楊秀芹，張 倩，李佳欣，郝婉君，張曉涵，何鑫淼，龐 宇

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱 150086）

嵌合RNAs（chimeric RNAs）是指由兩個或兩個以上獨立基因融合產(chǎn)生的新RNAs。這種嵌合RNA常常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前，已發(fā)現(xiàn)大量腫瘤特有嵌合RNA，其中一些嵌合RNA 可作為腫瘤診斷和預(yù)后標(biāo)記物[1]。隨著高通量測序技術(shù)發(fā)展，越來越多研究表明，正常生理條件下也存在嵌合RNA，其廣泛參與各項生命活動，在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞活力和生長等方面發(fā)揮重要作用[2-3]。

相鄰基因間順式剪接（cis-splicing of adjacent genes，cis-SAGe）是在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上產(chǎn)生嵌合RNA 的主要方式之一。cis-SAGe 是同一條染色體上兩個相鄰基因間發(fā)生轉(zhuǎn)錄通讀，再通過內(nèi)含子剪接將不同基因外顯子連接成一個嵌合RNA 過程[4]。內(nèi)含子剪接是真核生物基因表達(dá)調(diào)控重要手段，cis-SAGe 和經(jīng)典內(nèi)含子剪接機(jī)制相同，均由剪接位點（Splice sites，SS）、小分子核糖核蛋白等共同參與完成。剪接時，在剪接增強(qiáng)子、沉默子等剪接調(diào)控元件（Splicing regulatorycis-elements，SRE）調(diào)控下，pre-mRNA 上 SSs 與小分子核糖核蛋白共同裝配成RNA 剪接復(fù)合體，形成套索結(jié)構(gòu)，切除內(nèi)含子，將外顯子連接[5]。根據(jù)SRE 相對位置和作用，可分為外顯子剪接增強(qiáng)子（Exonic splicing enhancer，ESE）、內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子（Intronic splicing enhancer，ISE）、外顯子剪接沉默子（Exonic splicing silencer，ESS）及內(nèi)含子剪接沉默子（Intronic splicing silencer，ISS）。這些順式作用元件通過招募剪接因子影響剪接位點選擇，調(diào)控剪接過程。目前有關(guān)cis-SAGe 剪接調(diào)控機(jī)制研究較少，親本基因外顯子被剪接的決定因素尚不清楚。

B-細(xì)胞淋巴瘤因子2 樣蛋白2（B-cell lymphoma 2-like 2 protein，BCL2L2）是細(xì)胞凋亡重要調(diào)控因子，抑制線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，增強(qiáng)細(xì)胞運動性、促進(jìn)神經(jīng)元存活和分化[6-7]。核多聚腺苷酸結(jié)合蛋白1（poly（A）binding protein nuclear 1，PABPN1）是一種普遍存在的多聚腺苷酸化因子，對真核細(xì)胞多聚（A）尾延伸至關(guān)重要[8-9]。

本實驗室前期在豬脂肪組織中鑒定一個cis-SAGe產(chǎn)物——BCL2L2-PABPN1（BP）[10]。為進(jìn)一步分析嵌合子BP 剪接調(diào)控機(jī)制，試驗利用minigene、半定量RT-PCR技術(shù)、結(jié)合生物信息學(xué)分析鑒定影響嵌合子生成的SRE；同時比較分析BP 和親本基因組織表達(dá)和亞細(xì)胞定位情況，研究結(jié)果進(jìn)一步揭示BP轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制，為探究BP功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)本實驗室克隆的BP cDNA 序列（GenBank No.MH795109）及其Blat（http://genome.ucsc.edu/cgibin/hgBlat）分析結(jié)果，設(shè)計引物M1F/R 和M2F/R，分別用于擴(kuò)增豬 BCL2L2 外顯子 3～4 和 PABPN1 外顯子 1～2 基因組 DNA 片段，在 M1R 和 M2F 引物 5'末端引入限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ識別位點。同時設(shè)計引物用于對BCL2L2 內(nèi)含子3 的5'端、3'端及PABPN1 外顯子4 的5'端序列進(jìn)行缺失突變。此外，設(shè)計引物MAR 與T7F 引物配合使用，對minigene轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行半定量RT-PCR 鑒定。本研究中所有引物均使用Primer premier 5.0 軟件自行設(shè)計，由北京華大基因科技有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.2 核酸提取

民豬耳組織樣采自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，利用常規(guī)酚-氯仿法提取基因組DNA。利用 TRIzol（Invitrogen，CA，USA）提取細(xì)胞總RNA，嚴(yán)格按照說明書操作。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸質(zhì)量及完整性，利用Nanodrop 2000（IMPLEN，CA，USA）測量核酸濃度。

