王曉云，王愛國.河南中醫(yī)藥大學，河南鄭州　45005；.鄭州市骨科醫(yī)院，河南鄭州　45005

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活絡骨康丸對兔激素性股骨頭壞死TNF-α、AKP表達的影響

王曉云1，王愛國2
1.河南中醫(yī)藥大學，河南鄭州450052；2.鄭州市骨科醫(yī)院，河南鄭州450052

［摘要］目的通過給已經(jīng)激素造成股骨頭壞死的兔子喂食該院的活絡骨康丸，然后取血清測量其中TNF-α、AKP的變化，來探索活絡骨康丸治療機制。方法2015年3月—2016年3月，36只新西蘭兔隨機分為正常組10只與模型組26只，應用甲強龍聯(lián)合馬血清制造股骨頭壞死模型。測量兔子血清中TNF-α、AKP；造模成功后隨機分組，模型實驗組（9只）在普通飼料基礎上加活絡骨康丸進行干預，對空白組（9只）和模型對照組（9只）普通飼料喂養(yǎng)，并于不同時間點檢驗血清相關因子。結(jié)果①給活絡骨康丸前血清TNF-α、AKP含量比較：模型對照組（3.24±0.29；38.04±3.25）和模型實驗組（3.30±0.42；37.90±4.19）較之空白對照組（1.62±0.42；27.81±2.86）TNF-α、AKP水平都顯著性增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型實驗組（3.30±0.42；37.90±4.19）與模型對照組（3.24±0.29；38.04±3.25）差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。②給活絡骨康丸后血清TNF-α、AKP含量比較：各組血清中TNF-α、AKP的含量比較：模型對照組（3.16±0.25；37.51±3.91）和模型實驗組（2.17±0.64；28.94±4.89）較之空白對照組（1.85±0.68；27.94±3.65）有顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；實驗組中血清TNF-α、AKP的量明顯低于對照組，并且兩者的差異具統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論活絡骨康丸有效干預激素性股骨頭壞死兔模型血清中TNF-α、AKP增加，提示活絡骨康丸影響股骨頭壞死過程及提高成骨細胞活性，促進骨生長，從而起到抑制激素性股骨頭缺血性壞死進一步發(fā)展的治療作用。

［關鍵詞］活絡骨康丸；股骨頭壞死；TNF-a；AKP

激素性股骨頭壞死（steroid -inducednecrosis of femoral head，SNFH）是股骨頭缺血性壞死常見的一種。鄭州市骨科醫(yī)院純中藥制劑活絡骨康丸方組成：當歸、丹參、黃芪、雞血藤，川芎、續(xù)斷、骨碎補、土鱉蟲、乳香、沒藥、何首烏、鹿角膠、熟地黃、砂仁、地龍等。（規(guī)格：每瓶60 g，生產(chǎn)批號20080313，有鄭州市骨科醫(yī)院制劑室加工成丸），本方針對于激素性股骨頭壞死（steroid-induced avascular necrosisof femoral head，SANFH），在臨床上療效突出，效果滿意。該實驗自2015年3月—2016 年3月，選取36只新西蘭兔隨機分為正常組10只與模型組26只，模型組運用改進馬血清聯(lián)合甲強龍造模法［1］，建立激素性股骨頭壞死模型（造模過程死亡7只），檢測相關指標鑒定模型（正常組和造模組各處死一只進行鑒定）。造模成功后隨機分組，模型實驗組（9只）在普通飼料基礎上加活絡骨康丸進行干預，對空白組（9只）和模型對照組（9只）普通飼料喂養(yǎng)，并于不同時間點檢驗血清相關因子，旨在探討TNF-α、AKP水平升高是否對激素性股骨頭缺血壞死起到促進作用以及活絡骨康丸治療激素性股骨頭缺血性壞死（SANFH）的作用機制。

1　實驗內(nèi)容

1.1實驗動物

2015年3月—2016年3月，健康成年新西蘭兔36只（符合國際動物保護公約），普通級，體重1.7～2.5 kg，由鄭州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供（合格證編號：2007001102163）。實驗兔飼養(yǎng)于河南中醫(yī)學院動物實驗中心（實驗動物倫理審查批準編號：DWLL201409005）。實驗飼養(yǎng)環(huán)境恒溫恒濕，溫度（22±2）°C，相對濕度為55±5％，伺料為標準專用兔飼料，適應性喂養(yǎng)2周。

