和免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 所有小鼠耳蝸SGN細(xì)胞的機(jī)械分離和酶解均獲成功。在倒置相差顯微鏡下觀察SGN細(xì)胞稍呈橢圓形,胞體邊緣光滑,細(xì)胞透明,折光性良好,并可見胞質(zhì)顆粒。細(xì)胞大多數(shù)有兩個突起,少數(shù)有一個突起,并且還發(fā)現(xiàn)極少數(shù)細(xì)胞有三個突起(封3圖1)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示SGN細(xì)胞胞體呈現(xiàn)明顯的亮綠色,可見橢圓形的胞體和神經(jīng)突起,顯陽性,見封3圖2。

2.2 A型鉀通道的記錄和分析

2.2.1 A型鉀通道的激活、失活和恢復(fù) 在細(xì)胞外液中加入河豚毒素(TTX)抑制內(nèi)向鈉電流后,應(yīng)用-100 mV及-60 mV兩個不同的鉗制電壓,25～50 ms的預(yù)脈沖時間,得到兩個外向電流圖形,兩圖相減后得到分離出的A型鉀電流,表現(xiàn)為瞬間活化,迅速失活的外向電流特性,可見電流圖和電流-電壓關(guān)系曲線(圖3、4)。A型鉀通道在-60 mV迅速活化,于+40 mV達(dá)到峰值,對其進(jìn)行擬合得到其活化時間常數(shù)(τ act)為(0.785±0.04)ms,其二分之一最大活化電壓(V1/2)為-2.5 mV,斜率k為3.4 mV(n=30)。

給予-120 mV至+30 mV的預(yù)脈沖,步長10 ms,激活A(yù)型鉀通道,再給予+40 mV的實(shí)驗(yàn)脈沖,可以記錄到A型鉀通道的失活過程(圖5)。其失活過程符合二次冪方程,失活時間常數(shù)(τ inact)分別為(150.5±19.5)ms和(32.5±5.1)ms,其二分之一最大失活電壓(V1/2)為-72.3 mV,斜率k為3.7 mV(n=30)。

將細(xì)胞鉗制于-100 mV,給予兩個+40 mV的實(shí)驗(yàn)脈沖,兩脈沖間隔時間從10 ms逐漸增大(增益為5 ms),可以記錄到A型鉀通道的恢復(fù)情況(圖6),其恢復(fù)過程也符合二次冪方程,恢復(fù)時間常數(shù)(τ rec)分別為(108.3±12.6)ms和(23.9±2.9)ms(n=8)。

2.2.2 4-AP對A型鉀通道的阻滯和洗脫 4-AP為一種透膜的鉀通道阻滯劑,對A型鉀通道的作用較延遲整流鉀通道強(qiáng),在細(xì)胞外液中加入0.15 mmol/L的4-AP,A型鉀通道電流峰值明顯減小,并且隨著細(xì)胞外液中4-AP的劑量增大,A型鉀電流峰值逐漸變小。當(dāng)4-AP作用穩(wěn)定以后,用細(xì)胞外液逐漸洗脫4-AP,A型鉀電流恢復(fù)到加藥以前的水平,見圖7。

圖3 A型鉀電流圖

圖4 A型鉀通道電流I-V曲線

圖5 A型鉀通道的失活曲線

圖6 A型鉀通道的恢復(fù)曲線

圖7 4-AP對A型鉀通道電流的影響

3 討 論

螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞的胞體位于螺旋神經(jīng)節(jié)內(nèi),是聽覺傳導(dǎo)通路上的第1級神經(jīng)元,屬高度分化的終末細(xì)胞。哺乳動物和人聽神經(jīng)的神經(jīng)元細(xì)胞體位于耳蝸骨螺旋板與蝸軸相接處的Rosenthal隧道里,形成螺旋神經(jīng)節(jié)。根據(jù)細(xì)胞大小、神經(jīng)突起的形態(tài)和是否具有髓鞘,SGN分為兩型:Ⅰ型細(xì)胞為雙極神經(jīng)元,占SGN細(xì)胞的絕大多數(shù)(95%),它與內(nèi)毛細(xì)胞形成突觸、中樞突組成聽神經(jīng);Ⅱ型細(xì)胞為假單極神經(jīng)元,與外毛細(xì)胞形成突觸。由于小鼠在生后很短時間范圍內(nèi)(7～10 d)耳蝸就發(fā)生骨化,并且Ⅰ型SGN細(xì)胞在生后一周內(nèi)細(xì)胞髓鞘形成并開始分化出Ⅱ型細(xì)胞[1],本試驗(yàn)采用骨性耳蝸相對較軟較薄的新生1～6 d的小鼠進(jìn)行試驗(yàn),利于耳蝸的解剖、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的機(jī)械分離和酶解,以及全細(xì)胞膜片鉗高阻封接的形成。

