唐樹彬,李少林,彭 杰,鄒安娜,羅 弋

(1.四川省內(nèi)江市第一人民醫(yī)院腫瘤科 641000;2.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院核醫(yī)學(xué)教研室 400016)

人源乳腺癌噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建及初步篩選*

唐樹彬1,李少林2△,彭 杰1,鄒安娜1,羅 弋2

(1.四川省內(nèi)江市第一人民醫(yī)院腫瘤科 641000;2.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院核醫(yī)學(xué)教研室 400016)

目的構(gòu)建人源乳腺癌噬菌體單鏈抗體庫(kù),并篩選乳腺癌特異性單鏈抗體(Scfv)。方法利用乳腺癌患者癌旁淋巴組織來(lái)構(gòu)建抗乳腺癌噬菌體抗體庫(kù)。通過(guò)正常乳腺細(xì)胞(MCF-10F)和乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)篩選富集后,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)噬菌體抗體活性。結(jié)果成功的構(gòu)建了1個(gè)4.2×107的噬菌體抗體庫(kù),并從該庫(kù)中篩選到6株對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7有結(jié)合活性的陽(yáng)性克隆。結(jié)論從人源乳腺癌噬菌體抗體庫(kù)中篩選到6株特異性噬菌體抗體,為下一步進(jìn)行單鏈抗體的乳腺癌放射性核素顯影及治療奠定了基礎(chǔ)。

乳腺癌;噬菌體抗體庫(kù);篩選;單鏈抗體

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一,全世界每年約有120萬(wàn)婦女發(fā)生乳腺癌,有50萬(wàn)婦女死于乳腺癌,發(fā)病率占全年各種惡性腫瘤的7%～10%[1]。我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率雖較西方國(guó)家為低,但近年來(lái)亦有上升趨勢(shì)。目前,以超聲及X線等為主的乳腺癌診斷方法,對(duì)早期乳腺癌的診斷尚缺乏足夠的準(zhǔn)確性和特異性。而以手術(shù)、化療和放療及生物治療為主的綜合治療又因不良反應(yīng)太大而在臨床應(yīng)用中受到一定限制。因此,許多學(xué)者把目光投向了乳腺癌的抗體診斷及治療。1985年Smith[2]提出了噬菌體展示技術(shù)概念;1992年Huse等[3]成功地構(gòu)建第1個(gè)噬菌體組合文庫(kù),為腫瘤的診斷及治療提供了一種全新的方法。但是,目前報(bào)道的抗乳腺癌噬菌體抗體庫(kù)多為鼠源性,因人抗鼠免疫反應(yīng)而不適合臨床運(yùn)用。本研究利用乳腺癌患者癌旁淋巴細(xì)胞來(lái)構(gòu)建人源性抗乳腺癌抗體庫(kù),從而避免了人抗鼠免疫反應(yīng)而適合于臨床運(yùn)用。

1 材料與方法

1.1 材料 RNA抽提試劑盒(RNA Kit)、質(zhì)粒抽提試劑盒(Plasmid Kit)購(gòu)自上海華舜生物工程有限公司。RT-PCR試劑盒(RNA PCR Kit)、SfiⅠ和 NotⅠ限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶為大連寶生物公司產(chǎn)品。噬菌粒載體pCANTAB5E、輔助噬菌體M13K07、大腸埃希菌E.coli TG1、鼠抗 M13噬菌體單克隆抗體(Anti-M13 Monoclonal Antibody)、辣根過(guò)氧標(biāo)記的羊抗鼠抗克隆抗體(HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate)均購(gòu)自法瑪西亞。正常乳腺細(xì)胞MCF-10F、乳腺癌細(xì)胞MCF-7為本實(shí)驗(yàn)室保存。引物參照Xu等[4]設(shè)計(jì),由北京三博志遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司合成。

擴(kuò)增 VH(重鏈可變區(qū))基因的引物:5′-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC-3′;5′-CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG-3′。 擴(kuò)增 VL(輕鏈可變區(qū))基因 的引物:5′-ACG TT T GAT CTC CAC CT T GGT CCC-3′;5′-GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT CC-3′。VH連接Linker的引物:5′-AGA GCC ACC TCC GCC TGA ACC GCC TCC ACC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC-3′;5′-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC-3′。 VL 連接 Linker 的引物:5′-GTT CAG GCG GAG GTG GCT CTG GCG GTG GCG GAT CGG ACA TCS WGA TGA C CC AGT CTC C-3′(S.W 為兼并引 物);5′-GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT CC-3′。Scfv(單鏈抗體可變區(qū))擴(kuò)增的引物(引物的帶有SfiⅠ和NotⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn)):5′-GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG-3′;5′-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG T TT GAT CTC CAC CT T GGT CCC-3′。

