孫芬芬 綜述,葉小群審校

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科,江西 南昌 330006)

腫瘤治療的障礙之一是出現(xiàn)多藥耐藥(multidrug resistance,MDR),多數(shù)化療方案可以消滅大部分腫瘤細胞但始終缺乏從根本上鏟除腫瘤的方法。對腫瘤多藥耐藥發(fā)生機制的研究和尋找開發(fā)逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物是當(dāng)前腫瘤化療研究的重要課題。近年來,科學(xué)家陸續(xù)從實驗中找到并分離出腫瘤干細胞而提出“腫瘤干細胞假說”,這一假說為腫瘤治療開拓了新思路。隨著對腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)研究的深入,發(fā)現(xiàn)CSCs和正常干細胞有很多相似之處,如同樣具有自我更新和分裂增殖能力、耐藥、DNA修復(fù)活性和抗凋亡等。其耐藥性幫助CSCs抵抗化療藥物的毒性作用,從而為腫瘤增殖和復(fù)發(fā)留下“種子”。本文就CSCs及其耐藥機制相關(guān)研究進行綜述。

1 CSCs的概念

CSCs的概念由 Lapidot等在 1994年首次提出,認為在瘤體內(nèi)存在類似于干細胞功能的一類細胞群體.將這類具有形成腫瘤能力的細胞群體稱為CSCs。Bonnet等首先分離出類似正常干細胞的白血病干細胞,體外培養(yǎng)和動物實驗證明其具有成瘤能力。實體瘤干細胞的分離最早是2003年A1-Hajj等從乳腺癌細胞中分離鑒定出具有干細胞類似生物學(xué)特性的細胞群體。采用類似的研究方法,其他實體瘤CSCs也被陸續(xù)分離出來。

通過對多藥耐藥的長期研究,研究人員已經(jīng)找到了一群與腫瘤多藥耐藥相關(guān)的蛋白,其中ABC轉(zhuǎn)運蛋白被發(fā)現(xiàn)與CSCs密切相關(guān)。人類多藥耐藥基因1(MDR1基因)編碼P-糖蛋白(P-gp/ABCB1),其作用是作為各種抗癌藥物外排泵。最近研究表明雌激素能下調(diào)乳腺癌耐藥蛋白(BCRP/ABCG2)的表達和多藥耐藥基因轉(zhuǎn)導(dǎo)P-gp的表達水平,因此調(diào)節(jié)P-gp的表達水平在乳腺癌的治療中可能是一種有效的策略[1]。深入理解多藥耐藥的分子基礎(chǔ)和開發(fā)臨床試劑及治療策略是防止耐藥性發(fā)生的關(guān)鍵[2]。

2 CSCs的耐藥機制

CSCs是造成腫瘤耐藥的最根本原因?，F(xiàn)有治療腫瘤的方法主要是針對腫瘤組織內(nèi)的大多數(shù)細胞,而不是CSCs。CSCs多處于細胞G0期,具有很高的端粒酶活性及DNA復(fù)制修復(fù)能力,通過高表達ABC轉(zhuǎn)運蛋白和抗凋亡基因等而逃避化療及放療,最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

2.1 ABC轉(zhuǎn)運蛋白的藥泵作用 三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC轉(zhuǎn)運蛋白)是一類跨膜蛋白,可轉(zhuǎn)運肽類、內(nèi)源性脂類、核苷酸、藥物霉素等。目前研究較深入的ABC轉(zhuǎn)運蛋白主要有 ABCB1、ABCC1、ABCG2。它們利用ATP分解產(chǎn)生的能量主動將細胞內(nèi)的藥物泵出降低細胞內(nèi)藥物濃度,從而保護自身免受細胞毒性藥物的損傷,對化療不敏感。Kondo等[3]研究認為在體外已經(jīng)建株的腫瘤細胞系中也存在具有干細胞功能相類似的細胞群體,將該類細胞群稱為SP(side population)細胞。SP細胞最初是Goodell等在用DNA染料Hoechst33342為鼠造血干細胞染色并進行熒光活化細胞分選系統(tǒng)分選時發(fā)現(xiàn)的,其染色偏低。研究表明SP細胞染色偏低的原因是其細胞膜上的 ABCG2將 Hoechst33342泵到細胞外。研究還發(fā)現(xiàn)不同組織來源的SP細胞均表達ABCG2/Bcrpl,其功能被認為與參與腫瘤細胞的多藥抗性有關(guān)。Zhou等[4]對SP細胞在胰腺癌細胞系PANC-1中的作用及耐藥機制的研究中發(fā)現(xiàn),SP細胞固有的高抗化療藥物有助于腫瘤的復(fù)發(fā)。Jin等[5]在神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞中證實有ABCG2表達且其表達水平與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的病理分級呈正相關(guān),研究還發(fā)現(xiàn)ABCG2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤對米托蒽醌等化療藥物產(chǎn)生耐藥中起關(guān)鍵作用。

