沈 陽,丁佑銘,呂仁更,朱以祥

(1.湖北省新華醫(yī)院普外科,武漢 430015;2.湖北省人民醫(yī)院肝膽外科 430000)

膽囊結(jié)石形成時Calponin、VIP在膽囊平滑肌和Oddi括約肌中的表達及意義

沈 陽1,丁佑銘2,呂仁更1,朱以祥1

(1.湖北省新華醫(yī)院普外科,武漢 430015;2.湖北省人民醫(yī)院肝膽外科 430000)

目的探索血管活性腸肽(VIP)和調(diào)寧蛋白(Calponin)在膽囊平滑肌和Oddi括約肌中的表達,并評估二者在膽囊膽固醇結(jié)石形成機制中的作用。方法(1)動物模型:新西蘭兔40只,隨機分成對照組20只,喂普通飲食;結(jié)石組20只,飼喂含1.2 g/d膽固醇的成石飲食4周。免疫組化法測定Calponin、VIP在膽囊平滑肌和Oddi括約肌中的表達。結(jié)果結(jié)石組16只出現(xiàn)膽囊結(jié)石,19只出現(xiàn)膽固醇結(jié)晶,對照組無結(jié)石及結(jié)晶出現(xiàn);結(jié)石組膽囊平滑肌Calponin和VIP陽性產(chǎn)物與對照組相比較明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),Oddi括約肌Calponin和VIP陽性產(chǎn)物與對照組相比較明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Calponin陽性表達與VIP呈正相關(guān)。結(jié)論膽囊排空功能在膽囊結(jié)石形成中起重要作用,膽囊結(jié)石家兔膽囊排空障礙與Calponin、VIP明顯相關(guān)。

膽囊結(jié)石;調(diào)寧蛋白;血管活性腸肽;膽囊平滑肌;Oddi括約肌

目前認為膽囊膽固醇結(jié)石形成機制是膽汁膽固醇過飽和、膽汁中成核因子的活性異常和膽道動力學改變?nèi)咦饔玫慕Y(jié)果。膽道動力學改變是膽石形成不可缺少的條件。本研究采用免疫組化方法,測定調(diào)寧蛋白(Calponin)以及血管活性腸肽(VIP)在膽囊平滑肌和Oddi括約肌中的表達,分析二者在膽道動力中所起的作用和相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年健康雄性新西蘭兔40只(武漢大學醫(yī)學院實驗動物中心提供),體質(zhì)量1.80～2.50 kg,隨機分為兩組,即對照組,實驗組。每組20只,對照組喂普通顆粒飼料(武漢大學醫(yī)學院實驗動物中心提供),實驗組飼喂1.2%高膽固醇飼料(武漢大學醫(yī)學院實驗動物中心提供)。置于隔離動物房喂養(yǎng),自由進水。兩組飼喂普通顆粒飼料1周,每只分別100 g/d,然后對照組續(xù)進普通顆粒飼料(每只 100 g/d),而實驗組則飼喂1.2%高膽固醇飼料(每只100 g/d,其中膽固醇為每只1.2 g/d)。飼養(yǎng)時間為4周。

1.2 標本收集 飼養(yǎng)時間充足后,剖殺前12 h禁食,4 h禁水。耳緣靜脈20%烏拉坦麻醉。常規(guī)消毒,剖腹取膽囊平滑肌以及Oddi括約肌。4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片4 μ m。收集膽汁并觀察成石情況。

1.3 觀測指標及檢測方法

1.3.1 膽囊膽汁膽固醇結(jié)晶及結(jié)石鑒定 結(jié)石判斷標準:肉眼觀察膽汁內(nèi)有成形粗大顆粒,光鏡下觀察為致密大團塊結(jié)晶膽固醇即定為結(jié)石[1],正常兔膽囊膽汁均未見有形成分。膽固醇結(jié)晶定量:取部分膽囊膽汁離心,沉淀物涂片,光鏡下觀察有無膽固醇結(jié)晶。膽固醇結(jié)晶定量參照文獻[2]標準分為+,++,+++及++++4個等級。

