朱建寧，張衛(wèi)兵，張忠明，楊敏，文鵬程，宋雪梅，張丹妮

（1.甘肅省食品藥品監(jiān)督管理局，甘肅蘭州730000；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070）

米黑毛霉UV-LiCl-6凝乳酶酶學特性研究

朱建寧1，張衛(wèi)兵2*，張忠明2，楊敏2，文鵬程2，宋雪梅2，張丹妮2

（1.甘肅省食品藥品監(jiān)督管理局，甘肅蘭州730000；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070）

以米黑毛霉凝乳酶為研究對象，研究反應(yīng)溫度、pH值、脫脂乳濃度、金屬離子對凝乳酶活力的影響。結(jié)果表明，米黑毛霉凝乳酶最適反應(yīng)溫度為75℃，在35℃～45℃穩(wěn)定性較好；米黑毛霉凝乳酶的最適pH值為6.0，在pH值為7.0～10.0時較為穩(wěn)定；脫脂乳濃度為20.0%時，相對凝乳酶活力達到最大值；Mn2+、Mg2+、Na+對凝乳酶的凝乳活力有促進作用，K+、Sn2+、Cu2+對凝乳酶的凝乳活力有抑制作用。

凝乳酶；米黑毛霉；酶學特性

凝乳酶是一種最早在未斷奶的小牛胃中發(fā)現(xiàn)的天門冬氨酸蛋白酶，可專一地切割乳中κ-酪蛋白的Phe105-Met106之間的肽鍵，破壞酪蛋白膠束使牛奶凝結(jié)，凝乳酶的凝乳能力及蛋白水解能力使其成為干酪生產(chǎn)中形成質(zhì)構(gòu)和特殊風味的關(guān)鍵性酶，被廣泛應(yīng)用于奶酪制作。動物凝乳酶最早被用于干酪生產(chǎn)，應(yīng)用也最為廣泛，其產(chǎn)值占總量的70%。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年要宰殺5 000萬頭小牛，以獲得凝乳酶，造成全球性小牛短缺，由于原料缺乏，凝乳酶價格昂貴。植物凝乳酶雖然來源廣泛，但其蛋白水解力強，并且受時間、地點等限制難以發(fā)展[1]。微生物由于生長周期短，產(chǎn)量大，受氣候、地域、時間限制小，用其生產(chǎn)凝乳酶成本較低、提取方便、經(jīng)濟效益高，可以節(jié)約動、植物資源，所以微生物凝乳酶成為凝乳酶研究的熱點[2]。

國產(chǎn)凝乳酶的種質(zhì)資源主要包括毛霉類、根霉類和曲霉類[3]。不同來源微生物凝乳酶的酶學特性差異很大。高維東等[4]對微小毛霉凝乳酶的酶學性質(zhì)進行研究，結(jié)果表明酶的最適溫度為60℃，最適pH值為5.5，在65℃保溫5min活力損失95%；鈣離子是酶的激活劑，其含量與酶活力正相關(guān)，而鉀離子則對酶有抑制作用，氯化鈉對酶活力的影響不大。潘道東等[5]研究表明，根霉凝乳酶最適pH為5.7，在pH值為5.0～7.5時酶活力保持穩(wěn)定；最適反應(yīng)溫度45℃，60℃保持20min，則完全失活。

本試驗以米黑毛霉UV-LiCl-6凝乳酶為對象，研究反應(yīng)溫度、pH值、脫脂乳濃度、金屬離子對凝乳酶活力的影響，以期為凝乳酶的研究與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料米黑毛霉菌株：菌株為米黑毛霉UV-LiCl-6，由本實驗室選育并保藏。脫脂乳粉：黑龍江完達山乳業(yè)股份有限公司。麩皮，馬鈴薯。所用試劑均為市售國產(chǎn)分析純或化學純。

活化培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH值自然。基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：將麩皮與水按1∶0.8（w/v）的比例混合，攪拌均勻，在121℃、0.15 MPa下滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基：將麩皮與營養(yǎng)液按1∶0.8（w/v）的比例混合，攪拌均勻，在121℃、0.15MPa下滅菌20min。

營養(yǎng)液：葡萄糖2.5 g，乳清粉2.0 g，硝酸銨1.0 g，以蒸餾水溶解后，鹽酸調(diào)pH值至6.0，定容到100m l。

1.1.2 實驗設(shè)備HWS26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；AL204電子天平，梅特勒—托利多儀器上海有限公司；GZX-GF101-Ⅱ電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；NRY-200恒溫搖床，上海南榮實驗室設(shè)備有限公司；TGL-20M高速臺式冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；SW-CJ-ZFD型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的活化將米黑毛霉菌株UV-LiCl-6接種于斜面培養(yǎng)基進行活化，32℃培養(yǎng)4～5 d，待長滿黑色孢子后備用。

