葛軍軍，陳翩，黃依露，馮波，葉曉霞

（溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035，1.藥學(xué)院；2.環(huán)境與健康生態(tài)研究所）

·論 著·

苦楝樹(shù)皮提取物對(duì)斜紋夜蛾的毒殺和拒食作用

葛軍軍1，陳翩1，黃依露1，馮波2，葉曉霞1

（溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035，1.藥學(xué)院；2.環(huán)境與健康生態(tài)研究所）

目的：觀察苦楝樹(shù)皮提取物中不同極性組段對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的毒殺與拒食作用，尋找活性成分主要存在的組段。方法：苦楝樹(shù)皮經(jīng)95%乙醇冷浸提取，濃縮成浸膏，用乙酸乙酯萃取后得到粗提物，運(yùn)用硅膠柱層析分離為不同極性的15個(gè)組段（K1～K15），采用葉碟法測(cè)定不同極性組段在低劑量（10-6g/mL）、中劑量（10-4g/mL）、高劑量（10-2g/mL）下對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的取食葉面積與死亡率的影響。結(jié)果：苦楝樹(shù)皮提取物對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)具有明顯的拒食作用，且與劑量成正比。而K5、K6、K10組段在10-2g/mL濃度下表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的毒殺作用，死亡率為100%。K11組段對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)也有一定的毒殺作用，死亡率為33.3%。K5、K6組段在10-6g/mL濃度下，均有較好的拒食作用。結(jié)論：K5、K6組段比K10、K11組段對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)具有更顯著的拒食與毒殺作用，且在K5、K6組段中有望分離得到單一活性成分。

苦楝樹(shù)皮；乙酸乙酯提取物；斜紋夜蛾；拒食活性；毒殺作用

植物源農(nóng)藥以高效、低毒、低殘留、無(wú)公害等特點(diǎn)而獲得了越來(lái)越多的關(guān)注，尤其是在化學(xué)性農(nóng)藥廣泛流行的現(xiàn)在，從植物中提取分離對(duì)昆蟲(chóng)有防治作用的活性物質(zhì)顯得尤為重要。

苦楝（Melia azedarach Linn.）隸屬楝科，為楝科落葉喬木植物，是藥用植物[1-6]?！吨袊?guó)藥典》中記載，苦楝具有殺蟲(chóng)等藥用價(jià)值。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其次級(jí)代謝產(chǎn)物，尤其是三萜類化合物常表現(xiàn)出昆蟲(chóng)拒食活性[7-8]。但此類研究往往集中于乙醇粗提取物，對(duì)苦楝中單一活性化合物的毒殺與拒食活性研究鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究采用葉碟法，觀察苦楝樹(shù)皮乙酸乙酯提取物及其不同極性組段對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)（Spodoptera litura）[9]的拒食作用，以希望找到活性單體主要存在的組段，對(duì)其進(jìn)行分離純化，為開(kāi)發(fā)天然、綠色的農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx(chóng)：斜紋夜蛾幼蟲(chóng)，齡期為4～6齡，采集自浙江省溫州市甌海區(qū)芋田內(nèi)，置于28 ℃室內(nèi)用卷心菜菜葉飼養(yǎng)，繁殖2代后，挑選健康、大小一致的幼蟲(chóng)供試。

1.1.2 試劑與儀器：硅膠H及薄層層析硅膠板HSGF254（青島海洋化工有限公司）；茴香醛顯色劑（實(shí)驗(yàn)室自配：135 mL無(wú)水乙醇+5 mL濃硫酸+1.5 mL冰醋酸+3.7 mL茴香醛）；乙醇、石油醚、乙酸乙酯（無(wú)錫市佳妮化工有限公司）；ZF-1型三用紫外分析儀（上?？茖W(xué)儀器有限公司）；R-205型旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苦楝樹(shù)皮乙酸乙酯提取物的提取：取干燥的苦楝樹(shù)皮樣品10.6 kg，粉碎，用95%乙醇冷浸3次，每次冷浸7 d。合并冷浸后的提取液，減壓回收乙醇至無(wú)醇味，濃縮得到濃浸膏約200 g。將上述得到的濃浸膏用蒸餾水混懸，再用乙酸乙酯萃取數(shù)次，減壓濃縮，得到乙酸乙酯提取物160 g，從中取200 mg，溶于50%乙醇中配置成不同濃度的溶液，冷藏備用。