1.2主要藥品、試劑及儀器

主要實驗用藥活絡骨康丸（鄭州市骨科醫(yī)院藥劑科提供）、馬血清（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司）；甲基強的松龍（輝瑞制藥有限公司）；青霉素鈉（潤澤制藥（蘇州）有限公司）。

實驗器材：3K30低溫高速離心機（德國SIGMA）；電子天平（鄭州晶譽天平設備公司）；全自動生物組織脫水機（LEICA ST5020）；全自動生物組織包埋機（LEICA EG 1150 H）；全自動切片機（LEICA RM2245）；全自動顯微鏡（Olympus DP72 BX61）；主要試劑：YD-B（金華市益迪醫(yī)療設備廠）TNF-α檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司）、AKP檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.3試驗方法

1.3.1實驗兔分組將36只實驗用新西蘭兔分為兩組（按隨機數(shù)字表法）：正常組10只、造模組26只。給予造模，在造模中致實驗兔死亡7只。造模后隨機性選取正常組兔1只，造模組兔1只，麻醉后處死，行造模鑒定。造模鑒定成功，按隨機數(shù)字表法分剩余造模兔18只為兩組：造模對照組9只、實驗組9只。

運用實驗電子秤稱取兔固定箱重量W。將兔固定于兔固定箱內(nèi)，稱取兩者重量M，以后者M值減去前者W值即為實驗兔單只重量。實驗造模組兔注射馬血清、甲強龍、青霉素等操作、正常組兔生理鹽水注射為科學行造模鑒定，正常組兔行與造模組兔同等計量的生理鹽水注射。步驟同上。

1.3.2實驗兔造模鑒定給藥干預造模完后，隨機選取正常組兔1只，模型組兔1只，參考王偉［1］的方法進行造模的鑒定并記錄：光鏡下觀察骨、骨髓組織、骨小梁、髓內(nèi)脂肪組織等的變化并行比較，以骨小梁中正常骨細胞的數(shù)量減少，骨陷窩內(nèi)骨細胞消失，空骨陷窩數(shù)明顯增多［1］，并行X光攝片比較［2］，以判定造模的成功。

表1　正常組及造模組兔股骨頭造模鑒定大體形態(tài)

圖1　正常對照組造模組

圖2　

圖3　

實驗兔給藥干預：通過鑒定模型判定造模成功后，將模型組隨機平分兩組各9只造模兔，一組為模型實驗組，一組為模型對照組?；罱j骨康丸研末，模型實驗組每日按1.5 g/（kg·d）給予活絡骨康丸藥物，研末均勻混拌于兔飼料中。模型對照組和空白對照組同時同步予以常規(guī)飼料飼養(yǎng)。

1.3.3血清采集分別于用藥干預前和用藥4周后，對3組實驗動物行禁食8 h處理，保證自由飲水，實驗動物以10％水合氯酸4 mL/kg行腹腔注射進行麻醉，取約8 mL腹主動脈血，室溫靜置1 h后，離心（3 000 r/min，15 min）取上清液，微量移液槍采緩慢吸出分裝［2］。存置-20℃冰箱待測。送實驗室測TNF-α、AKP值。

2　實驗結(jié)果

2.1兔股骨頭造模X線比較

隨機選取1只正常對照組實驗兔股骨頭，X線具備完整結(jié)構(gòu)形態(tài)，清晰的關節(jié)面，均勻的骨密度；隨機選取的1只造模組實驗兔股骨頭X線顯現(xiàn)模糊的關節(jié)面，骨質(zhì)結(jié)構(gòu)不清楚，骨質(zhì)密度亦不均勻。如圖1。

2.2正常組及造模組兔股骨頭造模鑒定大體形態(tài)見表1。

3　實驗兔血清TNF-α、AKP含量比較

酶標儀在波長450 nm測定吸光值（OD），測定吸光值后在Excel工作表中，以標準品濃度作縱坐標，對應OD值作橫坐標，繪制出標準品線性回歸標準曲線（準確性R≥0.99），并從標準曲線可得到待測TNF-α、IL-6的實際蛋白含量（pg/mL）。

3.1ELISA標準曲線

如圖2、圖3。

3.2實驗兔血清TNF-α、AKP含量比較

分析表2可知，各組血清中TNF-α、AKP的含量比較：模型對照組和實驗組較之空白對照組都顯著性增高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；實驗組與模型對照的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2　各組實驗兔在造模后、給藥前TNF-α、AKP的蛋白含量（±s）