1.3.2 VIP、Calponin在膽囊平滑肌以及 Oddi括約肌的表達

S-P法染色測定Calponin和VIP在膽囊平滑肌和Oddi擴約肌的表達(以Calponin為例,免疫組化相關(guān)試劑購自Sigma公司),石蠟切片脫蠟、水化;磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4)洗2～3次,每次5 min;滴加3%H2O2(80%甲醇),室溫靜置10 min;PB緩沖液洗2～3次,每次5 min;抗原修復(檸檬酸高溫修復);PBS洗2～3次,每次5 min;滴加正常山羊血清封閉液,室溫20 min。甩去多余液體。滴加CalponinⅠ抗 50 μ L,室溫靜置1 h或者 4℃過夜或者37℃1 h。PBS洗3次,每次 5 min;滴加生物素Ⅱ抗40～50 μ L,室溫靜置1 h或37℃1 h;Ⅱ抗中可加入0.05%的 tween-20。PBS洗3次,每次5 min;DAB顯色5～10 min,在顯微鏡下掌握染色程度;PBS或自來水沖洗10 min;蘇木精復染2 min,鹽酸酒精分化;自來水沖洗10～15 min;脫水、透明、封片、鏡檢。

1.3.3 VIP、Calponin免疫組化染色結(jié)果的判斷(陽性表達位置均在胞漿,為棕黃色顆粒) 在高倍視野下(×400)隨機取5個視野(每個視野不少于50個細胞),按陽性細胞所占的百分比進行半定量分析(CIAS-1000細胞圖像分析儀半定量分析)。-:無陽性細胞;+:低度表達(陽性細胞小于10%);++:中度表達(陽性細胞10%～50%);+++:高度表達(陽性細胞大于50%)。無陽性細胞與低度表達視為陰性,中度表達與高度表達視為陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法 所有結(jié)果經(jīng)SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理。采用χ2檢驗及直線相關(guān)分析,以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 實驗動物一般情況及體質(zhì)量變化 對照組動物生長良好,平均每周體質(zhì)量增加0.05～0.10 kg,試驗組飼高膽固醇膳食生長較快,體質(zhì)量增長明顯,每周平均增長0.15～0.20 kg,各組動物喂養(yǎng)期間均無死亡。

2.2 膽汁膽固醇結(jié)晶與成石情況 對照組膽囊膽汁幾乎無膽固醇結(jié)晶,實驗組16只可見明顯結(jié)石顆粒,19只可見膽固醇結(jié)晶。

2.3 膽囊平滑肌中Calponin和VIP的陽性產(chǎn)物的變化 結(jié)石組Calponin和VIP的陽性產(chǎn)物在顯微鏡下與對照組比較顯著增多,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),見表1。

表1 兩組膽囊平滑肌中Calponin和VIP的表達結(jié)果

2.4 Oddi括約肌中Calponin和VIP的陽性產(chǎn)物的變化 結(jié)石組Calponin和VIP的陽性產(chǎn)物在顯微鏡下與對照組比較顯著減少,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),見表2。

表2 兩組Oddi括約肌中Calponin和VIP的表達結(jié)果

2.5 膽囊平滑肌及Oddi括約肌中Calponin和VIP的相關(guān)性

膽囊平滑肌中Calponin表達的陽性率與VIP表達的陽性率呈正相關(guān)Y(Calponin)=22.813+0.646X(VIP),r=0.785,P＜0.05。Oddi括約肌中Calponin表達的陽性率與VIP表達的陽性率呈正相關(guān)Y(Calponin)=9.652+0.473X(VIP),r=0.624,P＜0.05。

3 討 論

膽囊膽固醇結(jié)石的形成不是單一病理因素所致,而是膽道系統(tǒng)在多種因素的影響下發(fā)生的一系列病理變化的結(jié)果。膽囊膽固醇的成因目前尚存在一定的爭議。近年來,對膽汁成分的改變,膽固醇磷脂泡、促成核因子和抗成核因子的失衡病理因素作了較多研究,而對膽囊運動在膽石形成中的作用研究相對較少。

膽囊是貯存和濃縮膽汁的器官,具有節(jié)律性和緊張性收縮運動的功能,膽囊收縮力下降是引起膽囊排空障礙的主要動力學因素,促進膽囊收縮力能有效增加膽囊排空[3]。膽囊是一個彈性的囊體,和膽道系統(tǒng)相連。在非消化期間,肝細胞不斷分泌膽汁流入膽囊內(nèi)貯存。膽囊可吸收膽汁中的水分和無機鹽,使肝膽汁濃縮4～10倍,增加了貯存的效能。空腹時,膽囊多呈松弛狀態(tài),進食后則呈張力性收縮。正常情況下,膽囊和Oddi括約肌的活動表現(xiàn)出協(xié)調(diào)的相互關(guān)系:Oddi括約肌收縮時膽囊舒張,從而使肝膽汁貯入膽囊;反之,膽囊收縮,Oddi括約肌舒張,肝膽汁和膽囊膽汁便流入十二指腸。所以膽囊平滑肌和Oddi括約肌的功能紊亂會導致膽汁排放受阻,從而促進膽囊膽固醇結(jié)石的形成。