1.2.2 苦楝樹(shù)皮乙酸乙酯提取物的分離：取苦楝樹(shù)皮乙酸乙酯提取物145 g，用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，采用石油醚/乙酸乙酯（20∶1→1∶1）梯度洗脫，薄層層析硅膠板跟蹤，合并相似成分，共得到15個(gè)不同極性組段（K1～K15）。分別取各組段200 mg，溶于50%乙醇中配置成不同濃度（10-2g/ mL、10-4g/mL、10-6g/mL）的溶液，冷藏備用。鑒于三萜類活性物質(zhì)為中、小極性化合物，故本研究著重對(duì)中、小極性組段（K4～K13）進(jìn)行活性實(shí)驗(yàn)。1.2.3 拒食活性的測(cè)定：采用葉碟法[10]，將卷心菜菜葉清洗干凈，晾干。用方形打孔器（2.5 mm× 2.5 mm）打成葉碟，放入供試樣品的稀釋液（50%乙醇稀釋）中浸泡5 s，對(duì)照組則放入50%乙醇水溶液中浸泡5 s。取出葉碟在陰涼處揮發(fā)，待溶劑揮發(fā)完全后放入墊有濾紙（加少量蒸餾水保濕）的培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中。每個(gè)培養(yǎng)皿放入1片葉碟，接入已饑餓2 h的試蟲(chóng)1頭，每隔2 h后用方格紙分別計(jì)算試蟲(chóng)取食葉面積（mm2）。每天重復(fù)上述操作3次，其余時(shí)間喂食未經(jīng)處理的菜葉。試蟲(chóng)化蛹時(shí)則實(shí)驗(yàn)結(jié)束。拒食率的計(jì)算公式：

1.2.4 毒殺作用的測(cè)定：采用浸葉接蟲(chóng)法[11]，將卷心菜菜葉清洗干凈，晾干。用方形打孔器（2.5 mm× 2.5 mm）打成葉碟，放入供試樣品的稀釋液（50%乙醇稀釋）中浸泡5 s，對(duì)照組則放入50%乙醇水溶液浸泡5 s。取出葉碟在陰涼處揮發(fā)，待溶劑揮發(fā)完全后放入墊有濾紙（加少量蒸餾水保濕）的培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中。每個(gè)培養(yǎng)皿放入5片葉碟，接入試蟲(chóng)1頭（防止饑餓時(shí)互相撕咬，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果），每隔24 h觀察試蟲(chóng)死亡數(shù)，并更換新鮮處理葉碟。連續(xù)記錄72 h。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，以表示。組間差異比較采用One-way ANOVA檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苦楝樹(shù)皮乙酸乙酯提取物對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的拒食作用 如表1所示，不同濃度的苦楝樹(shù)皮乙酸乙酯提取物對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)有明顯的拒食活性，拒食活性的高低與濃度成正比。

表1 苦楝樹(shù)皮乙酸乙酯提取物對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的拒食作用（n= 18，）

表1 苦楝樹(shù)皮乙酸乙酯提取物對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的拒食作用（n= 18，）

注：數(shù)據(jù)右上角不同的字母表示各組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

組別平均每次取食面積（mm2）平均每次拒食率（%）苦楝樹(shù)皮10-2g/mL12.15±1.49a66苦楝樹(shù)皮10-4g/mL18.59±2.32b47苦楝樹(shù)皮10-6g/mL24.78±3.34c30對(duì)照組35.22±4.44d0

2.2 苦楝樹(shù)皮各組段在不同濃度下對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的毒殺效果 在10-2g/mL濃度下，含有K5、K6、K10組段的葉碟喂食試蟲(chóng)1 h后，試蟲(chóng)開(kāi)始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，并且死亡率均達(dá)到了100%，對(duì)試蟲(chóng)表現(xiàn)出了強(qiáng)烈的毒殺作用。含有K11組段的葉碟喂食試蟲(chóng)2 d后，試蟲(chóng)開(kāi)始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，死亡率為33.3%，而喂食了其他組段的試蟲(chóng)死亡率均為0，無(wú)毒殺作用。在10-4g/mL、10-6g/mL濃度下，所有試蟲(chóng)死亡率均為0，無(wú)毒殺作用。

2.3 苦楝樹(shù)皮各組段在不同濃度下對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的拒食測(cè)定