2.2 高水平表達抗凋亡基因 誘導(dǎo)細胞凋亡是眾多化療藥物殺傷腫瘤細胞的共同機制。bcl-2是一類新的癌基因家族,按其對凋亡的調(diào)節(jié)功能可分為抑制凋亡基因(如 bcl-2,bcl-x,bclw,Mcl-1,AL/Bfl-1等)和促進凋亡基因(bax,bcl-xs,bad,bak,等),其過度表達使化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用轉(zhuǎn)變?yōu)閷毎劳龅囊种贫退?。除bcl-2外,CSCs也持續(xù)表達一些其他抗凋亡基因參與耐藥,如死亡相關(guān)蛋白激酶(DAPK)。DAPK是一種鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,負責(zé)啟動誘導(dǎo)程序性細胞死亡,其啟動子區(qū)CpG島高甲基化使基因轉(zhuǎn)錄沉默而失去功能,與腫瘤細胞的形成轉(zhuǎn)移有關(guān)等原因備受人們的關(guān)注。新近一項關(guān)于胃癌的研究結(jié)果表明,DAPK基因啟動子甲基化在胃癌癌前病變和早期胃癌的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用[6]。

2.3 DNA復(fù)制和修復(fù)機制 DNA作為多種抗癌藥物攻擊的靶分子,其損傷修復(fù)能力異常與腫瘤的耐藥性形成有密切關(guān)系。DNA修復(fù)機制主要有:堿基切除修復(fù)(BER)、核苷酸切除修復(fù)(NER)、錯配修復(fù)(MM R)、同源重組(HR)和非同源末端連接(NHEJ)。新近有關(guān)錯配修復(fù)蛋白的研究日益受到重視,錯配修復(fù)蛋白是一組高度保守的生物大分子,在維持基因組穩(wěn)定中起重要作用。目前認為主要通過以下途徑導(dǎo)致腫瘤發(fā)生:(1)MM R基因自身發(fā)生突變,失去錯配修復(fù)功能,在DNA復(fù)制過程中產(chǎn)生大量的復(fù)制錯誤及微衛(wèi)星不穩(wěn)定。在結(jié)直腸癌、卵巢癌、黑色素瘤等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)錯配修復(fù)蛋白基因突變與微衛(wèi)星不穩(wěn)定的關(guān)系[7]。(2)錯配修復(fù)蛋白功能缺陷導(dǎo)致細胞突變,引起癌基因、抑癌基因突變,如基因易位、擴增、染色體丟失等,突變癌細胞群體持續(xù)優(yōu)勢生長,促進腫瘤形成。(3)錯配修復(fù)蛋白功能缺陷可通過一些致癌物如烷化劑引起DNA損傷,導(dǎo)致腫瘤形成。(4)錯配修復(fù)蛋白參與細胞周期的調(diào)控,其缺陷可導(dǎo)致細胞周期改變,從而引起腫瘤的發(fā)生[8]。

2.4 自我更新能力 人們認為腫瘤不斷生長的另一個重要原因是干細胞的自我更新。Bim-1、Notch、Shh、Wnt等信號通路對CSCs的自我更新發(fā)揮著重要作用。Hedgehog信號通路是調(diào)控胚胎組織分化發(fā)育過程中重要的決定因素,主要有信號分子Shh、膜受體patched(PTCH)、smoothened(Smo)、一些中間傳遞分子和核轉(zhuǎn)錄因子Glis組成[9]。一般認為Hedgehog信號的活化只有通過激活膜蛋白Smo才能實現(xiàn)信號的傳遞,但在成熟組織的更新和維持中Hh信號傳導(dǎo)通路的功能機制尚未確定。Zhao等[10]研究發(fā)現(xiàn)Smo受體的缺失是通過BCRABL1蛋白的作用來損害造血干細胞的更新和減少對慢性骨髓源性白血病(CM L)的誘導(dǎo),此外Hh信號傳導(dǎo)通路的抑制劑還減弱了小鼠和人類CML對伊馬替尼的耐藥性。

