丁傅

摘要：“培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化”是新課標(biāo)教材“必修3：穩(wěn)態(tài)與環(huán)境”中的學(xué)生分組實(shí)驗(yàn)，需要學(xué)生學(xué)會(huì)使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)酵母。通過結(jié)合“培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化”這一實(shí)驗(yàn)和有關(guān)血球計(jì)數(shù)板的命題的分析，對(duì)血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)原理和操作方法中遇到一些問題進(jìn)行探討。

關(guān)鍵詞：血球計(jì)數(shù)板 生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)操作

中圖分類號(hào)：G633.91

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

在人教版高中生物教材中，“探究培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量變化”只作了基本的原則性指導(dǎo)，對(duì)一些操作過程的細(xì)節(jié)，沒有作細(xì)化闡述，而這些細(xì)節(jié)都是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵所在。

如何正確使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)酵母菌種群數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，是本實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。根據(jù)中學(xué)實(shí)驗(yàn)條件，用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法相對(duì)容易，只要指導(dǎo)學(xué)生掌握血球計(jì)數(shù)板的正確使用便可。但學(xué)生對(duì)血球計(jì)數(shù)板結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)不夠明確，教師也講解不清晰。而在近年來的高考題或模擬題中多次出現(xiàn)相關(guān)的試題，而且不僅從如何計(jì)算酵母的數(shù)量的角度來考查學(xué)生，還從操作方法或操作過程中出現(xiàn)的一些問題以及處理方法來考查學(xué)生。而教師在遇到這些問題往往讓學(xué)生記答案，學(xué)生對(duì)這些問題仍是感到疑惑。筆者在近年來的教學(xué)實(shí)踐中，將教師和學(xué)生在做該實(shí)驗(yàn)和相關(guān)命題遇到的一些問題，進(jìn)行了分析探討。

1 血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造和計(jì)數(shù)原理

雖然不同版本的教材推薦使用的血球計(jì)數(shù)板的規(guī)格不同，人教版建議使用2mmx2mmx0.1mm方格，蘇教版推薦使用1mmx1mmx0.1mm方格，但是血球計(jì)數(shù)板的使用原理和方法是相同的。以下以1mmx1mmx0.1mm方格的計(jì)數(shù)板為例分析結(jié)構(gòu)和計(jì)數(shù)原理。

每個(gè)血球計(jì)數(shù)板上有兩個(gè)計(jì)數(shù)室（圖1）。血球計(jì)數(shù)板上的符號(hào)和數(shù)字（圖1）的含義是：XB-K-25為計(jì)數(shù)板的型號(hào)和規(guī)格，表示此計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)室分25個(gè)中格；0.1mm為蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室的高；1/400mm²表示計(jì)數(shù)室面積是1mm²（計(jì)數(shù)室邊長(zhǎng)1mm），分400個(gè)小格，每小格面積是1/400mm²（圖2），9個(gè)大方格中只有中間的有小方格的中央大方格才是計(jì)數(shù)室。不要認(rèn)為9個(gè)大方格都是計(jì)數(shù)室。

計(jì)數(shù)室通常也有兩種規(guī)格：一種是16x25型，即大方格內(nèi)分為16中格，每一中格又分為25小格（圖2）；另一種是25x16型，即大方格內(nèi)分為25中格，每一中格又分為16小格。但是不管計(jì)數(shù)室是哪一種構(gòu)造，它們都有一個(gè)共同的特點(diǎn)，即每一大方格都是由16x25=25x16=400個(gè)小方格組成。

計(jì)數(shù)時(shí)，若計(jì)數(shù)室是由16個(gè)中方格組成，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個(gè)中方格（即100個(gè)小方格）的菌數(shù)。如果是由25個(gè)中方格組成的計(jì)數(shù)室，除數(shù)上述4個(gè)中方格外，還需數(shù)中央1個(gè)中方格（即80個(gè)小格方）的菌數(shù)（圖3）。計(jì)數(shù)時(shí)對(duì)壓在中格四條線上的細(xì)胞只計(jì)數(shù)相鄰兩邊及其夾角上的細(xì)胞（一般選左邊和上邊的線）。

以1minx1mmx0.1 mm方格的計(jì)數(shù)板為例，如果是25個(gè)中格的計(jì)數(shù)室，計(jì)數(shù)的5個(gè)中格菌數(shù)共N個(gè)，那么1mL培養(yǎng)液中菌數(shù)=N/5x25x10000x稀釋倍數(shù)。如果是16個(gè)中格的計(jì)數(shù)室，計(jì)數(shù)的4個(gè)中格菌數(shù)共N個(gè)，那么1mL培養(yǎng)液中菌數(shù)=N/4x16x10000x稀釋倍數(shù)。