2.3.1 各組段在10-2g/mL濃度下對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的拒食作用：在上述的毒殺實(shí)驗(yàn)中，K5、K6、K10組段表現(xiàn)出強(qiáng)烈的毒殺作用，因此，這3組不列入10-2g/mL濃度下拒食活性測(cè)定。對(duì)無(wú)（弱）毒殺作用的組段（K4、K7～K9、K11～K13）進(jìn)行了拒食活性測(cè)定。結(jié)果如表2所示，在10-2g/mL濃度下，各組段處理過(guò)的葉碟喂食試蟲(chóng)后，試蟲(chóng)均表現(xiàn)出了拒食活性。但K4組段對(duì)試蟲(chóng)平均每次的拒食率下降幅度很大，由于本研究著重探尋活性成分主要存在的組段，故K4組段不列入后續(xù)研究。

表2 各組段在10-2g/mL濃度下對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的拒食作用（n=18，）

表2 各組段在10-2g/mL濃度下對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的拒食作用（n=18，）

注：數(shù)據(jù)右上角不同的字母表示各組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），相同的字母表示各組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

組段蟲(chóng)齡平均每次取食面積（mm2）平均每次拒食率（%）K44 8.16±1.07e81.8 K74 2.56±0.26c94.3 K84 4.47±0.73d90.0 K94 4.38±0.68d90.0 K114 0.34±0.09a99.2 K124 1.27±0.21b97.2 K134 5.01±0.41d88.8對(duì)照444.88±4.14f0 k4556.39±3.45e40.9 k75 7.58±1.13c92.1 k85 8.55±1.36c91.0 k95 8.81±1.03c90.8 k115 0.68±0.18a99.3 k125 2.57±0.41b97.3 k135 37.6±1.58d60.6對(duì)照595.49±7.01f0 k46211.93±7.57f033.7 k7619.40±2.47b93.9 k8629.16±2.16c90.9 k9629.29±1.64c90.8 k116 0.82±0.43a99.7 k12645.94±3.22d85.6 k13658.92±3.32e81.6對(duì)照6319.61±12.08g0

2.3.2 各組段在10-4g/mL濃度下對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的拒食作用：如表3所示，在10-4g/mL濃度下，對(duì)4齡試蟲(chóng)而言，各組段均有拒食作用。對(duì)5齡試蟲(chóng)而言，K8、K9、K11、K12組段無(wú)拒食作用，此外K13組段的拒食作用也較弱，其余各組段的拒食作用均較明顯。對(duì)6齡試蟲(chóng)而言，K9、K12組段無(wú)拒食作用，而K8、K11、K13組段的拒食作用也很弱，拒食率均在15%以下，其余各組段的拒食作用均較明顯。而K8、K9、K11、K12、K13組段對(duì)試蟲(chóng)平均每次的拒食率下降幅度最明顯，由于本實(shí)驗(yàn)著重探尋活性成分主要存在組段，故接下來(lái)K8～K9、K11～K13組段不列入研究對(duì)象。

表3 各組段在10-4g/mL濃度下對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的拒食作用（n=18，）

表3 各組段在10-4g/mL濃度下對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的拒食作用（n=18，）

注：數(shù)據(jù)右上角不同的字母表示各組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），相同的字母表示各組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

組段蟲(chóng)齡平均每次取食面積（mm2）平均每次拒食率（%）K5409.71±1.33ab70.5 K646.53±1.06a80.2 K7412.14±1.34c0 63.2 K8431.22±1.89e0 5.4 K9421.50±1.84d0 34.8 K1046.24±1.26a81.1 K114 8.24±0.95ab75.0 K12420.19±1.55d038.8 K13411.05±1.10bc66.5對(duì)照432.98±5.64e00 K55 21.9±3.93ab68.3 K6513.59±1.42a080.3 K7520.41±1.82b070.4 K8587.80±8.92de-27.2 K95109.23±9.02e0-58.2 K10524.07±2.63b065.1 K11576.61±9.10d0-10.1 K125 97.30±12.96de-40.9 K13549.02±4.30c029.0對(duì)照569.04±6.70d00 K5666.17±2.77b079.9 K6647.24±4.88a085.7 K7683.85±4.08c074.6 K86323.93±14.94de1.8 K96371.46±13.84g0-12.6 K10688.76±3.51c073.1 K116286.77±10.30d013.1 K126359.73±11.79fg-9.0 K136314.56±14.66de4.7對(duì)照6329.93±14.30ef0

2.3.3 各組段在10-6g/mL濃度下對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的拒食作用：如表4所示，在10-6g/mL濃度下，所有組段對(duì)各齡期試蟲(chóng)均有拒食作用，尤其是K5、K6組段，平均每次的拒食率下降幅度很少，拒食效果最好。實(shí)驗(yàn)表明K5、K6組段為拒食活性成分主要存在的組段，對(duì)此兩組段進(jìn)行分離純化，有望得到單一活性化合物。

