周鐵軍,向 麗,龔 莉△,劉 俊

(瀘州醫(yī)學院:1.病理學教研室;2.病原生物學教研室,四川瀘州 646000)

血管內(nèi)皮生長因子-C及其受體在宮頸鱗癌中的表達及意義

周鐵軍1,向 麗2,龔 莉1△,劉 俊1

(瀘州醫(yī)學院:1.病理學教研室;2.病原生物學教研室,四川瀘州 646000)

目的研究血管內(nèi)皮生長因子-C(VEGF-C)及其血管內(nèi)皮生長因子受體-3(VEGFR-3)在宮頸鱗癌組織中的表達及在淋巴道轉(zhuǎn)移中的作用。方法采用免疫組化法檢測62例宮頸鱗癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中VEGF-C及VEGFR-3的表達,AE1/AE3檢測盆腔淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移。結(jié)果免疫組化AE1/AE3檢測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移檢出率顯著高于HE染色檢出率;宮頸鱗癌中VEGF-C的陽性表達率與宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ、CINⅡ的陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),與CINⅢ無明顯差異;VEGFR-3陽性淋巴管數(shù)顯著高于宮頸上皮內(nèi)瘤變;VEGF-C表達與VEGFR-3陽性淋巴管數(shù)呈明顯正相關(guān);VEGF-C及VEGFR-3均與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移有關(guān)。結(jié)論AE1/AE3檢查有利于發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移;VEGF-C可能通過促進淋巴管的生成,從而利于宮頸鱗癌的浸潤轉(zhuǎn)移。

宮頸鱗癌;血管內(nèi)皮生長因子-C;血管內(nèi)皮生長因子受體-3;淋巴道轉(zhuǎn)移

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,主要通過淋巴道轉(zhuǎn)移。淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移是影響宮頸癌患者預后的重要指標。因此,探討宮頸癌淋巴道轉(zhuǎn)移的機制,對判斷預后及提高治療效果具有重要的意義。血管內(nèi)皮生長因子-C(vascular endothelial growth factor-C,VEGF-C)是重要的淋巴管生長因子,可通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子受體-3(vascular endothelial growth factor receptor-3,VEGFR-3)的表達,促進淋巴管生成。但宮頸鱗癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)組織中是否有新生淋巴管形成及其功能尚存在分歧。本研究擬通過檢測宮頸鱗癌及CIN組織標本中VEGF-C及VEGFR-3的表達情況及與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系,探討其與宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科2008年1～12月行宮頸鱗癌活檢及手術(shù)切除的62例(38例為根治標本)患者存檔石蠟標本,選取55例宮頸上皮內(nèi)瘤變組織的石蠟標本(其中CINⅠ15例、CINⅡ15例、CINⅢ25例)。資料保存完整,所有病例均為首次發(fā)病,術(shù)前均未接受放療、化療?；颊吣挲g27～76歲。38例根治標本中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例。所有標本均經(jīng) 10%甲醛固定,石蠟包埋,4 μ m連續(xù)切片。選取常規(guī)HE染色檢測陰性的盆腔淋巴結(jié),檢測腫瘤微轉(zhuǎn)移情況。

1.2 試劑及方法 采用免疫組化SP法,即用型兔抗人多克隆抗VEGF-C抗體、兔抗人VEGFR-3多克隆抗體、鼠抗人單克隆廣譜細胞角蛋白AE1/AE3抗體、SP試劑盒、DAB顯色劑均購自北京中杉公司。嚴格按試劑盒說明書方法染色,所有切片染色均在相同條件下進行。用PBS液代替一抗做陰性對照,用已知陽性結(jié)腸癌組織切片做VEGF-C陽性對照,乳腺癌組織做VEGFR-3陽性對照,宮頸鱗癌組織做AE1/AE3陽性對照。