2 血球計(jì)數(shù)板操作方法的注意事項(xiàng)

教師在介紹血球計(jì)數(shù)板的操作方法時(shí)，往往是比較簡(jiǎn)略的。學(xué)生在操作中因?yàn)閷?duì)操作要求不理解而造成操作不當(dāng)，或者對(duì)操作中出現(xiàn)的異常問題的處理不知如何處理。而通過分析近幾年的有關(guān)血球計(jì)數(shù)板的相關(guān)試題，更注重操作方面的考查，而教師在這方面對(duì)學(xué)生分析闡述得少。

（1）在取樣計(jì)數(shù)前，為什么要將酵母菌培養(yǎng)液進(jìn)行振蕩搖勻？

因?yàn)檫@樣使酵母菌分布均勻，防止酵母凝聚沉淀，提高計(jì)數(shù)的代表性和準(zhǔn)確性，減小培養(yǎng)液中的酵母菌數(shù)量誤差。

（2）為什么要先在計(jì)數(shù)室上蓋上蓋玻片，再滴加菌液？

通常滴加菌液時(shí)，采用的是“滲入法”：先將蓋片蓋住計(jì)數(shù)室，蓋片的兩端應(yīng)搭放在計(jì)數(shù)室兩側(cè)的支持柱上。從計(jì)數(shù)板中間平臺(tái)兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴（不宜過多，一般將滴管口沿蓋片邊緣與計(jì)數(shù)平臺(tái)之間的空隙輕輕靠一靠即可），讓菌懸液滲入并充滿計(jì)數(shù)室，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去多余菌液。技巧：用吸水紙吸去多余的培養(yǎng)液時(shí)要迅速，保證計(jì)數(shù)室被培養(yǎng)液充滿，以減少誤差。

但也可采用“壓滴法”：先將適量菌液滴加在計(jì)數(shù)平臺(tái)上，再將蓋片從一側(cè)壓到計(jì)數(shù)扳上，使蓋片搭放在兩則支持柱上，將菌液滴壓平。不管用哪種方法，都必須把握3個(gè)原則：加入待測(cè)菌液后，計(jì)數(shù)室內(nèi)不能產(chǎn)生氣泡；不能將菌懸液沾到蓋玻片表面，以免污染顯微鏡的高倍鏡頭；不能將菌液沾到計(jì)數(shù)平臺(tái)兩側(cè)的支持柱表面。比較而言，滲入法更容易操作。

（3）如果先滴加菌液，再加蓋玻片，容易出現(xiàn)什么誤差？怎么處理？

如果先滴加菌液，再加蓋玻片（壓滴法），容易使菌液沾到計(jì)數(shù)平臺(tái)兩側(cè)的支持柱表面，在支持柱表面形成一層水膜而使蓋片不能完全落在支持柱上。蓋玻片由于液滴的表面張力作用而未能嚴(yán)密的蓋到計(jì)數(shù)板表面上，使計(jì)數(shù)室內(nèi)的體積增大，計(jì)數(shù)結(jié)果將偏高。應(yīng)將血球計(jì)數(shù)板和蓋玻片洗凈、烘干重做。

（4）如果計(jì)數(shù)室中出現(xiàn)氣泡，會(huì)出現(xiàn)什么誤差？怎么處理？

如果計(jì)數(shù)室中出現(xiàn)氣泡，會(huì)使蓋玻片下有部分空間沒有充滿菌液，是待計(jì)數(shù)的菌液體積減少，導(dǎo)致結(jié)果偏小。應(yīng)將血球計(jì)數(shù)板和蓋玻片洗凈、烘干重做。也就要重新制片。

為什么不采用在蓋玻片一側(cè)滴加菌液，另一側(cè)用吸水紙吸引的“引流法”？這是因?yàn)橥ㄟ^引流法，將蓋玻片下方的液體可以進(jìn)行置換，可能會(huì)去除部分氣泡，但很難除盡氣泡。引出的菌液會(huì)帶走部分細(xì)胞，造成誤差。菌液也容易沾到蓋玻片表面，污染顯微鏡的高倍鏡頭而看不到目標(biāo)。

（5）血球計(jì)數(shù)板應(yīng)該如何正確清洗？

血球計(jì)數(shù)板使用結(jié)束后，應(yīng)采用清水浸泡和沖洗的方式清洗，并進(jìn)行烘干或自然晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。不能使用試管刷等硬物進(jìn)行擦洗。鏡檢每個(gè)小格中是否存有污物、殘菌，如不清潔，需重新清洗直至潔凈。