1.3 半定量RT-PCR

利用 Vazyme 公司（Nanjing，China）HiScript II Q Select RT SuperMix for qPCR 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（Reverse transcription，RT）反應(yīng)，合成cDNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。PCR 反應(yīng)總體系為10 μL，含有2×TaqMaster Mix 5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各 0.4 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 3.7 μL。目的基因和內(nèi)參退火溫度分別為56 和60 ℃，循環(huán)數(shù)均為24個。

1.4 minigene構(gòu)建

以基因組DNA 為模板，分別利用引物M1F/R和M2F/R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，通過EcoRⅠ（TaKaRa）酶切位點連接，克隆入pMD18-T 載體（TaKaRa）中，測序驗證。構(gòu)建的克隆載體和pcDNA3.1+分別用KpnⅠ和XbaⅠ（TaKaRa）雙酶切后，利用T4DNA連接酶（Ta-KaRa）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，陽性菌落經(jīng)菌液PCR 初篩后，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定后測序驗證。在此步驟中，PCR 反應(yīng)利用2×TaqMaster Mix進(jìn)行催化，酶切和連接反應(yīng)均嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書操作。

1.5 缺失突變

利用重疊延伸PCR方法對minigene上片段進(jìn)行缺失突變[11]。該方法由兩輪PCR反應(yīng)組成，第一輪反應(yīng)（反應(yīng)a 和b）通過引物設(shè)計在兩個小片段末端引入缺失，再通過PCR 反應(yīng)（反應(yīng)c）將兩個片段拼接，將缺失引入到擴(kuò)增產(chǎn)物內(nèi)部。各缺失片段引物見表1，缺失突變反應(yīng)方案見表2。在反應(yīng)a和b 利用高保真DNA 聚合酶催化，反應(yīng)總體系為25 μL，含有 2×Phanta Max Master Mix（Vazyme）12.5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，野生型 minigene 質(zhì)粒 DNA 25 ng。反應(yīng) c 利用 2×TaqMaster Mix 進(jìn)行催化，以便在擴(kuò)增產(chǎn)物末端引入A，方便后續(xù)T-A 克隆，模板為反應(yīng)a 和b 擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋物。

表2 重疊延伸PCR中引物配對使用方案Table 2 Pairing scheme of primers in overlapped-extension PCR

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

豬腎上皮細(xì)胞PK-15 按照常規(guī)方法培養(yǎng)，在細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時，利用Lipofectamine 2000TM試劑（Invitrogen，CA，USA）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，嚴(yán)格按照試劑說明書操作。24 h后收集細(xì)胞。

1.7 剪接元件鑒定

RT-PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析，分析缺失突變對minigene轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量的影響。利用在線工具regRNA2.0（http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/）鑒定潛在的剪接元件。

1.8 實時熒光定量PCR

利用實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）方法分析BP、BCL2L2 和 PABPN1 在不同發(fā)育時期脂肪組織中表達(dá)情況，模板cDNA合成方法見1.3，qPCR 反應(yīng)利用Vazyme 公司AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix進(jìn)行，嚴(yán)格按照該試劑盒說明書操作。以β-actin 作為內(nèi)參，利用2-ΔΔCt方法計算目標(biāo)基因相對表達(dá)量。

1.9 亞細(xì)胞定位

將BP、BCL2L2 和PABPN1 基因全長編碼區(qū)分別克隆入pEGFP-N1載體，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒。其中BP 插入到HindⅢ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶識別位點間，BCL2L2 和PABPN1 利用EcoRⅠ和KpnⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行克隆。上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15 細(xì)胞，24 h 后收集細(xì)胞，利用DAPI 染色，在熒光顯微鏡（Zeiss Axiovert 200 M）下觀察重組熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)分布情況，拍照。

1.10 統(tǒng)計分析

利用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，通過t檢驗分析野生型對照組和片段缺失組差異顯著性。各試驗均獨立重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 minigene構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物驗證

BP 兩個親本基因——BCL2L2 和 PABPN1 分別含有4 個和7 個外顯子，串聯(lián)排列于豬7 號染色體上，中間間隔小于10 kb。BP通過cis-SAGe典型方式剪接形成：除BCL2L2 最后一個外顯子和PABPN1第一個外顯子外，兩個親本基因其他外顯子均完整保留于BP[10]。為鑒定BP 剪接的影響因子，本研究選取BCL2L2外顯子3和PABPN1外顯子2之間部分基因組序列，構(gòu)建豬嵌合RNA BP 的minigene（見圖1）。根據(jù)理論推測，minigene BP應(yīng)有兩種順式剪接產(chǎn)物：嵌合RNA（產(chǎn)物A）以及正常、包含所有外顯子產(chǎn)物（產(chǎn)物B）。minigene 轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后，經(jīng)RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，兩種預(yù)期產(chǎn)物均存在（見圖2），測序分析證明RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)正確性。說明minigene可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生兩種成熟mRNA，用于后續(xù)剪接調(diào)控分析。