1.2.2 孢子懸浮液的制備向生長良好的試管斜面種子中加入10m l無菌生理鹽水，刮下孢子，移入裝有玻璃珠和無菌生理鹽水的三角瓶中振蕩，在搖床上振蕩打散，再用帶脫脂棉的漏斗進行過濾，調(diào)整孢子數(shù)為106個/m l。

1.2.3 粗酶液的制備將1 m l米黑毛霉種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，32℃恒溫培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)完成后，加入100 m l蒸餾水，20℃、180 r/min振蕩浸提1 h，浸提液用4層紗布過濾，濾液以10 000 r/min離心20min，上清液即為粗酶液。

1.2.4 酶活力的測定凝乳酶活力測定采用Arima等[6]的方法，用0.01 mol/L氯化鈣液配制10%脫脂奶粉液，配制后在室溫放置40min以上使用，當天使用，不宜冰箱放置。取5 m l 10%脫脂奶粉液在35℃保溫10 min，加0.5 m l適當稀釋的酶液（35℃保溫），立即搖勻，開始計時（凝乳時間控制在40～90 s），并把試管傾斜45°以上。沿試管周旋轉(zhuǎn)，以試管壁出現(xiàn)小顆粒為終點，記錄凝乳時間。在上述條件下，將40min凝1 m l 10%脫脂奶粉的酶量定義為一個Soxhlet單位（SU）。

公式中，D為酶液稀釋倍數(shù)，t為反應(yīng)時間。

1.2.5 反應(yīng)溫度對凝乳酶活力的影響將作用底物脫脂乳溶液分別在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃下保溫5min，把適當稀釋的凝乳酶在35℃下保溫5min待用，分別在相應(yīng)溫度下加入0.5m l酶液測定凝乳酶活力，獲得最高凝乳酶活力為100%（對照），計算相對凝乳酶活力[7]。

1.2.6 凝乳酶的熱穩(wěn)定性將酶液分別在35℃、45℃、55℃、65℃、70℃下保溫0、10、20、30、40、50、60min后，測定殘余凝乳酶活力，以未保溫酶液的凝乳酶活力為100%（對照），計算相對凝乳酶活力。

1.2.7 pH值對凝乳酶活力的影響用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/LNaOH將脫脂乳和酶液pH值調(diào)至5.5、6.0、6.5、7.0，測定不同反應(yīng)體系下的凝乳酶活力，以獲得的最高凝乳酶活力為100%（對照）。

1.2.8 凝乳酶的pH穩(wěn)定性分別用0.1 mol/L的甘氨酸-鹽酸緩沖液（pH值2.5～4.0）、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH值4.5～ 5.5）、磷酸鈉緩沖液（pH值6.0～8.5）、碳酸鹽緩沖液（pH值9.0～11.0）將酶液的pH值分別調(diào)節(jié)到3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0，在室溫下放置24 h，再將pH值調(diào)到5.5，測定殘余的凝乳酶活力，以獲得最高凝乳酶活力為100%（對照），計算相對凝乳酶活力。

1.2.9 脫脂乳濃度對凝乳酶活力的影響分別調(diào)整脫脂乳的濃度為2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 g/100 ml，測定酶液在不同濃度脫脂乳液中的凝乳活力，以獲得的最高凝乳酶活力為100%（對照），計算相對凝乳酶活力。

1.2.10 金屬離子對凝乳酶活力的影響在脫脂乳中分別加入MnSO4、MgSO4、CuSO4、KCl、NaCl、SnCl2，使其終濃度為1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L，加酶后在室溫下放置40min，測定凝乳酶活力，以未添加金屬離子酶液的凝乳酶活力為100%（對照），計算相對凝乳酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)溫度對凝乳酶活力的影響（見圖1）

圖1 反應(yīng)溫度對凝乳酶活力的影響

從圖1可以看出，隨著溫度的升高，相對凝乳酶活力逐漸增加，溫度達75℃時，相對凝乳酶活力達到最高值837.20%，隨著溫度的進一步升高，相對凝乳酶活力急劇下降，在80℃時降為91.98%，在85℃時，酶蛋白完全變性，已無凝乳酶活力。所以，凝乳酶的最適溫度是75℃，隨著溫度的升高，活力逐漸減低直至失活。

2.2 凝乳酶的熱穩(wěn)定性（見圖2）

圖2 凝乳酶的熱穩(wěn)定性

從圖2可以看出，在55℃時，隨著保溫時間的延長，相對凝乳酶活力逐漸增大，當保溫30min時，相對凝乳酶活力達到最大值218.22%，隨著保溫時間的延長，相對凝乳酶活力逐漸下降，保溫60 min時相對凝乳酶活力最低；在65℃時，隨著保溫時間的延長，相對凝乳酶活力逐漸增大，當保溫10min時，相對凝乳酶活力達到最大值181.41%，之后隨著保溫時間的延長，相對凝乳酶活力逐漸下降，保溫60 min時降到最低；在70℃時，隨著保溫時間的延長，相對凝乳酶活力持續(xù)下降，保溫20 min時，凝乳酶完全失活；在35℃～45℃，隨著保溫時間的延長，相對凝乳酶活力緩慢增大且較穩(wěn)定。綜上所述，凝乳酶在35℃～45℃穩(wěn)定性較好。