2.5 端粒酶活性增高 端粒酶是一種能夠催化延長端粒末端的核糖核酸蛋白復(fù)合物,具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性,由一個端粒酶催化亞基(TERT)和模板RNA(TR)組成,能夠以自身攜帶的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA并添加于染色體末端維持端粒長度的穩(wěn)定,保持染色體的動態(tài)平衡。端粒酶的重新活化可能是正常體細胞向腫瘤轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟。研究表明除一些更新組織的增殖細胞如生殖細胞、造血干細胞、表皮基底細胞等之外正常體細胞無端粒酶活性或不表達TERT。90%以上的惡性腫瘤細胞尤其是CSCs高表達TERT并且有很高的端粒酶活性。研究表明,蘇拉明(suramin)抑制端粒酶的活性呈劑量依賴性,在250 microM和175 microM時蘇拉明明顯抑制端粒酶的活性和腦膠質(zhì)瘤C6球體的增長及細胞增殖[11]。在癌變和耐藥性中端粒酶作為潛在治療策略引起越來越多的關(guān)注。

除上述機制外,CSCs還存在其他耐藥機制,如干細胞通常處于G0期,故對那些靶向細胞增殖周期的藥物耐藥,此外還有DAN拓撲異構(gòu)酶發(fā)生活性改變使抗癌藥物的靶點減少或過表達達到多藥耐藥等。

3 克服CSCs耐藥性策略

CSCs概念的提出提供了選擇性殺傷CSC的靶分子療法,可以克服耐藥性從而防止腫瘤治療后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。根據(jù)CSCs的生物學(xué)特性,目前已有一些治療腫瘤的方法和思路。

3.1 ABC轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑 ABC轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑的應(yīng)用是源于對ABC轉(zhuǎn)運蛋白功能的認識,第1、2代ABC轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑臨床效果不佳其主要原因在于其與化療藥物藥代動力學(xué)相互影響,然而即便是如此,ABC轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑的研究還是取得了一定進展。tariquidar(XR9576)是鄰氨苯甲酸的新型衍生物,也是目前被認為最有希望治療腫瘤的非競爭P-gp抑制劑,它能抑制 P-gp的ATP酶活性,臨床實驗聯(lián)合阿霉素、長春新堿及紫杉醇等藥物有良好逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性的效果[12]。Hu等[13]研究發(fā)現(xiàn)Akt信號通路能夠調(diào)節(jié)SP細胞的藥物外排活動,其機制是改變ABCG2蛋白亞細胞的定位,同時還證明了抑制Akt信號通路可以減少阿霉素從MHCC-97L細胞中的泵出從而增加藥物的療效。

3.2 靶向治療 CSCs胞膜內(nèi)存有特異性細胞因子,將藥物以納米材料及共價鍵結(jié)合方式特異性地定點于靶細胞,從而特異性針對靶定CSCs進行治療。惡性腫瘤生長、轉(zhuǎn)移均依賴新生血管生成,抗血管生成治療也因其具有高效性、不易產(chǎn)生耐藥性及無明顯毒副反應(yīng)等優(yōu)點成為當(dāng)今腫瘤治療領(lǐng)域的熱點。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是針對內(nèi)皮細胞特異性最高、促血管生長作用最強的一種因子,可能在多種血管生長因子中起著中心調(diào)控作用,因此多數(shù)研究將VEGF或其受體作為治療的靶點。近年來利用RNA干擾技術(shù)進行的抗腫瘤血管治療受到廣泛重視,RNA干擾為dsRNA在mRNA水平上阻止相關(guān)基因表達的過程,是一項新興的基因阻斷技術(shù)。Mulkeen等[14]在結(jié)腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)VEGF的siRNA可以沉默VEGF的表達且通過影響這一表達減少結(jié)腸癌細胞的增殖。