圖1 minigene結(jié)構(gòu)及預(yù)期產(chǎn)物Fig.1 Schematic structure and the theoretical products of minigene

圖2 minigene轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物鑒定Fig.2 Identification of the splicing products of minigene

2.2 內(nèi)含子3的3'末端剪接調(diào)控元件鑒定

首先對內(nèi)含子3的3'端進(jìn)行片段缺失分析，并結(jié)合生物信息學(xué)方法鑒定重要剪接調(diào)控元件。共構(gòu)建3 個缺失突變型minigene，瞬時轉(zhuǎn)染、RTPCR 分析發(fā)現(xiàn)，片段A 缺失導(dǎo)致嵌合分子表達(dá)量極顯著下降（P＜0.01），片段C 缺失導(dǎo)致嵌合分子表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），片段B 缺失不影響嵌合分子表達(dá)（P＞0.05），如圖3所示。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，缺失片段A 和C 上均存在thyroid hormone receptor exon 9 和 gh-1 intron 3 等 反 應(yīng) 元 件 ，詳見表3。

表3 生物信息學(xué)預(yù)測的剪接增強(qiáng)子Table 3 Splicing enhancer predicted by bioinformatic method

圖3 內(nèi)含子3的3'端缺失對嵌合子生成的影響Fig.3 Effects of deletion in 3'end of intron 3 on the production of chimeric RNA

2.3 內(nèi)含子3的5'端剪接調(diào)控元件鑒定

在內(nèi)含子3 的5'末端，片段1 缺失導(dǎo)致嵌合分子表達(dá)量極顯著下降（P＜0.01），片段2缺失導(dǎo)致嵌合分子表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），片段3缺失不影響嵌合分子表達(dá)（P＞0.05），如圖4所示。在缺失的片段1 和2 上均預(yù)測到多個內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子元件，且二者不存在共同元件，詳見表3。

圖4 內(nèi)含子3的5'端缺失對嵌合子生成的影響Fig.4 Effects of deletion in 5'end of intron 3 on the production of chimeric RNA

2.4 外顯子4剪接調(diào)控元件鑒定

在BCL2L2外顯子4上研究發(fā)現(xiàn)，片段A或B缺失均導(dǎo)致嵌合分子表達(dá)量極顯著下降（P＜0.01），片段C缺失導(dǎo)致嵌合分子表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這三個缺失片段只存在一種外顯子剪接增強(qiáng)子——srp40-exonic splicing enhancer，詳見表3。

2.5 組織表達(dá)分析

RT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)BP 普遍表達(dá)于所檢測的各種組織中（見圖6A）。qPCR分析表明，在不同發(fā)育時期脂肪組織中，BP 表達(dá)模式和兩個親本略有不同（見圖6B），隨日齡增加，BP 表達(dá)量逐漸上升，在180日齡時達(dá)到最高，之后略有下降。

圖6 BP組織表達(dá)（A）及在脂肪組織中發(fā)育性表達(dá)（B）分析Fig.6 Expression of BP in tissues(A)and in developmental fat tissues(B)

2.6 亞細(xì)胞定位分析

BP和親本的亞細(xì)胞定位結(jié)果如圖7所示。

由圖7 可知，BCL2L2 在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，BP 和PABPN1 則主要在細(xì)胞核中表達(dá)。亞細(xì)胞定位是基因功能基礎(chǔ)，由此推測BP 在功能上可能更接近于PABPN1。

圖7 BP和親本亞細(xì)胞定位結(jié)果Fig.7 Subcellular localization of BP and the parent genes

圖5 外顯子4片段缺失對嵌合子生成的影響Fig.5 Effects of deletion in exon 4 on the production of chimeric RNA

3 討 論

cis-SAGe包括兩個連續(xù)反應(yīng)：轉(zhuǎn)錄通讀和剪接加工。目前在轉(zhuǎn)錄通讀調(diào)控機(jī)制方面研究較多，已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子CTCF、poly（A）信號等因素影響轉(zhuǎn)錄通讀[12-13]。與親本基因序列組成的比對分析發(fā)現(xiàn)，cis-SAGe在轉(zhuǎn)錄后剪接加工過程中，去掉兩個親本間臨近外顯子，典型方式為5'親本的最后一個外顯子和3'親本的第一個外顯子作為內(nèi)含子被剪接掉[14-16]，剪接機(jī)制與經(jīng)典剪接一致，這些外顯子發(fā)生跳躍（Exon skipping）的原因尚不清楚。