1.2 方法

1.2.1 組織來(lái)源 將術(shù)中分離的乳腺癌患者癌旁淋巴結(jié)用無(wú)菌紗布包好后迅速放入液氮中凍存。共取14例患者癌旁淋巴結(jié),其病理分型,見表1。

1.2.2 總RNA的提取 首先在盛有液氮的碾缽中迅速把淋巴組織碾成粉末,這樣可以使組織脆硬同時(shí)防止 RNA破壞[5]。然后再利用RNA抽提試劑盒進(jìn)行提取,得到總RNA。

1.2.3 VH和VL基因片段的擴(kuò)增 首先,通過(guò)以O(shè)ligo dTAdaptor primer作為引物合成 cDNA,PCR條件:50℃ 30 min,99℃5 min,5℃5 min,1個(gè)循環(huán)。然后以cDNA為模板,以上下游引物配對(duì)分別擴(kuò)增輕鏈基因片段和重鏈基因片段,PCR條件:94℃2 min,1個(gè)循環(huán);94℃30 s,55℃30 s,72℃90 s,30個(gè)循環(huán)。最后利用Linker引物分別擴(kuò)增VH-Linker基因片段和VL-Linker基因片段,PCR條件:94℃2 min,1個(gè)循環(huán);94℃30 s,60℃30 s,72℃90 s,35個(gè)循環(huán)。得到VH-Linker基因片段和 VL-Linker基因片段。

表1 患者的病理分型(n)

1.2.4 Scfv基因片段的連接及PCR擴(kuò)增 通過(guò)重疊-延伸-拼接PCR(SOE-PCR)形成單鏈抗體(Scfv)基因片段。先將膠回收純化的VH-Linker基因片段和VL-Linker基因片段進(jìn)行連接,反應(yīng)條件為:94℃5 min,1個(gè)循環(huán);94℃1 min,60℃1 min,72℃90 s,5個(gè)循環(huán)。從而將VH基因片段和VL基因片段連接形成Scfv基因片段。然后再向反應(yīng)體系中加入Scfv擴(kuò)增的引物(帶有酶切位點(diǎn)),反應(yīng)條件為:94℃30 s,60℃60 s,72℃90 s,5個(gè)循環(huán)。形成兩端分別帶有酶切位點(diǎn)的Scfv基因片段。

1.2.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用T4 DNA連接酶連接經(jīng)SfiⅠ和NotⅠ雙酶切Scfv基因片段和 PCANTAB-5E載體,用電穿孔法轉(zhuǎn)化TG1感受態(tài)細(xì)菌制備參照文獻(xiàn)[6],將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)菌TG1鋪于氨芐青霉素選擇培養(yǎng)基上,培養(yǎng)過(guò)夜,計(jì)算克隆數(shù)。隨機(jī)挑取32個(gè)轉(zhuǎn)化后TG1菌落,分別加入到2-YT培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,提取質(zhì)粒,用PCR檢查DNA中有無(wú)Scfv基因插入。

1.2.6 抗體庫(kù)的構(gòu)建 將陽(yáng)性細(xì)菌克隆鋪于SOBAG平板上37℃培養(yǎng)過(guò)夜,再加入10 mL 2-YT培養(yǎng)液收聚菌液。用2-YT培養(yǎng)液稀釋至A600=0.3。加入氨芐青霉素,終濃度為100 μ g/mL,葡萄糖的終濃度為2%。37℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)1 h,再加入 5.1×1010puf的M13K07至終濃度為4×109,37℃250 r/min振蕩培養(yǎng) 1 h。4 000 g離心20 min,棄上清液。沉淀重懸于100 mL-YTAK培養(yǎng)液,30℃250 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。10 000 g離心10 min沉淀細(xì)菌,取上清液加入1/5的PEG/NaCl,冰浴60 min。10 000 g 4℃離心20 min,棄上清液。沉淀重懸于1 mL 2-YT培養(yǎng)液,10 000 g再次離心10 min,上清液中加入終濃度為0.02%的疊氮鈉,4℃保存。