平滑肌細胞有粗細肌絲組成,粗肌絲主要由肌球蛋白組成。而細肌絲主要由肌動蛋白組成,但不含有骨骼肌所有的肌鈣蛋白。平滑肌沒有骨骼肌那樣發(fā)達的肌管系統(tǒng),而是肌膜。平滑肌細胞受刺激時,細胞外Ca2+進入胞內(nèi),但細胞中靠近肌膜的肌漿網(wǎng)也構(gòu)成了細胞內(nèi)Ca2+貯存庫。一些興奮性遞質(zhì)、激素或者藥物同肌膜受體結(jié)合,通過G蛋白在胞漿內(nèi)產(chǎn)生第二信使,引起Ca2+庫中的Ca2+釋出。Ca2+先結(jié)合于胞漿中鈣調(diào)蛋白,后者結(jié)合了4個Ca2+后使肌球蛋白激酶活化,使A TP分解,從而使橫橋磷酸化,既而激活橫橋,導致平滑肌收縮。

VIP在膽囊的功能調(diào)節(jié)上起重要作用,Strah等[4]利用狗膽瘺模型進行體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),膽囊受著3種迷走神經(jīng)纖維共同支配,即膽堿能、膽囊收縮素(CCK)和VIP能。膽堿能和CCK能神經(jīng)可使膽囊張力增強,收縮性加強,而VIP能神經(jīng)則抑制膽囊收縮。生理情況下,膽囊的張力和排空是受興奮性的膽堿能、CCK能和具抑制性的VIP能神經(jīng)共同調(diào)節(jié)的。用免疫組化和放射免疫測定技術(shù)對膽囊組織VIP產(chǎn)生及分泌進行定位和定量研究,發(fā)現(xiàn)膽囊上皮細胞膜上有結(jié)合VIP的特異性受體,而膽囊組織內(nèi)沒有產(chǎn)生VIP的內(nèi)分泌細胞;膽囊產(chǎn)生的VIP主要是由膽囊壁內(nèi)的VIP能神經(jīng)纖維所釋放。膽囊排空受復雜的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控,新近證實主要促排空激素是CCK,主要抑制排空激素是VIP[5]。VIP能降低膽囊的張力和抑制膽囊收縮,在離體情況下呈劑量相關(guān)性抑制CCK的收縮膽囊作用對VIP引起平滑肌松弛的機制,目前認為與迷走神經(jīng)受到刺激后,膽囊壁的VIP能神經(jīng)纖維釋放VIP增加有關(guān),它與上皮細胞膜上高親和力受體結(jié)合,激活了腺苷酸環(huán)化酶,使細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)濃度增加,增加Ca2+從細胞內(nèi)排出和抑制Ca2+從鈣池釋放,同時抑制肌球蛋白的磷酸化,使平滑肌處于松弛狀態(tài)。

CaP是一種平滑肌特有的收縮調(diào)控蛋白[6-8],幾乎存在于所有哺乳動物和人的各種平滑肌組織中。調(diào)寧蛋白根據(jù)其等電點不同可分為3種異構(gòu)體,堿性調(diào)寧蛋白h1,中性調(diào)寧蛋白h2和酸性調(diào)寧蛋白,平滑肌組織中主要為h1型[8-10],其氨基酸及核苷酸序列已完整測出[8,10]。Strasser等[10]對調(diào)寧蛋白的功能進行了詳細研究,發(fā)現(xiàn)調(diào)寧蛋白能與其他蛋白結(jié)合,但與肌動蛋白的結(jié)合直接影響調(diào)寧蛋白的功能。調(diào)寧蛋白能抑制肌動球蛋白三磷酸腺苷(ATP)酶的活性,具有對肌動蛋白單體的聚合作用,肌動蛋白肌絲的集束作用,可與肌動蛋白(actin)、肌球蛋白(myosin)及原肌球蛋白(tropomyosin)結(jié)合,并能與鈣結(jié)合蛋白如鈣調(diào)素、鈣調(diào)蛋白及S100蛋白結(jié)合,調(diào)寧蛋白能被蛋白激酶C及鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶Ⅱ磷酸化,被磷酸酶脫磷酸化。當調(diào)寧蛋白磷酸化時,與肌動蛋白絲分離,失去對肌動球蛋白ATP酶的抑制作用,使肌肉收縮;調(diào)寧蛋白脫磷酸化時表現(xiàn)出抑制肌動球蛋白ATP酶活性,使肌肉舒張。調(diào)寧蛋白還能抑制肌動蛋白絲相對于肌球蛋白絲的滑行。