這是因?yàn)檠蛴?jì)數(shù)板的方格線非常精細(xì)、脆弱，當(dāng)用試管刷擦洗時(shí)會(huì)造成線條磨損。也不能用普通的餐巾紙等進(jìn)行拭擦，可能磨損線條，也會(huì)在計(jì)數(shù)室中留下紙纖維等污物。要用專用的拭鏡紙輕輕擦拭。另外在使用血球計(jì)數(shù)板前需要在顯微鏡下檢查，不干凈要清洗烘干再使用。

（6）使用顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，要注意哪些問題？

①血球計(jì)數(shù)板加樣后，需靜置片刻再使用顯微鏡計(jì)數(shù)。這是因?yàn)橛?jì)數(shù)室中的菌懸液有一定的高度（0.1mm）。需要讓細(xì)胞沉降到計(jì)數(shù)室底部的網(wǎng)格線中，避免細(xì)胞分布在不同液層深度，導(dǎo)致計(jì)數(shù)時(shí)被遺漏。

②先在低倍鏡下，找到網(wǎng)格，也就是要先找到計(jì)數(shù)室（有小網(wǎng)格的部分）。將第一個(gè)計(jì)數(shù)中格移到視野中心，再換高倍鏡逐小格觀察并計(jì)數(shù)。觀察時(shí)還應(yīng)安排一個(gè)順序，比如，依次按照左上中格、左下中格、右下中格、右上中格。若有第五中格時(shí)，當(dāng)計(jì)數(shù)到右上中格時(shí)，先向左移動(dòng)兩個(gè)中格，再往下移動(dòng)兩個(gè)中格便是最中間的一個(gè)中格。小格的觀察順序最好是從左到右，從上到下逐格進(jìn)行。計(jì)數(shù)時(shí)壓線的細(xì)胞本著計(jì)上不計(jì)下，計(jì)左不計(jì)右的原則，以免重復(fù)計(jì)數(shù)。

活酵母有芽殖現(xiàn)象，若芽體達(dá)到母細(xì)胞大小的一半時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)；若芽體小于母細(xì)胞一半時(shí)為一個(gè)酵母細(xì)胞。

③因?yàn)樯罱湍讣?xì)胞的折光率和培養(yǎng)液的折光率相近，所以觀察時(shí)要減弱光照的強(qiáng)度，將視野調(diào)暗些。但不能太暗，否則也看不清。

④每個(gè)樣品計(jì)數(shù)應(yīng)重復(fù)3次（每次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否則應(yīng)重新操作），取其平均值。

（7）如果細(xì)胞數(shù)目過多，難以數(shù)清，應(yīng)該采取什么措施？

如果一個(gè)小方格內(nèi)酵母菌過多，難以數(shù)清，應(yīng)該進(jìn)行稀釋，然后再進(jìn)行計(jì)數(shù)。一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有5～10個(gè)菌體為宜。

稀釋時(shí)要注意：將1mL樣液稀釋10倍，不是加10mL無菌水，而是加9mL無菌水，即加水稀釋后的體積是原來的10倍。這點(diǎn)不仔細(xì)就很容易分析錯(cuò)。例如將1mL樣液稀釋100倍，就應(yīng)該加99mL水。而不是90mL水。

（8）能不能區(qū)分活酵母細(xì)胞和死酵母細(xì)胞，避免計(jì)數(shù)出現(xiàn)較大誤差？

探究“酵母菌種群數(shù)量變化”，理應(yīng)為培養(yǎng)液中活菌體的數(shù)量變化，人教版教材中沒有提出活菌和死菌的分開計(jì)數(shù)問題。易理解成用總的菌體數(shù)作計(jì)數(shù)結(jié)果；蘇教版教材中雖建議用臺(tái)酚藍(lán)染液染色，但沒有說明這是對(duì)活菌（無色）和死菌（藍(lán)色）的區(qū)分，并且是將染液直接滴在血球計(jì)數(shù)板上，菌液濃度改變，造成誤差。正確的做法應(yīng)是另外制作裝片，通過染色對(duì)活菌和死菌加以區(qū)分，算出兩者比例，進(jìn)一步換算出總菌體數(shù)中的活菌數(shù)。由于臺(tái)酚藍(lán)染液配制相對(duì)復(fù)雜，且臺(tái)酚藍(lán)有一定致癌性，建議用呂氏堿性美藍(lán)（亞甲藍(lán)）染液對(duì)酵母菌染色，活的酵母細(xì)胞呈無色，死的或代謝衰弱的酵母細(xì)胞呈藍(lán)色。