1.2.7 噬菌體的篩選 取107正常乳腺細(xì)胞(MCF-10F),用2%的脫脂牛奶/磷酸鹽緩沖液(PBS)冰浴1 h,4℃250 r/min離心5 min,棄上清液。用1 mL Scfv噬菌體抗體庫(kù)溶液重懸細(xì)胞,室溫緩搖1 h,4℃250 r/min離心5 min,取上清液。在上清液中加入107MCF-7細(xì)胞,室溫緩搖1 h,4℃250 r/min離心5 min,棄上清液。加入1 mLPBS洗滌細(xì)胞(第1輪洗滌3次,第2輪洗滌 5次,第3輪洗滌 8次,以后洗滌 10次),4℃200 r/min離心5 min,棄上清液。用1 mL 0.2%的 HCL-甘氨酸(pH=2.2)重懸細(xì)胞,冰浴 10 min,用 1 mol/L的 Tris堿(pH=9.1)中和,4℃200 r/min離心5 min。上清液即為第1輪篩選到的噬菌體,取少許感染生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的TG1細(xì)胞 3 mL,鋪SOBAG平板,計(jì)數(shù)重組噬菌體量。其余噬菌體重新進(jìn)行第2輪篩選,共重復(fù)5次篩選。

1.2.8 細(xì)胞ELISA鑒定Scfv的特異性 從第5輪篩選后SOBAG平板上挑取40個(gè)單菌落,制備噬菌體單鏈抗體,分別以MCF-7細(xì)胞和MCF-10F細(xì)胞作為靶抗原做ELISA檢測(cè),檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[7]。將細(xì)胞用0.25%的戊二醛固定于96孔培養(yǎng)板中,以2%脫脂奶粉37℃封閉1 h,將上述單克隆噬菌體Scfv各100 μ L與等體積的2%脫脂奶粉混合,室溫靜置20 min,加入到平板中,以0.05%Tween20-PBS洗滌 6次。加入鼠抗M13噬菌體單克隆抗體為二抗,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠抗體為三抗,以 TM B為底物顯色,450波長(zhǎng)酶標(biāo)儀讀板。

2 結(jié) 果

2.1 總 RNA的鑒定 從淋巴組織中提取總 RNA后,經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。電泳可見明顯的8 s和28 s兩條帶,見圖1。

圖1 RNA

2.2 VH基因片段和VL基因片段的鑒定 VH和V L基因擴(kuò)增后,經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結(jié)果提示VH基因片段在360 bp,VL基因片段在300 bp,見圖 2。

圖2 輕重鏈

2.3 Scfv基因片段的鑒定 VH-Linker基因和VL-Linker基因連接后,利用含有SfiⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。得到含有酶切位點(diǎn)的Scfv基因。利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果提示 Scfv基因在750 bp左右,見圖3。

2.4 質(zhì)粒DNA的PCR檢測(cè) 從SOBAG平板上隨機(jī)挑選32個(gè)單菌落加入3 mL 2-YT培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,取1.5 mL提取質(zhì)粒。質(zhì)粒PCR鑒定提示Scfv基因插入率為81%(26/32),見圖 4。

圖3 單鏈

圖4 質(zhì)粒PCR

2.5 質(zhì)粒DNA的酶切鑒定 將PCR陽(yáng)性的質(zhì)粒用SfiⅠ和NotⅠ雙酶切,用1%的瓊脂糖凝膠電泳后可見在750 bp及4 500 bp處見條帶,見圖5。

圖5 雙酶切圖片

2.6 噬菌體單鏈抗體庫(kù)的篩選 先以ER陰性的正常乳腺細(xì)胞MCF-10F對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行負(fù)性篩選,再以ER陽(yáng)性的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7對(duì)噬菌體Scfv庫(kù)進(jìn)行了5輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的富集篩選。得到1個(gè)4.2×107的噬菌體抗體庫(kù),說(shuō)明特異性的Scfv得到了有效富集,見表2。