在此次實驗中,結(jié)石組16只(16/20)出現(xiàn)膽囊結(jié)石,19只(19/20)出現(xiàn)膽固醇結(jié)晶,對照組無結(jié)石及結(jié)晶出現(xiàn);結(jié)石組膽囊平滑肌Calponin和VIP陽性產(chǎn)物與對照組相比較明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),從而抑制膽囊平滑肌收縮。Oddi括約肌Calponin和VIP陽性物與對照組相比較明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。從而使兩者抑制Oddi括約肌收縮的功能減弱,導致Oddi括約肌痙攣。所以可以導致膽汁排放受阻,促進膽囊膽固醇結(jié)石的形成。本實驗結(jié)果認為,膽囊排空功能在膽囊結(jié)石形成中起重要作用,而膽囊結(jié)石家兔膽囊排空障礙與Calponin、VIP明顯相關(guān)。本實驗研究,從膽囊平滑肌及Oddi括約肌協(xié)調(diào)運動入路,旨在進一步明了膽囊結(jié)石形成病因,實驗證實Calponin陽性表達與調(diào)寧蛋白呈正相關(guān),表明二者協(xié)同參與平滑肌的收縮,但具體信號傳導機制尚需進一步研究。

[1] 別平,孟憲均,楊可禎,等.前列腺素環(huán)磷酸腺苷在膽囊結(jié)石形成中的作用[J].中華外科雜志,1987,25(6):339.

[2] Juniper K.Biliary tract studies 2:the significance of bi-liarycrystals[J].Gastroenterol,1957,32(6):175.

[3] 厲紅民,李前偉,劉廣元,等.膽囊動力學變化對膽囊結(jié)石形成影響的實驗觀察[J].重慶醫(yī)學,2003,32(9):1222.

[4] Strah KM,Melendez RL,Pappas TN,et al.Interaction of vasoactive intestinal polypeptide and cholocystokinin octapeptide on the control of gallbladder contraction[J].Surgery,1986,99(4):469.

[5] Chen Q,Amaral J,Oh S,et al.Gallbladder relaxation in patients with pigment and cholesterolstones[J].Gastroenterology,1997,113(3):930.

[6] Takahashi K,Hiwada K,Kokubu T.Isolation and characterization of a 34,000-dalton calmodulin-and F-actin-binding protein from chicken gizzard smooth muscle Biochem[J].Biochem Biophys Res Commun,1986,141(1):20.

[7] Takahashi K,Nadal-Ginard B.Molecular Cloning and sequence analysis of smooth muscle calponin[J].J Boil Chem,1991,266(20):13284.

[8] Jin JP,Wu D,Gao J,et al.Expression and purification of the h1 and h2 isoforms of calponin[J].Protein Exp Purif,2003,31(2):231.

[9] Matthew JD,Khromov AS,McDuffie MJ,et al.Contractile properties and proteins of smooth muscles of a calponin knockout mouse[J].J Physiol,2000,529(Pt3):811.

[10]Strasser P,Gimona M,Moessler H,et al.M ammalian calponin.Identification and expression of genenic variants[J].FEBS Lett,1993,330(1):13.

Changes of vasoactive intestinal polypeptide and Calponin expression in gallbladder smooth muscle and Oddi sphincter in rabbits with cholesterol gallstone

SHEN Yang1,DINGYou-ming2,LV Ren-geng1,et al.
(1.Department of General Surgery,Hubei Xinhua Hospital,Wuhan430015,China;2.Departmentof Hepatobiliary Surgery,Hubei Provincial People's Hospital,Wuhan,Hubei430000,China)

ObjectiveTo study the role of vasoactive intestinal polypeptide(VIP)and Calponin in the pathogenesis of cholecystolithiasis.MethodsTwo dietary groups of New Zealand rabbits with 20 in each were allocated 1.2 g/d high cholesterol diet and common diet for 4 weeks.ResultsComparing with the negative result in control group,cholesterol crystals and stones were found in 19 and 16 out of 20 gallbladders,respectively,under the polarizing microscope in lithogenic group.The positive expression of VIP and Calponin in gallbladder smooth muscle in lithogenic group was much higer than those in control group(P＜0.05).The positive expression of VIP and Calponin in Oddi sphincter in lithogenic group was much lower than those in control group(P＜0.05).The positive expression of VIP had a significant relation with Calponin(P＜0.05).ConclusionThe disorder of Calponin and VIP regulation,which induces gallbladder function disorder,plays an important role in gallstone formation.

gallstone;Calponin;vasoactive intestinal polypeptide;smooth muscle of gallbladder;Oddi sphincter

R657.42;R-332

A

1671-8348(2010)05-0524-03

2009-08-15

2009-09-10)

?論 著?