Minigene是研究基因表達(dá)調(diào)控的有力工具，用于分析突變對基因表達(dá)的影響、鑒定可變剪接轉(zhuǎn)錄本和順式調(diào)控元件、揭示不同細(xì)胞內(nèi)剪接差異及機(jī)制[17-18]。Minigene 正確表達(dá)關(guān)鍵是含有SSs，SSs 位于內(nèi)含子上，包括5'末端的GU、3'末端的AG 和位于 3'SSs 上游 18～40 nt 的分支點。SSs 突變常常導(dǎo)致錯誤剪接，在成熟mRNA中出現(xiàn)序列缺失或增加[19]。對于一些較大內(nèi)含子，可截取其3'和5'末端部分序列參與構(gòu)建minigene，降低minigene 長度，提高轉(zhuǎn)染效率。本研究中參與剪接形成嵌合子的兩個內(nèi)含子均較小，故將所有堿基全部用于構(gòu)建minigene，完整保留SSs；且在構(gòu)建各缺失突變體時，均保留內(nèi)含子3'末端的60 bp 和5'末端的10 bp，確保剪接信號不受片段缺失影響，保證minigene 轉(zhuǎn)錄后剪接順利進(jìn)行。與理論預(yù)期一致，minigene轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生外顯子跳躍和包含所有外顯子的兩種剪接產(chǎn)物。本研究重點是鑒定影響嵌合子形成的順式作用元件，所以僅對發(fā)生外顯子跳躍的mRNA（即嵌合RNA）表達(dá)情況進(jìn)行研究，鑒定有潛在作用的反應(yīng)元件。

ISE 有助于小外顯子進(jìn)行高效剪接[20]；ESE 位于外顯子上，但影響剪接位點正確選擇、使用[21]。在BP 剪接生成過程中，BCL2L2 內(nèi)含子3 和PABPN1內(nèi)含子1及二者之間序列被作為一個大的內(nèi)含子剪接掉，這個大內(nèi)含子的5'和3'末端提供SSs，同時原有剪接信號被忽視。為確定引起這些變化的因素，本研究分析BCL2L2 內(nèi)含子3 和外顯子4上剪接調(diào)控元件，鑒定BP 表達(dá)影響因子，發(fā)現(xiàn)srp40-exonic splicing enhancer、thyroid hormone receptor exon 9、gh-1 intron 3、β-tropomyosin exon 6b等元件可能在嵌合子表達(dá)剪接調(diào)控中發(fā)揮作用。Srp40 蛋白結(jié)合位點調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后剪接過程，直接影響剪接能否正常進(jìn)行[22]，ASB10基因上該位點突變導(dǎo)致原有剪接位點不被識別，生成新的成熟mRNA[23]，在外顯子4 的3 個缺失片段上均僅預(yù)測到srp40-exonic splicing enhancer 反應(yīng)元件，其對嵌合子生成的影響，值得進(jìn)一步研究。gh-1 intron 3最早發(fā)現(xiàn)于人生長激素-1（Growth hormone-1，GH-1）基因內(nèi)含子3 上，核心序列為G2X1-4G3，該序列突變導(dǎo)致GH-1 基因剪接時發(fā)生外顯子3 跳躍，生成截短蛋白質(zhì)多肽鏈，影響正常蛋白質(zhì)分泌[24]。人GH-1 研究表明，gh-1 intron 3 不存在累加效應(yīng)，與其他ISE 序列不同[24]。多數(shù)ISE 均是以多拷貝形式存在并調(diào)控可變剪接轉(zhuǎn)錄本表達(dá)時具有累加效應(yīng)，如雞β-tropomyosin 內(nèi)含子 7、人α-globin 內(nèi)含子2上鑒定到的ISE序列[25-26]。本研究在缺失片段A和C 中均檢測到gh-1 intron 3，其作用方式及是否具有累加作用，還需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

本試驗利用半定量RT-PCR、生物信息學(xué)分析及定點突變技術(shù)鑒定影響嵌合RNA BP剪接生成的調(diào)控元件，發(fā)現(xiàn)srp40-exonic splicing enhancer、thyroid hormone receptor exon 9、gh-1 intron 3、βtropomyosin exon 6b等元件具有重要作用，且BP在組織中普遍表達(dá)且受發(fā)育調(diào)控，通過亞細(xì)胞定位分析確定BP 與親本PABPN1 均定位在細(xì)胞核內(nèi)，推測二者可能在功能上更接近，為深入分析BP 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制提供參考。