表2　各組實驗兔在造模后、給藥前TNF-α、AKP的蛋白含量（±s）

注：△與空白對照組比較，P＜0.05。

組別　蛋白含量TNF-α（ug/mL）　AKP（U/mL）空白對照組（n=9）模型對照組（n=9）實驗組（n=9）1.62±0.42 （3.24±0.29）△（3.30±0.24）△27.81±2.86 （38.04±3.25）△（37.90±4.19）△

分析表3可知，各組血清中TNF-α、AKP的含量比較：模型對照組和實驗組較之空白對照組有顯著增高，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；實驗組較之模型對照組的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3　各組實驗兔實驗結(jié)束TNF-α、AKP的蛋白含量（±s）

表3　各組實驗兔實驗結(jié)束TNF-α、AKP的蛋白含量（±s）

注：△與空白對照組比較，P＜0.05。

組別　蛋白含量TNF-α（ug/mL）　AKP（U/mL）空白對照組（n=9）模型對照組（n=9）實驗組（n=9）1.85±0.68 （3.16±0.25）△2.17±0.64 27.94±3.65 （37.51±3.91）△28.94±4.89

3　討論

活絡骨康丸是鄭州市骨科醫(yī)院針對中早期股骨頭壞死的臨床常用自制劑，臨床應用以來療效確切，效果滿意，價格低廉。全方由當歸、丹參、黃芪、雞血藤、川芎、土鱉蟲、骨碎補、乳香、沒藥、何首烏、鹿角膠、熟地黃、砂仁、地龍等13味中藥組成，臨床具有集破淤血、通經(jīng)絡，行氣止痛、壯筋骨作用，現(xiàn)代醫(yī)學研究證明，本方可以有效降低血小板粘附及改善毛細血管通透性，同時還具有降低血脂的作用，可以有效降低股骨頭壞死發(fā)病過程中產(chǎn)生的炎癥反應［3-4］可以治療股骨頭壞死。

該實驗通過給活絡骨康丸前血清TNF-α、AKP含量比較：模型對照組（3.24±0.29；38.04±3.25）和模型實驗組（3.30±0.42；37.90±4.19）較之空白對照組（1.62± 0.42；27.81±2.86）TNF-α、AKP水平都顯著性增高；給活絡骨康丸后血清TNF-α、AKP含量比較：模型對照組（3.16±0.25；37.51±3.91）和模型實驗組（2.17±0.64；28.94±4.89）較之空白對照組（1.85±0.68；27.94±3.65）有顯著增高。由此可知：①TNF-α、AKP的升高可能對激素性股骨頭壞死的形成起到重要作用；②該院制劑活絡骨康丸可能通過降低TNF-α、AKP水平從而對激素性股骨頭壞死起到治療作用。

TNF-α、AKP水平的升高在誘發(fā)激素性股骨頭壞死出現(xiàn)的發(fā)病機制可能為：①激素誘導下，TNF-α、AKP水平升高，破壞股骨頭內(nèi)皮細胞，從而出現(xiàn)血管內(nèi)凝血障礙，以致影響股骨頭的血液供應［5］；②TNF-α、AKP水平升高可以刺激軟骨細胞和滑膜細胞合成膠原酶酶及PGE-2［6-7］，從而造成關節(jié)的破壞；③通過刺激骨吸收作用，從而引起骨與軟骨的吸收破壞，導致成纖維細胞的增生，并誘發(fā)破骨細胞的增加［8］；④TNF-α、AKP水平升高可以誘導自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化，從而導致股骨頭細胞破壞，出現(xiàn)股骨頭缺血壞死［9］。

綜上所述，活絡骨康丸是以激素性股骨頭壞死的病理機制為出發(fā)點，通過調(diào)節(jié)TNF-α、AKP水平，改善微循環(huán)障礙，抑制炎癥的發(fā)生，促進死骨的修復和新骨的生成，起到緩解關節(jié)疼痛，改善髖關節(jié)功能障礙的作用，阻止或逆轉(zhuǎn)激素性股骨頭壞死的病程進展。

該實驗僅初步探索鄭州市骨科醫(yī)院純中藥制劑活絡骨康丸治療激素性缺血性股骨頭壞死的作用機制，但是針對本方劑如何導致TNF-α、AKP水平降低的確切機制有待進一步研究和發(fā)現(xiàn)。

［參考文獻］

［1］王偉，劉利英，王坤正，等.激素性股骨頭壞死模型的建立及其發(fā)病機理的探討［J］.西安交通大學學報：醫(yī)學版，2007，28（5）544-547.