2.3 pH值對凝乳酶活力的影響（見圖3）

圖3 pH值對凝乳酶活力的影響

由圖3可以看出，隨著pH值的增大，相對凝乳酶活力先增大，pH值為6.0時，相對凝乳酶活力達最大值100%。之后，隨著pH值的增大，相對凝乳酶活力下降。有研究顯示，酸性環(huán)境對凝乳酶起促進作用的原因是pH值降低，導(dǎo)致酪蛋白疏水性增加，膠束易發(fā)生解離，從而促進酪蛋白聚集產(chǎn)生凝乳[8]。由上可知，凝乳酶的最適pH值為6.0。

2.4 凝乳酶的pH穩(wěn)定性（見圖4）

圖4 不同pH值下凝乳酶的穩(wěn)定性

由圖4可以看出，隨著pH值的增大，相對凝乳酶活力逐漸增大，當pH值為8.5時，相對凝乳酶活力達到最大值100.04%，之后隨著pH值的增大，相對凝乳酶活力逐漸下降。在pH值為7.0～10.0時，凝乳活力能保持在80%以上。

2.5 脫脂乳濃度對凝乳酶活力的影響（見圖5）

由圖5可以看出，隨著脫脂乳濃度的增加，凝乳酶活力迅速增大，當脫脂乳濃度達10.0%時，相對凝乳酶活力達99.17%，之后趨于穩(wěn)定，只有小幅度增加，脫脂乳濃度為20.0%時，凝乳酶活力達到最大值，為100%。

2.6 金屬離子對凝乳酶活性的影響（見圖6）

由圖6可知，一定濃度的Mn2+、Mg2+、Na+對凝乳酶的凝乳活力有促進作用，其中Na+對凝乳酶的凝乳活力有顯著的促進作用，K+、Sn2+、Cu2+對凝乳酶的凝乳活力有抑制作用。高巖等[9]研究表明，Mn2+、Mg2+、Ca2+對該酶的凝乳活力有明顯的促進作用，而Zn2+、Cu2+對其凝乳活力有抑制作用。

圖5 脫脂乳濃度對凝乳酶活性的影響

圖6 金屬離子對凝乳酶活性的影響

3 結(jié)論

研究表明，米黑毛霉凝乳酶最適反應(yīng)溫度為75℃；在35℃～45℃時凝乳酶熱穩(wěn)定性較好，70℃時，隨著保溫時間的延長，相對凝乳酶活力逐漸下降，到20 min時完全失活；米黑毛霉凝乳酶的最適pH值為6.0，在pH值為7.0～10.0時，凝乳酶較穩(wěn)定；脫脂乳濃度為20.0%時，凝乳酶活力達到最大值；Mn2+、Mg2+、Na+對凝乳酶的凝乳活力有促進作用，其中Na+對凝乳酶的凝乳活力有顯著的促進作用，K+、Sn2+、Cu2+對凝乳酶的凝乳活力有抑制作用。

[1]周俊清，林親錄.微生物源凝乳酶的研究進展[J].中國食品添加劑，2004，2（4）：6-9.

[2]姜峰，張?zhí)m威.我國凝乳酶特性及其替代品的研究現(xiàn)狀[J].食品研究與開發(fā)，2003，24（6）：3-6.

[3]甘伯中，高維東，丁福軍，等.微生物凝乳酶固體發(fā)酵條件的研究[J].食品工業(yè)科技，2008，29（4）：196-198.

[4]高維東，甘伯中，丁福軍，等.微小毛霉凝乳酶的酶學性質(zhì)研究[J].食品科學，2010，31（3）：185-188.

[5]潘道東，韓玲玲.根霉凝乳酶的分離純化及其酶學特性研究[J].中國食品學報，2011，11（2）：53-58.

[6]Arima K，Shiniter I，Gakuzo T.Milk-clott ing enzymes from microorganism.part I：screening test and identification of potent fungus[J].Agricultural and Biologi cal Chemistry，1967，31（5）：540-545.

[7]錢世鈞，張純青.微小毛霉凝乳酶的純化和性質(zhì)研究[J].微生物學報，1989，29（4）：272－277.

[8]薛璐，陳歷俊，姜鐵民，等.江米酒凝乳酶酶學特性的研究[J].食品科學，2008，29（4）：259-262.

[9]高巖，王景會，李玉秋，等.枯草芽孢桿菌凝乳酶的酶學性質(zhì)[J].吉林農(nóng)業(yè)大學學報，2012，34（4）：385-390.

（*通訊作者：張衛(wèi)兵）

G424.31

B

1671-1246（2017）13-0105-03

注：本文系甘肅省自然基金（1606RJZA079）；國家自然科學基金項目（31560442）；甘肅農(nóng)業(yè)大學青年導(dǎo)師扶持基金（GAU-QNDS-201502）