1.3 結(jié)果判斷 所有免疫組化染色結(jié)果均由兩位病理醫(yī)師在不知病例資料的情況下盲法閱片判斷。VEGF-C的陽性表達位于胞漿或胞膜染呈淡黃色至棕褐色。按染色著色深淺打分:無顯色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。按陽性細胞率打分:陰性為0分,陽性細胞率小于或等于10%為1分,11%～50%為2分,≥51%為3分。染色強度與陽性細胞率的乘積:0～2分為(-),3～4分為(+),5～7分為(++),8～9分為(+++)。VEGFR-3陽性淋巴管判斷標準及記數(shù)方法:低倍鏡下尋找VEGFR-3陽性淋巴管密集區(qū),即“熱區(qū)”,100倍視野計數(shù)10個熱區(qū)中VEGFR-3陽性淋巴管數(shù),取平均值。腫瘤區(qū)內(nèi)單個或成叢的內(nèi)皮細胞,不管成腔與否均視為淋巴管并計數(shù),凡伴有肌層的淋巴管不予計數(shù)。AE1/AE3主要定位于細胞漿和細胞膜,出現(xiàn)清楚的棕褐色顆粒者為陽性細胞。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析。根據(jù)不同的數(shù)據(jù)類型選擇不同的統(tǒng)計方法:計量資料結(jié)果以x±s表示,計量資料兩組間比較采用兩樣本間t檢驗;計數(shù)資料組間采用χ2檢驗;兩個變量相關(guān)性采用Spearman′s等級相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 VEGF-C及VEGFR-3在不同組織中的表達情況VEGF-C主要表達于癌細胞胞漿中,呈黃色或棕黃色(圖1),在少數(shù)病例中間質(zhì)細胞也有少量表達。從CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ到宮頸鱗癌組織,VEGF-C的表達強度和表達率逐漸升高,其表達率分別為 33.33%、40.00%、56.00%和 69.35%。VEGF-C在CINⅠ、CINⅡ的表達率分別與宮頸鱗癌比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.675,P=0.010;χ2=4.498,P=0.034);而CINⅢ與宮頸鱗癌比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。VEGFR-3陽性染色為胞漿或胞膜呈明顯的棕黃或棕褐色,主要位于上皮下的淋巴管內(nèi)皮細胞,管腔多為單層,壁薄,腔內(nèi)偶見血細胞,腫瘤細胞偶見弱陽性反應,在癌周組織中,陽性反應較強,染色管腔增加,呈局灶性或散在分布(圖2)。從CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ到宮頸鱗癌組織,VEGFR-3陽性表達的淋巴管數(shù)逐漸升高,分別為2.93±1.39、3.47±1.68、4.04±1.95和5.26±2.39。VEGFR-3在 CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ的表達分別與宮頸鱗癌比較差異有統(tǒng)計學意義(t=3.614,P=0.001;t=2.739,P=0.008;t=2.263,P=0.026)。其他各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見表1。

表1 不同組織中VEGF-C、VEGFR-3的表達情況

2.2 AE1/AE3的表達及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況 AE1/AE3陽性部位主要在細胞漿,微轉(zhuǎn)移灶表現(xiàn)為單個散在和2～3個及數(shù)個聚集成小團狀的癌細胞呈較強的胞漿著色(圖3)。38例患者共檢出淋巴結(jié)263枚,常規(guī)HE染色發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌29枚,占所檢淋巴結(jié)12.17%;陰性淋巴結(jié)經(jīng)免疫組化AE1/AE3復檢發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移癌16枚,占陰性淋巴結(jié)6.84%;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移檢出率提高到17.11%,二者之間的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.026,P=0.045)。

2.3 VEGF-C、VEGFR-3的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 在宮頸鱗癌組織中VEGF-C的表達與盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF-C的表達陽性率為82.35%,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為47.62%,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.871,P=0.027);VEGFR-3在宮頸鱗癌組織中的陽性淋巴管數(shù)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組淋巴管數(shù)量明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,分別為 5.81±2.69和4.17±1.74,差異有統(tǒng)計學意義(t=-2.518,P=0.038),見表2。

表2 VEGF-C、VEGFR-3的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

圖1 VEGF-C在宮頸鱗癌中的表達(SP×200)

圖2 VEGFR-3在宮頸鱗癌中的表達(SP×200)

圖3 AE1/AE3淋巴結(jié)中的表達(SP×200)