為了證實(shí)酶解神經(jīng)細(xì)胞的性質(zhì),本研究采用了免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的方法。神經(jīng)微絲蛋白(NFP)是神經(jīng)細(xì)胞骨架中的重要組成成分,存在于SGN的細(xì)胞胞體和突起中,分為3個亞單位,分別為68 000、160 000和 200 000[2],本實(shí)驗(yàn)中僅采用了200 000亞單位抗體作為一抗獲得成功染色,證實(shí)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為SGN細(xì)胞。

本試驗(yàn)在急性分離的SGN細(xì)胞上記錄到瞬時外向鉀電流成分,通道在-60 mV左右開始激活,并對4-AP敏感,具有典型瞬時外向鉀通道的特性。A型鉀通道以瞬時出現(xiàn)、快速激活、快速失活為特點(diǎn),故又稱為瞬時外向鉀電流(Ito)通道。它是在動作電位早期或細(xì)胞去極化早期出現(xiàn)的一種外向鉀電流,該電流的大小對動作電位的形態(tài)和時程有較大的影響。SGN的動作電位有一超極化時相,當(dāng)細(xì)胞膜再次去極化而興奮時,A型鉀通道被激活,以延遲去極化達(dá)閾電位的時間,即A型鉀通道可以控制SGN的發(fā)放頻率。另外A型鉀電流(IA)在聽覺形成中的作用,可能還與其快速失活特性有關(guān),并可能通過短暫超極化細(xì)胞膜電位來調(diào)節(jié)細(xì)胞興奮性。IA通過調(diào)節(jié)突觸后膜(毛細(xì)胞與SGN傳入纖維形成的突觸)的興奮性來調(diào)節(jié)毛細(xì)胞與SGN之間的突觸效能,并通過減低峰電位的超極化后電位的衰減率來影響重復(fù)放電的頻率,由此限制毛細(xì)胞受體電位的頻率反應(yīng)。并且它可能通過調(diào)節(jié)突觸后電位和降低峰間期來確立放電頻率的上限[2-4]。Jagger和Housley[5]在原位新生大鼠聽神經(jīng)元的組織切片膜片鉗實(shí)驗(yàn)中,記錄到IA,當(dāng)Vh在-60 mV時,A型鉀通道激活,在-55 mV時電流迅速上升,并且在-30～-40 mV時通道迅速失活,在靜息膜電位下,A型鉀通道構(gòu)成了30%的細(xì)胞電導(dǎo),IA在這種膜電位下構(gòu)成了60%的去極化電流。應(yīng)用4-AP抑制A型鉀通道后,SGN的動作電位釋放增加,適應(yīng)性降低,證實(shí)其對動作電位復(fù)極化有影響。本實(shí)驗(yàn)用-100 mV預(yù)脈沖條件記錄的電流減去-60 mV預(yù)脈沖引出的電流,分離出瞬時外向鉀電流,并進(jìn)行失活、恢復(fù)等特性的研究,結(jié)果與文獻(xiàn)[5]研究相似,表明嚙齒類動物的IA生理特性比較相似。本研究在出生1～6 d的小鼠SGN細(xì)胞中記錄到IA,表明出生后A型鉀離子通道已經(jīng)基本發(fā)育成熟,至于其通道蛋白的表達(dá)可能主要為編碼KV 3.4和KV4亞單位基因家族所控制[6]。

Jagger和Housley[5]認(rèn)為A型鉀通道可能主要集中在胞體和突觸近端,而Szabo等[7]的研究表明,抑制IA對細(xì)胞放電特征中的快速失活特性沒有影響,因此認(rèn)為A型鉀通道存在于SGN突觸末端。由于急性分離SGN細(xì)胞的過程破壞了較多的神經(jīng)突起,而使其較培養(yǎng)的SGN細(xì)胞IA的表達(dá)少[7-8]。本研究中IA在急性分離細(xì)胞中的出現(xiàn)可能與某些時候細(xì)胞酶解后細(xì)胞狀態(tài)好、細(xì)胞突起保存較好,細(xì)胞本身的通道特性得到充分的表達(dá)有關(guān)。而IA的出現(xiàn)與神經(jīng)元細(xì)胞在耳蝸的位置、細(xì)胞的大小、小鼠的天齡無關(guān)?？梢哉J(rèn)為體外急性酶解SGN細(xì)胞本身應(yīng)具有A型鉀通道,但是通道的表達(dá)要求較高,一旦外界環(huán)境,諸如溫度、濕度、細(xì)胞外液和電極內(nèi)液的 pH值、蛋白酶及終止液的濃度和終止時間的細(xì)微變化均可導(dǎo)致A型鉀通道的不表達(dá)。這說明體外急性分離SGN細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)技術(shù)需要進(jìn)一步嚴(yán)格控制,而SGN的A型鉀通道存在的位置以及在聽覺傳導(dǎo)過程中的作用還有待進(jìn)一步研究和探討。

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