3.3 免疫誘導(dǎo) 免疫誘導(dǎo)的原理主要是用CSCs表面特異性表達的表面抗原,誘導(dǎo)自身機體對腫瘤細胞產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫,殺傷帶有干細胞抗原的腫瘤細胞。前列腺干細胞抗原(prostate stem cell antigen,PSCA)是前列腺細胞特有的,PSCA在腫瘤生物學(xué)和臨床預(yù)后上是一種有效的預(yù)測指標,在LAPC-9癌裸鼠模型中證實了單克隆抗體(mAb)1G8與PSCA特異性結(jié)合有顯著抗腫瘤作用,這種抗體有希望成為臨床試驗中的靶向治療策略[15]。

3.4 誘導(dǎo)分化 干細胞的自我更新、增殖、分化主要依賴于其生存的特殊微環(huán)境(niche)。CSCs可能存活在異常的niche中,打破這種異常的niche就能減弱CSCs的自我更新,從而抑制腫瘤的生長。通過靶向CSC微環(huán)境抑制血管生成,或改變微環(huán)境來誘導(dǎo)CSC分化[16]。現(xiàn)已證實全反式維甲酸可誘導(dǎo)分化治療急性髓性白血病(AML),并對其他腫瘤也有一定療效。Hallaert等[17]報道c-Abl激酶抑制劑(伊馬替尼或達沙替尼)可顯著減少由CD40介導(dǎo)的耐藥性慢性骨髓源性白血病細胞的增殖,其可能作用機制是通過c-Abl激酶抑制劑影響干細胞特性的微環(huán)境而誘導(dǎo)LSC分化。也可通過細胞因子等促使CSCs分化,然后加用增殖期化療藥物殺死腫瘤細胞。

3.5 抑制端粒酶活性 目前研究比較廣泛的端粒酶抑制劑主要有反義寡核苷酸(ASODN)、小分子干擾 RNA(siRNA)、錘頭狀核酶、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑等,其中RNA干擾技術(shù)由于長期高效的基因沉默效果,特異性強、快速持久而備受青睞。RNA干擾是由短的雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默,與該雙鏈 RNA有同源序列的mRNA被降解,從而阻止特定基因的表達。siRNA是比較廣泛的端粒酶抑制劑[18]。采用HT ERT的siRNA轉(zhuǎn)染入乳腺癌細胞株中,發(fā)現(xiàn)能有效地下調(diào)HT ERTmRNA的表達,降低了端粒酶的活性,同時使癌細胞群落減小。研究還發(fā)現(xiàn)低劑量阿霉素和siRNA聯(lián)合應(yīng)用能更有效地抑制端粒酶的活性,而且還可加強和持久性誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡[19]。

3.6 干細胞移植的應(yīng)用 造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplant,HSCT)泛指將各種來源的正常造血干細胞在患者接受超劑量化(放)療后,通過靜脈輸注移植入受體內(nèi),以替代原有的病理性造血干細胞,從而使患者正常的造血及免疫功能得以重建。異基因干細胞移植(allo-HSCT)是治療造血系統(tǒng)惡性疾病、代謝疾病和自身免疫疾病的一種方法。丁邦和等[20]采用FBCA方案(氟達拉賓加馬利蘭加環(huán)磷酰胺加Ara-c)對12例惡性血液病患者預(yù)處理行異基因干細胞移植,移植后第30天開始給予淋巴細胞(DLL)輸注,結(jié)果證明非清髓性異基因干細胞移植(non-myeloablative allogeneic stem cell transplantation,NAST)聯(lián)合DLL治療惡性血液病安全可靠,造血功能恢復(fù)迅速且持久穩(wěn)定,長期無病生存率高,急性移植物抗宿主病(GVHD)發(fā)病率低。

4 展 望

CSCs概念的提出,是人們認識腫瘤和治療腫瘤的新突破點。進一步研究CSCs耐藥相關(guān)的細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)改變以及異常信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的組成,是CSCs靶向治療的基礎(chǔ)。目前對于CSCs的治療還有些急需解決的問題,如應(yīng)該如何特異性標識CSCs表面標記物以更好地分離和鑒定CSCs;怎樣才能保證藥物能特異性殺死CSCs而不影響其他正常干細胞以及控制HSCT的不良反應(yīng)和降低其使用風(fēng)險等,對這些問題的探索還需要進行長期的科學(xué)研究和論證。

[1] Mutoh K,Tsukahara S,Mitsuhashi J,et al.Estrogen-mediated post transcriptional down-regulation of P-glycoprotein in MDR1-transduced human breast cancer cells[J].Cancer Sci,2006,97(11):1198.