表3 VEGF-C的表達與淋巴管生成的相關(guān)性

2.4 VEGF-C的表達與淋巴管生成的相關(guān)性 在宮頸鱗癌組織中,隨著VEGF-C表達水平增高,VEGFR-3陽性淋巴管數(shù)也明顯增加,而VEGF-C表達陰性者,VEGFR-3陽性淋巴管數(shù)明顯減少,Spearman′s相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),二者之間呈明顯正相關(guān)(r=0.432,P=0.000),見表 3。

3 討 論

淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移是指直徑小于2 mm的癌轉(zhuǎn)移灶,在常規(guī)HE切片中不易發(fā)現(xiàn)[1]。近年研究表明,即使常規(guī)病理檢查無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者,仍有約10%的患者術(shù)后較快出現(xiàn)復發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,這可能與癌細胞微轉(zhuǎn)移有關(guān)[2]。廣譜細胞角蛋白AE1/AE3廣泛表達于上皮組織中。本研究中,AE1/AE3染色總共檢測到微轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)16枚,占陰性淋巴結(jié)的6.84%,轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的檢出率由HE染色的12.17%提高到AE1/AE3染色的17.11%,二者間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.026,P=0.045),說明運用免疫組化技術(shù)檢測淋巴結(jié)中AE1/AE3的表達有利于提高宮頸鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移檢出率。

腫瘤治療失敗的一個重要原因是腫瘤細胞易從原發(fā)部位通過血管、淋巴管向其他器官擴散,從而導致患者死亡,因此腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學特性。多數(shù)上皮源性的惡性腫瘤主要以淋巴道轉(zhuǎn)移為主,而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是一個極其復雜、連續(xù)的過程,其中淋巴管和微血管在腫瘤生長轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。VEGF-C是近年來第一個被發(fā)現(xiàn)的具有淋巴管生成作用的VEGF家族新成員,又稱淋巴管生長因子,在人類基因中定位于染色體4q34。它通過產(chǎn)生特異性的新生淋巴管刺激因子,具有刺激血管和淋巴管生成的雙重作用;通過與其特異性受體結(jié)合,引起一系列的信號轉(zhuǎn)導,在多種腫瘤的生長、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起著重要的調(diào)節(jié)作用[3-4]。

VEGFR-3屬于酪氨酸激酶超家族成員,是一種高度糖基化的單鏈跨膜鑲嵌蛋白,是胚胎血管形成的必要因素,在血管、淋巴管內(nèi)皮細胞都有分布,在胚胎后期,VEGFR-3分布逐漸限于淋巴管,血管中幾乎不表達,其主要參與淋巴管的形成。成人VEGFR-3主要分布于淋巴管內(nèi)皮細胞,因此認為其是淋巴管內(nèi)皮特異性標志物。VEGFR-3與配體結(jié)合可引起內(nèi)皮細胞增殖和遷移、調(diào)控血管和淋巴管內(nèi)皮細胞的新生,對胚胎發(fā)育及腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移起重要作用。VEGFR-3在淋巴管內(nèi)皮上的表達程度可反映腫瘤間質(zhì)中淋巴管增生的程度[5]。

目前有關(guān)VEGF-C調(diào)節(jié)血管和淋巴管的機制尚不清楚。認為VEGF-C是以配體的形式與兩個酪氨酸激酶受體VEGFR-2和VEGFR-3結(jié)合發(fā)揮作用,前者主要分布于血管內(nèi)皮細胞上,后者在血管及淋巴管內(nèi)皮細胞都有分布。有研究發(fā)現(xiàn)VEGF-C能提高血管的通透性,結(jié)合并激活VEGFR-3,通過蛋白激酶C依賴的P42/44促分裂原活性蛋白激酶(mitogen actived protein kinase,MAPK)和磷酸肌醇-3激酶(PI3K)/絲-蘇氨酸激酶(Akt)信號傳導通路促進淋巴管內(nèi)皮的存活與增殖[6],甚至VEGF-C信號僅單獨由VEGFR-3傳遞就足以造成淋巴管的增生。