［2］袁普衛(wèi)，殷繼超，賀西京，等.中藥復方骨復生對激素性股骨頭缺血壞死家兔TNF-α的影響［J］.中國骨傷，2004，17 （11）662-664.

［3］Sanchez S，Monroy V，Rojas Lopez M，et al. c-erbB-2 aa possible target for the use of magnetic nanoparticles inbreast cancer cells［J］.IEEE Trans Nanobioscience，2014，13（3）：300-307.

［4］Wang B，Wang X，Wang J，et al.Expression of Ki67 and clinicopathologicalfeatures in breast cancer［J］.Zhonghua Zhong Liu ZaZhi，2014，36（4）：273-275.

［5］蘇美瑩，施斌，張玉峰.二膦酸鹽對口腔種植的影響［J］.國際口腔醫(yī)學雜志，2013，40（5）：653-656.

［6］胡興國，陽紅艷，文錕，等.脊髓膠質(zhì)細胞p38有絲分裂原活化蛋白激酶在大鼠持續(xù)性術(shù)后痛形成中的作用：與Toll樣受體4的關系［J］.中華麻醉學雜志，2014，34（5）：574-577.

［7］于潼，謝利民，張振南，等.股骨頭壞死與中醫(yī)體質(zhì)特征的研究探討［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014（28）：3188-3189， 3190.

［8］于雪峰，陳凱云，呂岫華，等.基于中醫(yī)“治未病”理論探討骨蝕靈膠囊預防激素性股骨壞死的實驗研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2014，21（4）：369-371.

［9］崔宏勛，郭珈宜，郭馬瓏，等.名老中醫(yī)郭艷錦中醫(yī)整體療法治療股骨頭壞死的經(jīng)驗總結(jié)嘰［J］.中國中醫(yī)藥科技，2014 （z2）：41-42.

Effect of Huoluogukang Pill on TNF-a and AKP Expressions in Rabbits with Steroid-induced Osteonecrosis

WA NG Xiao-yun1，WANG Ai-guo2
1. Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou，Henan Province，450052 China；2. Zhengzhou Orthopaedic Hospital，Zhengzhou，Henan Province，450052 China

［Abstract］Objective To explore the treatment mechanism of huoluogukang pill by feeding huoluogukang pill of our hospital to the rabbits with steroid-induced osteonecrosis caused by hormone and then the serum was taken out for measuring the changes of TNF-α and AKP. Methods 36 New Zealand rabbits were randomly divided into the normal group with 10 and model group with 26 from March 2015 to March 2016，and the osteonecrosis model was made of methylprednisolone and horse serum，the serum TNF-α and AKP of rabbits were measured；and the rabbits were randomly divided into groups after the model was made successfully，the model experimental group（9）were given huoluogukang pill for intervention on the basis of the normal feed，the blank group（9）and model control group（9）fed on normal feed，and the serum correlation factor was tested at the different time points. Results（1）Before giving huoluogukang pill，the TNF-α and AKP levels in the model control group and the model experimental group obviously increased compared with those in the blank control group，and the differences had statistical significance，［（3.24±0.29；38.04±3.25），（30±0.42；37.90±4.19）vs（1.62±0.42；27.81±2.86）］，P＜

0.05；but the differences in the TNF-α and AKP levels between the model control group and the model experimental group were not big without statistical significance，P＞0.05.（2）After giving huoluogukang pill，the TNF-α and AKP levels in the model control group and the model experimental group obviously increased compared with those in the blank control group，and the differences had statistical significance，［（3.16±0.25；37.51±3.91），（2.17±0.64；28.94±4.89）vs（1.85±0.68；27.94± 3.65）］，P＜0.05；the serum TNF-α and AKP levels in the experimental group were obviously lower than those in the control group，and the differences had statistical significance，P＜0.05. Conclusion The serum TNF-α and AKP in rabbit models with steroid-induced osteonecrosis increase after the effective intervention of huoluogukang pill，which reminds that the huoluogukang pill can influence the process of osteonecrosis，improve activity of osteoblast and promote bone growth thus inhabiting the further development of steroid-induced avascular necrosis of the femoral head.

［Key words］Huoluogukang pill；Osteonecrosis；TNF-a；AKP

［中圖分類號］R681

［文獻標識碼］A

［文章編號］1674-0742（2016）05（b）-0086-05

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.14.086

［作者簡介］王曉云（1980-），男，河南滑縣人，在讀碩士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)骨傷病的研究和防治工作。

收稿日期：（2016-02-20）