2.7 噬菌體Scfv的ELISA鑒定 以MCF-7和M CF-10F為靶抗原進(jìn)行ELISA檢測(cè),其中有6個(gè)噬菌體Scfv與MCF-7細(xì)胞反應(yīng)的P/N值大于MCF-10F的兩倍以上,見圖6。

表2 噬菌體抗體庫(kù)的篩選

圖6 ELISA檢測(cè)噬菌體抗體與MCF-7和MCF-10F細(xì)胞的結(jié)合活性

3 討 論

噬菌體庫(kù)技術(shù)是近20年發(fā)展起來(lái)的一種制備抗體的新技術(shù),噬菌體單鏈抗體具有分子量小,組織穿透性強(qiáng),在靶抗原部位濃聚快等優(yōu)點(diǎn)[7-8],在腫瘤的診斷及治療中有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。但是,目前文獻(xiàn)報(bào)道的是噬菌體單鏈抗體多為鼠源性的抗體,這些抗體因?yàn)槿丝故竺庖叻磻?yīng)而不適合于臨床運(yùn)用。

本實(shí)驗(yàn)直接從乳腺癌患者癌旁淋巴組織中提取總RNA,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR和SOE-PCR合成單鏈抗體基因,再利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建了1個(gè)4.2×107的人源乳腺癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)。實(shí)驗(yàn)中,本研究選擇的患者癌旁淋巴組織來(lái)構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)比用患者外周血淋巴細(xì)胞構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)更易篩選到高親和力的抗體[9]。淋巴轉(zhuǎn)移是乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移方式,本研究選擇乳腺癌患者癌旁淋巴組織來(lái)構(gòu)建抗乳腺癌單鏈抗體基因有助于提高單鏈抗體的敏感性和特異性。同時(shí),本研究選擇病理類型不同及Her2/neu陽(yáng)性與否的乳腺癌患者,增加了抗乳腺癌單鏈抗體基因的多樣性,有利于構(gòu)建較大的抗乳腺癌噬菌體單鏈抗體庫(kù)。

在篩選過(guò)程中本研究采用先低后高的洗滌力度,低洗滌力度保證低豐度的噬菌體抗體不丟失,高洗滌力度則有利于得到高親和力的噬菌體抗體[10]。此外,本研究選擇正常乳腺細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞做正負(fù)差異性篩選。先用ER陰性的MCF-10F細(xì)胞進(jìn)行負(fù)性篩選,既清除了大量的非特異噬菌體,同時(shí)又有效地保護(hù)了抗ER的噬菌體。然后再利用ER陽(yáng)性的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行選擇,從而有效地提高了選擇效率,得到6株高親和力噬菌體抗體。

本實(shí)驗(yàn)成功地構(gòu)建了人源乳腺癌噬菌體單鏈抗體庫(kù),通過(guò)5輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”篩選到6株高親和力噬菌體單鏈抗體,為本研究下一步進(jìn)行單鏈抗體的放射性核素顯影及治療奠定了基礎(chǔ)。

[1] 李少林,陳小品,吳凱南.乳腺癌的生物學(xué)特性和臨床對(duì)策[M].北京:科學(xué)出版社,2004:65.

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Constructing humanize phage antibody library and screening antibody binding to breast cancer*

TANGShu-bin1,LI Shao-lin2△,PENG Jie1,et al.

(1.Department of Oncology,First People′s Hospital of Neijiang,Neijiang,Sichuan641000,China;2.Department of Nuclear Medicine,College of Basic Medicine,Chongqing Medical University,Chongqing400016,China)

ObjectiveTo construct humanize phage antibody library against breast cancer and to screen specificity Scfv to breast cancer.MethodsTo construct phage library from tumor adjacent lymphatic tissue of breast cancer patients.After screening and amplifying by normal lacteal gland cell(MCF-10F)and breast cancer cell(MCF-7),the binding activity of antibody was detected by ELISA.ResultsA phage antibody of 4.2×107was obtained and six active clones against breast cancer cell MCF-7 were gained from the Scfv library.ConclusionSix antibody binding to breast cancer cell more strongly were identified from humanize phage antibody library.This work provides us the basis for radionuclide imaging and therapy for breast cancer.

breast cancer;phage antibody library;screening;Scfv

R737.9;R730.44

A

1671-8348(2010)05-0516-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30370422)。△

,電話:(023)68485007。

2009-07-21

2009-09-10)

?論 著?