本研究表明,從CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ到宮頸鱗癌,VEGFC表達逐漸增強,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),這與Van Trappen等[7]的研究基本一致。而且在宮頸鱗癌的發(fā)生中,淋巴管發(fā)生表型改變可在宮頸上皮內(nèi)瘤變中出現(xiàn)。超過50%的CINⅢ級的病例中在其基底膜下有VEGF-C及其受體的高表達。相反,在CINⅠ和CINⅡ中沒有或很少有VEGF-C的表達。結(jié)果提示VEGF-C可以通過激活其受體VEGFR-3誘導腫瘤附近淋巴管生成從而促進局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,而VEGF-C表達的關(guān)鍵取決于CINⅢ是否向侵襲性疾病進一步發(fā)展,一旦發(fā)生浸潤性癌將誘導腫瘤早期向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

從CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ到宮頸鱗癌,隨著 VEGF-C表達的增強,VEGFR-3陽性表達的淋巴管數(shù)也逐漸增強,二者呈明顯正相關(guān)關(guān)系(r=0.432,P=0.000)。這與楊增周等[8]在食管鱗癌中的研究基本一致。超過50%的CINⅢ病變中出現(xiàn)淋巴管,然而在CINⅠ、CINⅡ病變中這種現(xiàn)象并未出現(xiàn)。在宮頸鱗癌中,腫瘤附近出現(xiàn)的淋巴管更加明顯,且在這些腫瘤中出現(xiàn)中至高VEGF-C的表達,這就可以解釋為什么早期子宮頸鱗癌有淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移。同時本研究發(fā)現(xiàn),VEGF-C在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率明顯高于無轉(zhuǎn)移組;VEGFR-3陽性淋巴管數(shù)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組較無轉(zhuǎn)移組明顯增多,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)越多VEGF-C的表達越強,腫瘤附近的淋巴管也越多,這與王金衛(wèi)和張筱驊[9]在甲狀腺乳頭狀癌中的研究一致。提示VEGF-C可能通過其刺激受體VEGFR-3的表達,促進腫瘤淋巴管的生成來利于腫瘤的轉(zhuǎn)移。

在本研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤附近的血管少部分也表達VEGFR-3,說明VEGFR-3在標記淋巴管時不具有特異性,這可能是本研究和其他研究不一致的原因。同時本研究發(fā)現(xiàn)在部分腫瘤細胞中也表達了VEGFR-3,其具體機制有待進一步的研究。

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[9] 王金衛(wèi),張筱驊.甲狀腺乳頭狀癌淋巴管生成與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管內(nèi)皮生長因子-C表達的關(guān)系[J].浙江醫(yī)學,2008,30(6):548.

Expressions of vascular endothelial growth factor-Cand its receptor in cervical squamous cell carcinoma and their role in lymph metastasis

ZHOU Tie-jun1,XIANGLi2,GONG Li1△,et al.
(1.Department of Pathology,2.Department of Medical Microbiology andParasitology,Luzhou Medical College,Luzhou646000,China)

ObjectiveTo study the expressions of VEGF-C and its receptor VEGFR-3 in cervical squamous cell carcinoma tissues,as well as their roles in lymph metastasis.MethodsSixty-two cases of cervical squamous cell carcinoma and cervical intraepithelial neoplasia were detected by immunohistochemical staining(S-P)for the expressions of VEGF-C,VEGFR-3 and tested the expression of AE1/AE3 in lymph node to explore lymph metastasis.ResultsThe positive rates of AE1/AE3 by immunohistochemical staining in lymph nodes of cervical carcinoma were all more than those of routine H-E staining.The difference of positive expressive rate of VEGF-C between the cervical squamous cell carcinoma and CINⅠ,CINⅡwas statistically significant,but not to CINⅢ.The difference between the cervical squamous cell carcinoma and cervical intraepithelial neoplasia in VEGFR-3 expression was statistically significant.The expression level of VEGF-C in cervical squamous cell carcinoma was positively correlated with the positive number of lymphatic vessels stained by VEGFR-3.VEGF-C and VEGFR-3 were all related to lymph node metastasis.Conclusion

The detection of AE1/AE3 may be much easier to find out the LN with micrometastasis;VEGF-C facilitates invasion and metastasis in cervical squamous cell carcinoma by promoting lymphangiogenesis.

cervical squamous cell carcinoma;VEGF-C;VEGFR-3;Lymph metastasis

R737.33;R730.43

A

1671-8348(2010)05-0533-03

△通訊作者,E-mail:scgongli@sina.com。

2009-07-30

2009-09-10)

?論 著?