表4 各組段在10-6g/mL濃度下對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的拒食作用（n=18，）

表4 各組段在10-6g/mL濃度下對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的拒食作用（n=18，）

注：數(shù)據(jù)右上角不同的字母表示各組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），相同的字母表示各組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）

組段蟲(chóng)齡平均每次取食面積（mm2）平均每次拒食率（%）k54 13.59±3.34ab60.3 k64 12.25±1.00a64.2 k74 11.39±1.39a66.8 k104 17.99±2.03b47.6對(duì)照4 34.30±2.30c0 k55 51.14±1.21a66.2 k65 64.88±0.62b57.1 k75 96.80±1.95c36.0 k105 97.33±1.53c35.7對(duì)照5151.27±9.21d0 k56198.66±2.12a42.9 k66207.77±1.39a40.3 k76318.83±2.63b8.4 k106317.35±3.35b8.8對(duì)照6347.93±7.10c0

3 討論

斜紋夜蛾主要以幼蟲(chóng)危害植物全株，是一種危害性很大的害蟲(chóng)。本研究特選擇此蟲(chóng)進(jìn)行拒食活性研究，結(jié)果顯示，苦楝樹(shù)皮乙酸乙酯提取物在10-2g/ mL、10-4g/mL、10-6g/mL下對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)有明顯的拒食活性，且與濃度成正比，證明苦楝樹(shù)皮中存在拒食活性成分。將苦楝樹(shù)皮乙酸乙酯提取物進(jìn)行進(jìn)一步分離得到不同極性組段（K1～K15）。斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的毒殺結(jié)果顯示，K5、K6、K10組段在10-2g/mL濃度下表現(xiàn)出強(qiáng)烈的毒殺作用，K11組段對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)也有一定的毒殺作用，而其在10-4g/mL和10-6g/mL濃度下無(wú)毒殺作用。這提示我們?cè)谶@4個(gè)組段中存在單一活性物質(zhì)，在高濃度下對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)有毒殺作用。此外，斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的拒食結(jié)果顯示，K5、K6組段即使在10-6g/mL濃度時(shí)，仍有較好的拒食作用，這表示對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)有拒食作用的成分主要分布在這兩個(gè)組段。

在后續(xù)研究中，我們對(duì)K5、K6組段進(jìn)行了分離純化，并得到了14個(gè)單一化合物（數(shù)據(jù)另文發(fā)表）。各單一化合物對(duì)斜紋夜蛾幼蟲(chóng)的拒食活性尚在研究中。

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（本文編輯：吳昔昔）

Antifeeding and toxic activity of ethyl acetate extract from barks of Melia azedarach L against Spodoptera

litura larvaeGE Junjun1, CHEN Pian1, HUANG Yilu1, FENG Bo2, YE Xiaoxia1. 1.School of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Institute of Healthy & Environmental Ecology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: In order to find new compounds with strong antifeeding activities, the crude extract and fractions from barks of Melia azedarach L. were selected for their antifeeding and toxic activity against Spodoptera litura larvae. Methods: The 95% ethanol extract of the barks of Melia azedarach L. was concentrated, and the aqueous solution was partitioned with ethyl acetate. The ethyl acetate extract was subjected to silica gel CC eluted with ether-ethyl acetate to give 15 fractions (K1～K15). The fractions were investigated against Spodoptera litura larvae by leaf disc method to test the leaf area and the mortality. Results: Ethyl acetate extract from barks of Melia showed significant antifeeding activity against Spodoptera litura larvae, which was improved with increased dosages. Fractions 5, 6, 10 displayed strong toxic effects, and Fraction 11 also indicated toxic effects. Fractions 5, 6 revealed strong antifeeding activity even at the low concentration. Conclusion: Fractions 5, 6 demonstrate obvious antifeeding and toxic activity against Spodoptera litura larvae than Fractions 10, 11. The fractions which reflect stronger antifeeding activity will be isolated and purifies in hoping of achieving the new active compounds.

Melia azedarach barks; ethyl acetate extract; Spodoptera litura larvae; antifeedant; toxic

R979.8

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.08.002

2015-05-08

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY12B02007）。

葛軍軍（1989-），女，浙江湖州人，碩士生。

葉曉霞，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：yxx@wmu.edu. cn。