[2] Dean M.ABC transporters,drug resistance,and cancer stem cells[J].J M ammary Gland Biol Neoplasia,2009,14(1):3.

[3] Kondo T,Setoguchi T,Taga T,et al.Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(3):781.

[4] Zhou J,Wang CY,Liu T,et al.Persistence of side population cells with high drug efflux capacity in pancreatic cancer[J].World J Gastroenterol,2008,14(6):925.

[5] Jin Y,Bin ZQ,Qiang H,et al.ABCG2 is related with the grade of glioma and resistance to mitoxantone,a chemotherapeutic drug for glioma[J].J Cancer Res Clin Oncol,2009,135(10):1369.

[6] Zou XP,Zhang B,Zhang XQ,et al.Promoter hypermethylation of multiple genes in early gastric adenocarcinoma and precancerous lesions[J].Hom Pathol,2009,40(11):1534.

[7] Yoon BS,Kim YT,Kim JH,et al.Clinical significance of microsatellite instabilityin sporadic epithelial ovarian tumors[J].Yonsei Med J,2008,49(2):272.

[8] Schroering AG,Edelbrock MA,Richards TJ,et al.The cell cycle and DNA mismatch repair[J].Exp Cell Res,2007,313(2):292.

[9] Huangfu D,Anderson KV.Signaling from Smo to Ci/Gli:conservation and divergence of Hedgehog pathways from Drosophila to vertebrates[J].Development,2006,133(1):3.

[10]Zhao C,Chen A,Jamieson CH,et al.Hedgehog signalling is essential for maintenance of cancer stem cells in myeloid leukaemia[J].Nature,2009,458(7239):776.

[11]Erguven M,Akev N,Ozdemir A,et al.The inhibitory effect of suramin on telomerase activity and spheroid growth of C6 glioma cells[J].Med Sci Moint,2008,14(8):165.

[12]Fox E,Bates SE.Tariquidar(XR9576):a P-glycoprotein drug efflux pump inhibitor[J].Expert Rev Anticancer T-her,2007,7(4):447.

[13]HU C,Li H,Li J,et al.Analysis of ABCG2 expression and side population identifies intrinsic drug efflux in the HCC cell line M HCC-97L and its modulation by Akt signaling[J].Carcinogenesis,2008,29(12):2287.

[14] Mulkeen AL,Silva T,Yoo PS,et al.Short interfering RNA-mediated gene silencing of vascular endothelial growth factor:effects on cellular proli-feration in colon cancer cells[J].Arch Surg,2006,141(4):367.

[15]Li Y,Cozzi PJ,Russell PJ,et al.Promising tumor-associated antigens for future prostate cancer therapy[J].Med Res Rev,2009,18(Epub ahead of print).

[16]Yang ZJ,Wechsler-Reya RJ.Hit′em where they live:targeting the cancer stem cell niche[J].Cancer Cell,2007,11(1):3.

[17]Hallaert DY,Jaspers A,van Noesel CJ,et al.c-Abl kinase inhibitors overcome CD40-mediated drug resistance in CLL:implications for therapeutic targeting of chemoresistant niches[J].Blood,2008,112(13):5141.

[18]Shammas M A,Koley H,Baiehu RB,et al.Telomerase inhibition by siRNA causes senescence and apoptosis in Barrett,s adenocarcinoma cells:mechanism and therapeutic potential[J].Mol Cancer,2005,15(4):24.

[19]Dong X,Liu A,Zer C,et al.siRNA inhibition of telomerase enhances the anti-cancereffect of doxorubicin in breast cancer cells[J].BMC Cancer,2009,5(9):133.

[20]丁邦和,李玉峰,錢芳.非清髓性異基因造血干細胞移植聯(lián)合供著淋巴細胞輸注治療惡性血液病[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2008,13(6):545.